WWW.KNIGA.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Книги, пособия, учебники, издания, публикации

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

«Учебный курс Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции и СПИД-ассоциированных инфекций Практическое руководство для врачей-лаборантов, работающих в лабораториях ИФА и ...»

-- [ Страница 1 ] --

РЕГИОНАЛЬНЫЙ ОБУЧАЮЩИЙ ЦЕНТР

ПО ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОМУ НАДЗОРУ ЗА ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙ

В ЦЕНТРАЛЬНОЙ АЗИИ

Учебный курс

«Лабораторная диагностика

ВИЧ-инфекции

и СПИД-ассоциированных

инфекций»

Практическое руководство для врачей-лаборантов, работающих в

лабораториях ИФА и диагностики ВИЧ/СПИД Кыргызской Республики

Кыргызстан 2010 г.

СОДЕРЖАНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ

Авторы 3 Список сокращений 4 РАЗДЕЛ 1. Этиология, патогенез ВИЧ инфекции РАЗДЕЛ 2. ИФА и ПЦР лаборатории Глава 1. Общие положения Глава 2. Требования к организации работы ИФА лабораторий Глава 3. Требования к организации работы ПЦР лабораторий РАЗДЕЛ 3. Принципы лабораторной диагностики РАЗДЕЛ 4. Диагностика ВИЧ инфекции РАЗДЕЛ 5. Организация обследования донорской крови РАЗДЕЛ 6. Организация системы качества в лабораториях Глава 1. Обеспечение качества Глава 2. Контроль качества Глава 3. Внутрилабораторный контроль качества ИФА Глава 4. Внутрилабораторный контроль качества ПЦР РАЗДЕЛ 7. Диагностика оппуртонистических вирусных инфекций РАЗДЕЛ 8. Принципы метода капиллярной сухой капли и его место в системе ДЭН РАЗДЕЛ 9 Биобезопасность Глоссарий Список литературы

АВТОРЫ

АВТОРЫ

Издание подготовили специалисты Министерства здравоохранения Республики Узбекистан и Республики Казахстан Общее руководство профессор, д.м.н. Мусабаев Эркин Исакович Глава «Этиология, патогенез ВИЧ инфекции»

профессор, д.м.н. Мусабаев Эркин Исакович Глава «Организация работы ИФА и ПЦР лабораторий»

к.м.н. Алиева Лариса Евгеньевна Глава «Принципы лабораторной диагностики»

к.м.н. Ковтуненко Наталья Григорьевна Глава «Диагностика ВИЧ инфекции»

Кан Наталия Георгиевна Глава «Система качества в лабораториях»

Онгарбаев Азат Бабаджанович Глава «Диагностика оппортунистических СПИД-ассоциированных вирусных инфекций»

профессор, д.м.н. Мусабаев Эркин Исакович Глава «Принципы метода сухой капли капиллярной крови и его место в работе ИФА и ПЦР лабораторий»

Кан Наталия Георгиевна Глава «Биобезопасность»

Латыпов Ренат Рафаелович Практическое руководство для лабораторных специалистов Кыргызской Республики адаптировано к работе по проведению лабораторной диагностики ВИЧ и ВИЧ индикаторных заболеваний.

Руководитель лабораторной службы «СПИД» МЗ КР, Бейшеева Н.Ж.

Врач-лаборант РО «СПИД» МЗ КР, Момушова К.Т.

Врач-лаборант Ошского ОЦПБС, Пак Л.А.

Зав. лабораторий РЦК МЗ КР, Раманкулова Ж.С.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВОЗ Всемирная Организация Здравоохранения МЗ КР Министерство Здравоохранения Кыргызской Республики РО «СПИД» Республиканское Объединение СПИД ЛДС Лаборатории диагностики СПИД ИФА Иммуноферментный анализ ПЦР Полимеразная цепная реакция ВИЧ Вирус иммунодефицита человека СПИД Синдром приобретенного иммунодефицита СОП Стандартная операционная процедура ИППП Инфекции передающиеся половым путем ПИН Потребители инъекционных наркотиков МСМ Мужчины, вступающие в половые связи с мужчинами РКС Работники коммерческого секса ВКО Внутренний контрольный образец РНК Рибозонуклеиновая кислота ДНК Дезоксинуклеиновая кислота РЦК Республиканский Центр Крови ГИФА Гибридизационный Иммуноферментный анализ ТМБ Тетраметилбензидин ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота ЦНС Центральная нервная система РАЗДЕЛ Этиология и патогенез ВИЧ инфекции

СОДЕРЖАНИЕ

I. Лекция. Эпидемическая ситуация по ВИЧ-инфекции в Центральной Азии.

Цель занятия: дать информацию об эпидемиологической ситуации в мире и странах Центральной Азии.

Задачи: по окончании занятия участники должны быть информированы об эпидемиологической ситуации в мире и странах Центральной Азии.

РАЗДЕЛ 1.

Этиология и патогенез ВИЧ инфекции 1. Структура ВИЧ ВИЧ относится к подсемейству лентивирусов семейства ретровирусов. Для лентивирусных инфекций характерно хроническое течение с длительным периодом, персистирующей репликацией вируса и поражением центральной нервной системы (ЦНС). Типичными примерами возбудителей лентивирусных инфекций служат вирус висны, вызывающий заболевание у овец, вирус иммунодефицита обезьян (SIV или ВИО) и вирус иммунодефицита кошек (FIV или ВИК).

С помощью электронной микроскопии было обнаружено, что ВИЧ-1 и ВИЧочень похожи по структуре. В то же время белки этих вирусов отличаются по молекулярному весу; кроме того, найдены различия в структуре вспомогательных генов. Филогенетически ВИЧ-2 ближе к обнаруженному у дымчатых мангобеев (Cercocebus atys) вирусу иммунодефицита обезьян (SIVsm), чем к ВИЧ-1. Предполагается, что ВИЧ-2 перешел к человеку от обезьян. Репликация как ВИЧ-1, так и ВИЧ-2 происходит в лимфоцитах CD4; оба вируса патогенны, хотя ВИЧ-2 инфекция, как правило, протекает легче.

1.1 Морфология ВИЧ Диаметр вириона ВИЧ-1 составляет 100 нм. Снаружи вирион окружен липидной мембраной, содержащей 72 гликопротеиновых комплекса, каждый из которых образован тремя молекулами трансмембранного гликопротеина (gp41), служащими «якорем» комплекса, и тремя молекулами поверхностного гликопротеина (gp120).

Силы, связывания между gp120 и gp41 довольно слабые, поэтому поверхностный гликопротеин может спонтанно отсоединяться от вирусной частицы. По этой причине gp120 обнаруживается в сыворотке крови и лимфатической ткани ВИЧинфицированных. Как будет описано ниже – это является важным патогенетическим моментом ВИЧ, запускающим самогибель клеток иммунной системы посредством апоптоза. В результате отпочковывания вириона от клетки в его липопротеиновую оболочку попадают белки клеточной мембраны, в том числе антигены HLA классов I и II и молекулы адгезии, в частности ICAM-1, которые облегчают процесс адгезии вируса к новой клетке-мишени. Изнутри липопротеиновая оболочка выстлана матриксным белком p17. В капсиде, состоящем из белка p24, заключены две копии РНК ВИЧ-1. Каждая нить РНК ВИЧ входит в состав белково-нуклеинового комплекса, состоящего из нуклеопротеина p7 и фермента обратной транскриптазы p66 (ОТ). Вирусная частица содержит все необходимые ферменты для репликации: обратную транскриптазу (p66), интегразу (p32) и протеазу (p11) (Gelderbloom, 1993) (рис.1).





1.2 Организация генома ВИЧ Процесс репликации большинства ретровирусов определяется тремя генами: gag, pol и env: «gag» означает «group-antigen» (групповой антиген), «pol» – сокращение от «polymerase» (полимераза), а «env» означает «envelope» (внешняя оболочка) (Wong-Staal, 1991) (рис.3.2.).

Рисунок 1.Схема строения ВИЧ Классическая схема структуры генома ретровирусов записывается как 5‘LTR-gag-pol-env-LTR3’. На обоих концах каждой молекулы РНК есть длинные концевые повторы (LTR, long terminal repeats), которые обеспечивают интеграцию в геном клетки-мишени и не кодируют вирусные белки. Гены gag и env кодируют белки капсида и внешней оболочки, ген pol – обратную транскриптазу и другие ферменты. Кроме того, геном ВИЧ-1, состоящий из приблизительно 9000 пар нуклеотидов, содержит еще шесть генов – vif, vpu, vpr, tat, rev и nef, что увеличивает сложность строения его генома. Гены nef, vif, vpr и vpu раньше называли вспомогательными, поскольку репликация вируса in vitro ввозможна и без их участия. Однако, за последние годы механизмы регуляции и функциональные роли этих генов и кодируемых ими белков стали более понятны. Установлено, что продукты генов nef, tat и rev синтезируются уже на ранней стадии репликации ВИЧ.

Регуляторные белки Tat и Rev накапливаются в ядре и связываются с определенными участками вирусной РНК: первый с трансактивируемыми регуляторными элементами (transactivation-response elements, TAR) на участке длинных концевых повторов, а второй – с Rev-чувствительными регуляторными элементами (rev response elements, RRE) в области гена env. Белок Tat активирует транскрипцию промоторной области длинных концевых повторов (LTR) и необходим для репликации вируса in vitro почти во всех культурах клеток. Он нуждается в клеточном кофакторе – циклине Т1. Белки Tat и Rev стимулируют транскрипцию провирусной РАЗДЕЛ 1.

Этиология и патогенез ВИЧ инфекции ДНК ВИЧ-1 в РНК, обеспечивают элонгацию РНК и транспорт РНК из ядра в цитоплазму, а также необходимы для процесса трансляции. Белок Rev обеспечивает также транспорт компонентов вируса из ядра и переключает процесс белкового синтеза с образования регуляторных белков на образование структурных белков.

Белок Nef выполняет несколько функций. Он подавляет экспрессию рецепторов CD4 и антигенов HLA класса I на поверхности ВИЧ-1-инфицированных клеток, и тем самым позволяет вирусу уклоняться от атаки цитотоксических Т-лимфоцитов CD8 и от распознавания лимфоцитами CD4. Белок Nef может также угнетать активацию Т-лимфоцитов, связываясь с различными белками, участвующими в процессе внутриклеточной передачи сигнала (подробнее см. в публикации Peter, 1998).

У инфицированных вирусом иммунодефицита обезьян макак-резусов активная репликация вируса и прогрессирование болезни возможны только при условии интактности гена nef. Делеции гена nef были обнаружены в штаммах ВИЧ-1, выделенных от группы австралийцев с длительным непрогрессирующим течением инфекции. Однако, у некоторых из них со временем появились признаки прогрессирования инфекции, в том числе снижение числа лимфоцитов CD4. Таким образом, хотя делеции гена nef и могут замедлять репликацию вируса, их наличие не гарантирует защиту от наступления стадии СПИДа.

Белок Vpr, по-видимому, необходим для репликации вируса в непролиферирующих клетках, например, макрофагах. Этот белок наряду с другими клеточными и вирусными промоторами активирует длинные концевые повторы (LTR) генома ВИЧ. Недавно было установлено, что белок Vpr играет важную роль в переносе провируса в ядро и способен блокировать жизненный цикл клетки в фазе G2.

Белок Vpu играет важную роль в процессе отпочковывания вируса из клетки, поскольку мутации гена vpu приводят накоплению вирусных частиц у поверхности клетки. Молекулы клеточной мембраны, такие как тезерин (CD317), способны связываться с вирионами ВИЧ-1 с дефектным геном vpu, препятствуя высвобождению вируса. Поэтому можно рассматривать ген vpu и белок Vpu как важнейшие звенья механизма высвобождения вируса из клетки и искать возможности блокировать их действие. Белок Vpu участвует также в разрушении комплексов CD4-gp160 в эндоплазматическом ретикулуме, позволяя тем самым gp160 включаться в формирование новых вирионов.

Согласно последним публикациям белок Vif играет важную роль в процессе репликации вируса. Штаммы ВИЧ-1 без гена vif не способны реплицироваться в лимфоцитах CD4, некоторых линиях Т-лимфоцитов («недоступных клетках») и макрофагах. Такие штаммы способны проникать в клетки-мишени и начинать обратную транскрипцию, однако синтез провирусной ДНК остается незавершенным.

In vitro слияние «доступных» и «недоступных» клеток приводит к «недоступному»

фенотипу; это наблюдение позволило предположить, что репликация ВИЧ зависит от наличия или отсутствия некоего клеточного ингибитора. Этот эндогенный ингибирующий фактор был выявлен и получил название «APOBEC3G». APOBEC3G (apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide-like 3G [полипептид типа 3G, каталитический фермент, корректирующий мРНК аполипопротеина В]) принадлежит к семейству внутриклеточных ферментов, превращающих цитозин в урацил в составе мРНК или ДНК путем деаминирования, что приводит к накоплению мутаций гуанин/аденозин и распаду провирусной ДНК. Образуя комплекс с APOBEC3G, белок Vif блокирует ингибиторную активность APOBEC3G 2. Проникновение ВИЧ в клетку 2.1. CD4 – основной клеточный рецептор для ВИЧ Рецептор CD4 представляет собой мономерный гликопротеин массой кДа, который обнаруживается на поверхности примерно 60% Т-лимфоцитов, на поверхности клеток-предшественников Т-лимфоцитов, находящихся в костном мозге и тимусе, а также на поверхности моноцитов, макрофагов, эозинофилов, дендритных клеток и клеток микроглии ЦНС. Внеклеточный участок рецептора CD на Т-лимфоцитах состоит из 370 аминокислот; гидрофобный трансмембранный домен состоит из 25 аминокислот, а внутриклеточный участок – из 38 аминокислот.

Внеклеточный участок содержит четыре иммуноглобулиноподобных домена D1D4 и область V2 (аминокислоты 40-55), играющую важную роль в присоединении gp120 к CD4. Эта область перекрывается с участком связывания молекул HLA класса II, которые являются естественными лигандами рецептора CD4.

Идентификация участка связывания gp120 на рецепторе CD4 подтолкнула к попыткам использования свободных молекул CD4 (sCD4) для нейтрализации циркулирующего вируса и предотвращения заражения новых клеток. Однако, эти попытки не увенчались успехом; несмотря на то, что лабораторные штаммы вируса легко нейтрализовались sCD4, нейтрализации штаммов, выделенных непосредственно от больных, добиться не удалось.

Более того, оказалось, что sCD4 способны вызывать конформационные изменения внешней оболочки вируса, которые облегчали заражение клеток-мишеней.

Молекулы CD4 соединены с Т-клеточным антигенраспознающим рецепторным комплексом (Т-cell receptor, TCR) на поверхности Т-лимфоцитов и связываются с молекулами HLA класса II на поверхности антигенпредставляющих клеток (АПК).

Связывание gp120 с CD4 не только служит ключевым моментом в проникновении вируса в клетку, но также нарушает внутриклеточную передачу сигнала и стимулирует апоптоз лимфоцитов CD4. В последние годы возобновился интерес к идее блокирования рецептора CD4 как основного клеточного рецептора для ВИЧ.

PRO542 представляет собой полученный генно-инженерными методами тетравалентный белок слияния CD4-IgG2, который не только подавляет репликацию вируса in vitro, но и продемонстрировал впечатляющую противовирусную активность у пациентов с высокой вирусной нагрузкой в первых клинических испытаниях (см.

главу 6 «АРТ в 2009 году»). О том, что молекула CD4 является основным и незаменимым клеточным рецептором для связывания ВИЧ-1, ВИЧ-2 и вируса иммунодефиРАЗДЕЛ 1.

Этиология и патогенез ВИЧ инфекции цита обезьян, стало известно уже в 1984 году.

Однако, позже с помощью экспериментов, в которых выполнялась трансфекция человеческого гена CD4 в клеточные линии животных было установлено, что для проникновения ВИЧ в клетку наличия только человеческого рецептора CD4 на ее поверхности недостаточно. Был сделан вывод о существовании на человеческих клетках дополнительных рецепторов – корецепторов, необходимых для проникновения ВИЧ. С другой стороны, было обнаружено, что некоторые лабораторные штаммы ВИЧ-1, а также штаммы ВИЧ-2 и вируса иммунодефицита обезьян могут проникать в клетки, лишенные молекул CD4. Примечательно, что моноклональные антитела к конформационно измененным в результате взаимодействия с рецепторам CD4 эпитопам gp120 связываются также с gp120 CD4-независимых штаммов вирусов. Это позволило предположить, что у gp120 CD4-независимых штаммов уже есть области, необходимые для распознавания корецепторов и связывания с ними, поэтому связывание с рецептором CD4 для проникновения этих штаммов в клетку не обязательно. CD4независимые штаммы легко нейтрализуются сывороткой ВИЧ-инфицированных, поэтому можно сделать вывод о том, что иммунный ответ препятствует размножению этих штаммов, обеспечивая селективный отбор.

2.2. События после проникновения вируса в клетку После слияния наружной оболочки вируса с клеточной мембраной вирусное ядро высвобождается в цитоплазму клетки-мишени. Недавно были получены новые сведения о том, как происходят эти «ранние события». ВИЧ способен проникать в лимфоциты макак-резусов, но до начала процесса обратной транскрипции или вскоре после него репликация вируса прекращается. Эта внутриклеточная блокада опосредована клеточным фактором TRIM5, который является компонентом цитоплазматических телец, чья основная функция пока не установлена. Молекулы TRIM5, выделенные от животных разных видов, проявляют определенную специфичность в отношении взаимодействия с ретровирусами. Например, TRIM5, макак-резусов (TRIM5 rh) сильнее подавляет репликацию ВИЧ, чем TRIM5 человека, в то время как вирус иммунодефицита обезьян, который в естественных условиях патогенен для низших узконосых обезьян (Cercopithecidae), менее чувствителен к любым формам TRIM5, чем ВИЧ. Отчасти это объясняет видовую специфичность ВИЧ к клеткам человека (Stremlau 2004). TRIM5 клеток человека и других приматов способен подавлять репликацию других лентивирусов и представляет собой недавно открытый фактор клеточной защиты, биологическое значение которого до конца не ясно. Пока не установлено, как именно TRIM5 блокирует обратную транскрипцию; предполагается, что TRIM5 взаимодействует с капсидным белком проникающего в клетку вируса, присоединяя к нему «метки» из мономеров убиквитина для последующего направленного разрушения протеазами.

Проникновение ВИЧ в покоящиеся Т-лимфоциты происходит таким же образом, как проникновение в активированные Т-лимфоциты, однако в покоящихся клетках не завершается синтез провирусной ДНК (Zack, 1990). Синтез провирусной ДНК на матрице вирусной РНК в цитоплазме клетки под действием фермента обратной транскриптазы – это ключевой момент процесса репликации ВИЧ (рис. 2.).

Рисунок 2. Стадии проникновения вируса иммунодефицита человека в CD- клетки Блокирование обратной транскриптазы нуклеозидным ингибитором зидовудином было первой попыткой подавить размножение вируса у ВИЧ-1инфицированных. Начиная с середины 80-х годов арсенал препаратов, относящихся к ингибиторам обратной транскриптазы, значительно пополнился, и сегодня в клинической практике применяются нуклеозидные, нуклеотидные и ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы.

Обратная транскрипция происходит в несколько этапов. После связывания праймеров тРНК в участке PBS (primer binding site [участок связывания праймера]) начинается синтез минус-цепи провирусной ДНК, который завершается на 5’-концевом повторе с образованием короткой цепи ДНК R-U5. Следующий этап – расРАЗДЕЛ 1.

Этиология и патогенез ВИЧ инфекции щепление РНК выше участка PBS вирусным ферментом РНКазой Н и сдвиг рамки ДНК R-U5 с гибридизацией в области R-участка на 3’-концевом участке РНК. После этого завершается синтез полноразмерной провирусной ДНК с последующим расщеплением тРНК. В результате обратной транскрипции образуется двойная цепь ДНК ВИЧ с длинными концевыми повторами (LTR) на каждом конце.

В покоящихся Т-лимфоцитах образованная в результате обратной транскрипции провирусная ДНК не встраивается в геном клетки хозяина. Для того чтобы клеточная ДНК встроилась в ДНК клетки-хозяина, необходима активация клетки и перемещение вирусного преинтеграционного комплекса из цитоплазмы в ядро. In vitro активация клеток происходит, например, после стимуляции антигенами или митогенами, in vivo активация иммунной системы наблюдается после контакта с антигеном, вакцинации или на фоне оппортунистической инфекции. Кроме того, получены доказательства, что ВИЧ-1 способен самостоятельно активировать заражение клетки с помощью гликопротеина gp120 обеспечивая встраивание провирусной ДНК в клеточный геном. Помимо моноцитов, макрофагов и клеток микроглии, латентно инфицированные покоящиеся лимфоциты CD4, в цитоплазме которых содержится не встроенная в клеточный геном провирусная ДНК ВИЧ, представляют собой клеточные резервуары ВИЧ, в которых вирус сохраняется длительное время, а клеточные микроРНК способствуют сохранению вируса в латентном состоянии в покоящихся первичных лимфоцитах CD4 (Huang, 2007). Поскольку естественное течение ВИЧ-1-инфекции характеризуется постоянной репликацией вируса в активированных лимфоцитах CD4, пребывание вируса в латентном состоянии в покоящихся лимфоцитах CD4 скорее всего является случайным феноменом, не имеющим большого значения в патогенезе этой инфекции. Однако, этот небольшой резервуар латентного провируса приобретает особое значение с началом ВААРТ: антивирусные препараты не действуют на нереплицирующиеся провирусы, поэтому ВИЧ, сохраняющий способность размножению, продолжает персистировать в этих клетках и способен проявиться новым всплеском виремии при отмене препаратов. Именно существование этого резервуара латентного вируса не позволяет добиться полного устранения (элиминации) вируса у ВИЧ-инфицированных с помощью ВААРТ.

Лишь недавно стало ясно, почему ВИЧ плохо реплицируется в покоящихся лимфоцитах CD4. Клеточный белок Murr1, участвующий в метаболизме меди, способен подавлять репликацию ВИЧ-1 в нестимулированных лимфоцитах CD4. Белок Murr1 был обнаружен в первичных покоящихся лимфоцитах CD4, в которых он подавляет активацию фактора транскрипции NF-kB, блокируя деградацию ингибиторного белка IkB.. IkB препятствует перемещению NF-kB в ядро, особенно после цитокиновой стимуляции (например, воздействия ФНО). Поскольку область LTR ВИЧ содержат множество участков связывания NF-kB, предотвращение миграции NF-kB в ядро должно подавлять репликацию ВИЧ. Ингибирование Murr с помощью миРНК приводит к репликации ВИЧ в покоящихся лимфоцитах CD4.

Персистирование ВИЧ в покоящихся лимфоцитах CD4 и других клетках-резервуарах считается основной причиной невозможности полной элиминации вируса.

Если это в принципе достижимо, получение подробных сведений о том, как и когда появляются клеточные резервуары ВИЧ и как на них можно воздействовать, имеет первостепенное значение для разработки направлений лечения, нацеленных на полное устранение инфекции.

Клеточные факторы транскрипции, в частности NF-kB, также могут связываться с областью LTR ВИЧ. После стимуляции митогенами или цитокинами фактор NF-kB транслоцируется в ядро, где связывается с областью LTR ВИЧ, запуская транскрипцию вирусных генов. В результате транскрипции сначала синтезируется регуляторные вирусные белки, в частности Tat и Rev. В ядре клетки белок Tat связывается с трансактивируемым регуляторным элементом (transactivation-response element, TAR), расположенным в начале вирусной РНК, и стимулирует транскрипцию и образование длинных транскриптов РНК. Белок Rev стимулирует экспрессию генов, отвечающих за синтез структурных белков и ферментов, и подавляет продукцию регуляторных белков, тем самым обеспечивая образование зрелых вирусных частиц. Белки, кодируемые генами pol и gag, образуют вирусный капсид;

продукты гена env образуют поверхностный гликопротеин gp120 – «шипы» внешней оболочки вируса. Гликопротеин gp120 образуется в результате расщепления вирусной протеазой своего предшественника – гликопротеина gp160 – на gp и gp41. Продукты гена gag также образуются в результате расщепления протеазой ВИЧ белка-предшественника массой 53 кДа на белки p24, p17, p9 и p7. Поскольку расщепление молекул-предшественников протеазой ВИЧ – необходимое условие для образования новых полноценных вирусных частиц, этот фермент служит еще одной мишенью для антиретровирусной терапии. Сборка вирусов происходит поэтапно: из вирусной РНК, белков Gag и ферментов Pol образуется нуклеокапсид, который перемещается к клеточной мембране. Крупные молекулы-предшественники расщепляются вирусной протеазой, после чего завершается сборка зрелых вирусов и они отпочковываются от клетки. При отпочковывании в липидную оболочку вируса могут встраиваться различные белки клетки-хозяина, некоторые фосфолипиды и молекулы холестерина. В отличие от Т-лимфоцитов, в которых отпочковывание происходит на поверхности клеток и приводит к выделению вирусов в межклеточное пространство, в моноцитах и макрофагах процесс завершается накоплением вируса внутри клеточных вакуолей.

Репликация ретровирусов происходит с ошибками и характеризуется высокой частотой спонтанных мутаций. В среднем при обратной транскрипции происходит от 1 до 10 ошибок на один геном или на один цикл репликации. Мутации могут приводить к образованию вирионов со сниженной способностью к репликации. С другой стороны, могут появляться и накапливаться мутации, в результате которых вирус приобретает устойчивость к антивирусным препаратам. На фоне селективного воздействия антиретровирусных препаратов при условии неполного подавления репликации вируса в организме ВИЧ-инфицированного начинают преобладать вирусы, резистентные к препаратам.

Кроме того, для ВИЧ характерна высокая скорость репликации и большой РАЗДЕЛ 1.

Этиология и патогенез ВИЧ инфекции «оборот» вирусных частиц: в среднем за сутки образуется и погибает 1 миллиард вирусных частиц. Вследствие высокой скорости размножения вируса и большой мутации в организме ВИЧ-инфицированного накапливается множество близких вариантов вируса, так называемых «псевдовидов» или «квазивидов» (quаsispecies).

Преимущество в выживании получают псевдовиды, приобретшие в результате мутаций устойчивость не только к антиретровирусным препаратам, но и к факторам иммунной защиты, таким как нейтрализирующие антитела и цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ).

3. ВИЧ и иммунная система Особенностью вируса иммунодефицита человека является его уникальная способность уходить от иммунного ответа организма. Для этого у него есть целый ряд, по образному выражению Бобковой М.Р., молекулярных сувениров.

Антигенная вариабельность (изменчивость): постоянно возникают новые варианты вируса, что позволяет ему уходить от действия иммунитета и лекарственных препаратов.

Уникальность вируса заключается в том, что в организме больного могут одновременно циркулировать штаммы вируса, отличающиеся по генетической структуре до 30%.

Много это или мало мы можем судить, если сравним геном человека и шимпанзе, который отличается между собой всего на 5%. Постоянно образуются новые квазиовиды вируса.

Мутации затрагивают разные участки вирусных антигенов. Это может привести к нарушению связывания иммунными клетками вируса. В этом случае цитотоксический эффект не реализуется. Мутация возникает на уровне лизосом, где формируется пептидный спектр антигенов вирусов.

– Латентность: вирус способен контролировать экспрессию собственного генома с помощью регуляторных белков tat и rev.

Непрерывное и высокопродуктивное размножение ВИЧ происходит у всех инфицированных лиц, однако скорость размножение существенно различается (от 70 до 100 раз).

Среднее время полужизни ВИЧ-инфицированной клетки составляет 2,1 дня.

Ежедневно образуется 2,6 х 109 новых CD4+ клеток.

Схема патогенеза ВИЧ инфекции – это цепь непрерывно сменяющихся фаз заболевания, интенсивность проявления которых зависит от скорости размножения вируса.

Гениальной способностью ухода вируса от иммунного ответа является его способность длительно находится в латентном (спящем) состоянии.

Длительная персистенция вирусов (цитомегаловирус, другие вирусы группы герпеса) устанавливаются путем перехода инфекции в латентное, то есть обратимо непродуктивное состояние. В промежутках между циклами репликации такие вирусы имеют возможность спрятаться внутри хозяйских клеток не вызывая ни малейших подозрений у иммунной системы. Однако, если вирус герпеса, включив свой механизм латентности поддерживает очень низкий уровень продукции вирусных частиц, то ВИЧ ни в чем себя не ограничивает. В то время как часть вирусной популяции уходит в латентное состояние, другая продолжает размножаться на достаточно высоком уровне, что позволяет вирусу постоянно эволюционировать. Именно эта уникальная способность вируса сочетать столь несочетаемые свойства делает ВИЧ-инфекцию практически неизлечимой.

Наиболее хорошо охарактеризованный резервуар долгоживущих клеток у ВИЧ-инфицированных лиц – латентно инфицированные покоящиеся CD-4 клетки (клетки памяти), содержащие интегрированный геном вируса. Другими важными резервуарами ВИЧ являются макрофаги/моноциты.

Известно, однако, что покоящиеся Т-клетки ВИЧ практически не инфицирует. Первичной мишенью продуктивной ВИЧ инфекции является активированный CD-4 лимфоцит, а в покоящихся CD-4 клеткакх существует блок репликации.

В норме большинство Т лимфоцитов находится в состоянии покоя. Это клетки с низким уровнем метаболизма и уникальной морфологией, характеризующейся малым объемом цитоплазмы. Около половины этих клеток не встречались с антигеном, остальные являются клетками памяти, ранее имевшие с ним дело. После антигенной стимуляции происходит взрыв пролиферации и дифференциации, в результате которых появляются эффекторные клетки. Большинство из них умирает, но часть остается жить и возвращается в состояние покоя, чтобы в дальнейшем существовать под именем клеток памяти. Эти клетки и функционируют в дальнейшем в качестве резервуаров инфекции, сохраняя способность к продукции вируса после реактивации. ВИЧ нарушает этот стройный порядок. Вирус размножается преимущественно в активированных СD-4 клетках и уничтожает их в течении нескольких дней после инфекции. Поскольку эффекторным клеткам нужно несколько недель чтобы вернуться в состояние покоя, большинство инфицированных CD-4 клеток погибает, не успев превратиться в клетки памяти. Однако некоторые активированные клетки становятся инфицированными на пути к состоянию покоя. Эти клетки и функционируют в качестве резервуаров инфекции Причиной такой реактивации может стать встреча с антигеном или действие цитокинов.

Следующим механизмом поражения иммунных клеток является апоптоз -запрограммированная смерть клеток. Неспособность клетки как долгоживущей, так и однодневки, своевременно завершать свою жизненную программу оборачивается катастрофой для организма и проводит к целому ряду аутоиммунных и онкологических заболеваний. Вирус ВИЧ использует эту систему в обратном порядке, убыстряя процесс апоптоза через специальные белки апаптоза. Если на поверхности клетки концентрируется в большом количестве Fas-рецептор и он соединяется с со специальным связывающим белком FasL,то клетка начинает самоперевариваться. То же самое происходит при активации TNF-рецептора (tumor necrosis factor) РАЗДЕЛ 1.

Этиология и патогенез ВИЧ инфекции Рисунок 3. Апоптоз клеток Последовательность событий при апоптозе ВИЧ – специфических цитотоксических клеток может идти по двум путям. При первом пути gp120 антигены, которые могут отсоединяться от вирусной частицы, присоединяются как к макрофагам, так и цитотоксическим клеткам. В результате этого связывания происходит активация TNF рецептора в этих клетках и это становится причиной TNF опосредованного апоптоза.

Еще более неприятная картина наблюдается при контакте цитотоксических клеток с инфицированными ВИЧ клетками. В инфицированных клетках резко повышен уровень синтеза FasL. При встрече таких клеток с клетками, несущими на своей поверхности Fas белки происходит, по образному сравнению М.Р.Бобковой, “поцелуй смерти”, приводящий к гибели клеток. К сожалению, в роли обреченных Fas несущих клеток выступают цитотоксические лимфоциты.

Мы перечислили лишь основную часть возможных механизмов поражения иммунной системы при ВИЧ инфекции. Более детальное описание этих механизмов можно найти в соответствующих руководствах и монографиях.

РАЗДЕЛ ИФА и ПЦР лаборатории

СОДЕРЖАНИЕ

I. Лекция. Эпидемическая ситуация по ВИЧ-инфекции в Центральной Азии.

Цель занятия: дать информацию об эпидемиологической ситуации в мире и странах Центральной Азии.

Задачи: по окончании занятия участники должны быть информированы об эпидемиологической ситуации в мире и странах Центральной Азии.

РАЗДЕЛ 2.

ИФА и ПЦР лаборатории ГЛАВА

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИя

Лаборатория по диагностике СПИД проводит серологические исследования сывороток лиц, относящихся к группам риска заражения вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ); доноров; лиц подозреваемых в клиническом проявлении СПИД; лиц, находящихся в контакте с инфицированным ВИЧ или на диспансерном наблюдении и других групп населения, которые могут быть включены в обследование по эпидемиологическим показаниям.

Диагностические лаборатории осуществляют исследования крови, направленные на выявление случаев заражения вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), проводят исследования методом иммуноферментного анализа (ИФА) и методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Лаборатория является структурным подразделением Центров СПИД на национальном, городском и областном уровнях или может быть сформирована на базе государственного медицинского учреждения (территориальные больницы).

Лаборатория или организация, в состав которой она входит, должна быть субъектом, способным нести юридическую ответственность.

Лабораторию возглавляет заведующий, непосредственно подчиненный главному врачу (руководителю) учреждения, в составе которого она создана.

Штаты диагностической лаборатории определяются Министерством здравоохранения Кыргызской Республики в соответствии с нормативной документацией.

В своей работе лаборатория руководствуется государственным законодательством.

Организационно-методическое руководство, качество лабораторной диагностики при проведении скрининговых исследований на ВИЧ и ВИЧ индикаторные инфекции контролирует референс – лаборатория РО «СПИД» и РЦККЛДИБ (центр по контролю качества) Министерства здравоохранения КР, а санитарнопротивоэпидемический режим – территориальные органы ДГСЭН.

Врачи лабораторий и средний медицинский персонал проходят специальную подготовку по серологической диагностике ВИЧ методом иммуноферментного анализа (ИФА) и методом ПЦР на курсах при институтах усовершенствования врачей, на рабочих местах в референс – лаборатории РО «СПИД» и лабораториях диагностики ВИЧ/СПИД при областных центрах СПИД.

Лаборатория должна быть обеспечена штампом и бланками с обозначением своего наименования и места расположения учреждения, в котором находится лаборатория.

Лаборатория является структурным подразделением Центров СПИД на национальном, городском и областном уровнях или может быть сформирована на базе государственного медицинского учреждения (территориальные больницы).

Руководители центров СПИД и главные врачи медицинских ЛПО, а также заведующие лабораторией диагностики ИФА и ВИЧ/СПИД должны отвечать за обеспечение качественным оборудованием, качественными тест-системами, отвечать за профессиональную подготовку кадров, учебные программы и учебные ресурсы.

Лаборатория оснащается оборудованием для иммуноферментного и ПЦР анализа и общелабораторного назначения. Лабораторное оснащение обеспечивает администрация ЛПО.

Лаборатория должна иметь необходимый набор помещений, обеспечивающий противоэпидемический режим.

Нормативная документация В своей деятельности лаборатория руководствуется государственным законодательством, документами, регламентирующими деятельность лаборатории, такими как положение и руководство по качеству лаборатории, функционально-должностные инструкции, заключение об аттестации, разрешение режимной комиссии.

Факторы, обеспечивающие качество исследований Под обеспечением качества исследований понимается совокупность планируемых и систематически проводимых мероприятий, необходимых для создания условий, при которых проводимые лабораторией исследования будут соответствовать стандартным требованиям.

Правильность и надежность исследований, проводимых лабораторией, определяют следующие факторы:

– Помещения и рабочая среда – Методы исследований и их валидация – Контроль и оценка качества исследований – Отбор и подготовка образцов к исследованию Помещения лаборатории и требования к условиям проведения исследований Площадь и набор помещений лаборатории должны соответствовать нормативным документам.

Условия проведения исследований, включая источники энергии, освещение и окружающую среду, должны содействовать правильному проведению исследований.

РАЗДЕЛ 2.

ИФА и ПЦР лаборатории Лаборатория должна контролировать соответствие условий проведения исследований с техническими требованиями, методиками и процедурами. Надлежащее внимание должно уделяться, например, биологической стерильности, пыли, электромагнитным помехам, радиации, влажности, электроснабжению, температуре, уровню шума и вибрации. Исследования должны быть прекращены, если условия окружающей среды не отвечают надлежащим требованиям.

Соседние участки, на которых проводятся несовместимые работы, должны быть надежно изолированы друг от друга. Должны быть предприняты меры по предотвращению взаимного влияния.

Необходимо обеспечивать порядок и чистоту в лаборатории.

Подготовка кадров Руководство лаборатории должно гарантировать компетентность всех, кто проводит исследования, оценивает результаты.

Руководство должно отвечать за профессиональную подготовку кадров, учебные программы и учебные ресурсы.

Программа подготовки должна соответствовать имеющимся и предстоящим задачам лаборатории. Эффективность проводимого обучения должна оцениваться.

Необходимо иметь документы, регламентирующие деятельность сотрудников (функциональные обязанности, трудовой договор, документы, подтверждающие профессиональный уровень), документы, обязывающие руководство гарантировать условия труда.

Численность персонала должна соответствовать объёму выполняемых исследований.

Руководство лаборатории должно сформулировать программу подготовки и обучения персонала.

Вновь принятые на работу сотрудники должны пройти собеседование об условиях приема на работу, по технике безопасности, навыкам профессиональной гигиены, функциональных обязанностях, соблюдении конфиденциальности информации. На каждого сотрудника заводится личное дело, которое включает персональные данные, сведения об образовании, профессиональной подготовке и квалификации, подписанные функциональные обязанности, запись о знакомстве с техникой безопасности, запись о несчастном случае, соблюдении режима работы лаборатории, дисциплинарные меры.

В лаборатории должна проводиться оценка и мониторинг профессиональной деятельности сотрудников, которая основывается на контроле за выполнением операционных процедур, ведением учетно-отчетной документации, стабильностью результатов с применением правил и методов внутрилабораторного контроля и периодической оценкой деятельности и внесения коррективов.

Методы исследований и их валидация Лаборатория в своей деятельности должна владеть методами, соответствующим области ее деятельности.

Все инструкции, стандарты, руководства и справочные данные, относящиеся к работе лаборатории, должны быть доступными для персонала. Отклонения от методов испытаний допускаются только при условии их документального оформления, технического обоснования, одобрения и согласия руководства.

Международные, региональные, национальные стандарты или общепринятая нормативная и техническая документация не нуждаются в дополнениях или переоформлении в качестве внутренних процедур, если эти стандарты написаны так, что они могут быть использованы в опубликованном виде сотрудниками лаборатории.

Оборудование Лаборатория должна располагать оборудованием всех видов, требуемым для правильного проведения исследований.

Оборудование и его программное обеспечение, используемые для проведения исследований, должны обеспечивать требуемую точность и соответствовать техническим требованиям. До ввода в эксплуатацию оборудование должно быть метрологически поверено на предмет установления его соответствия техническим требованиям, действующим в лаборатории и соответствующим стандартам. В дальнейшем метрологический контроль проводится один раз в год соответствующим Государственным метрологическим органом страны.

В лаборатории должны быть написаны стандартные операционные процедуры (СОПы) по использованию и обслуживанию оборудования, всегда доступные для персонала лаборатории.

Каждая единица оборудования должна быть зарегистрирована и поставлена на учет. Регистрационные данные должны включать следующие сведения:

a. идентификацию каждой единицы оборудования и её программного обеспечения;

b. наименование изготовителя, идентификацию типа, серийный номер или другую уникальную идентификацию;

c. результаты поверок соответствия оборудования нормативной документации;

d. местонахождение на данный момент;

e. инструкции изготовителя, при их наличии, или данные о месте их f. даты, результаты и копии отчетов и сертификатов всех калибровок, регулировок, критериев приемки и планируемую дату очередной РАЗДЕЛ 2.

ИФА и ПЦР лаборатории g. план обслуживания, при необходимости, и проведенное обслуживание;

h. описание любых повреждений, неисправностей, модификаций или Если оборудование было подвергнуто перегрузке или неправильному обращению, показало сомнительные результаты, оказалось с дефектами или его параметры выходили за установленные пределы, оно должно быть выведено из эксплуатации. Его необходимо изолировать для того, чтобы предотвратить его использование, или четко указать на ярлыке или маркировке, что оно непригодно к использованию до тех пор, пока оно не будет отремонтировано, калибровано или испытано на предмет правильного функционирования.

Контроль и оценка качества исследований Оценка качества состоит из двух компонентов – программы внешней оценки качества и программы внутрилабораторного контроля качества.

Внешняя оценка качества – это сравнение результатов, полученных в нескольких лабораториях на одном контрольном материале одним и тем же методом. Мероприятия внешнего контроля проводятся на систематической основе.

Контрольные образцы рассылаются Центром внешнего контроля качества или региональными лабораториями. Целью этого контроля является оценка степени сопоставимости результатов исследований, установления и исправления выявленных ошибок.

Внутрилабораторный контроль – это текущие ежедневные мероприятия, осуществляемые в одной конкретной лаборатории.

Отбор образцов Доставляемые в лабораторию образцы должны соответствовать требованиям приемлемости образцов для проведения исследований. В лаборатории должны быть документы, в которых оговариваются условия приемлемости образцов для исследования, бракиражные журналы или компьютерные программы, в которых это всё отражается.

В лаборатории необходимо разработать СОПы на получение, транспортировку, маркировку, хранение и уничтожение образцов.

Образцы должны храниться при определенных условиях и эти условия должны поддерживаться, контролироваться и регистрироваться. Если образцы должны быть сохранены, в лаборатории должны быть условия для их хранения и соответствующие разрешающие документы.

ГЛАВА

ТРЕБОВАНИя К ОРГАНИЗАЦИИ РАБОТЫ ИФА ЛАБОРАТОРИЙ.

Обеспечение биобезопасности лабораторий диагностики СПИД 1. Работа в лабораториях диагностики ВИЧ/СПИД осуществляется в соответствии с правилами противоэпидемического режима работы с возбудителями третьей группы патогенности или 2-м уровнем биологической безопасности по классификации инфекционных микроорганизмов по группам 2. Ответственность за организацию и проведение комплекса противоэпидемических и дезинфекционных мероприятий в диагностических лабораториях возлагается на руководителей медицинских организаций и заведующих лабораториями.

3. Заведующий лабораторией (лицо, которое несет непосредственную ответственность за лабораторию) отвечает за разработку и принятие плана обеспечения биобезопасности или руководства по безопасности или рабочим процедурам, обеспечивающим безопасность работы.

4. Заведующий лабораторией назначает ответственного за обучение персонала технике безопасности лабораторных работ.

5. Персонал должен иметь теоретические знания и практические навыки работы с биологическим материалом, а также обязан ознакомиться с соответствующими инструкциями по применению стандартных правил и техники безопасности работ и следовать им.

6. Заведующий лабораторией обеспечивает проведение инструктажей по режиму работы с биологически опасным материалом и технике безопасности работы в лаборатории, несет ответственность за выполнение основных противоэпидемических правил работы в лаборатории.

7. В лаборатории должны быть необходимые нормативно-методические документы, регламентирующие правила работы с биологически опасным материалом:

– Деятельность лаборатории независимо от формы собственности осуществляется на основании действующих нормативно-директивных документов МЗ КР.

– Работу в ИФА лаборатории выполняют специалисты с высшим и средним медицинским образованием, специалисты с высшим биологическим образованием должны пройти первичную врачебную специализацию по лабораторному делу на базе Государственного медицинского института повышения и переквалификации кадров.

– Персонал допускается к работе в лаборатории только после проРАЗДЕЛ 2.

ИФА и ПЦР лаборатории ведения инструктажа по соблюдению требований биологической безопасности. Последующие инструктажи проводятся согласно утвержденному графику.

– Посещение «заразной зоны» лаборатории инженерно– техническим персоналом осуществляется с разрешения руководителя подразделения в сопровождении сотрудника лаборатории. Ремонтные работы проводятся после прекращения работы с патогенным материалом и дезинфекционной обработки пола, оборудования и ее – Доставка в лабораторию образцов для исследования и на верификационные исследования осуществляется согласно утвержденным правилам, обеспечивающим безопасность.

Все сотрудники, работающие с биологическими материалами 3-4 групп патогенности, должны находиться на диспансерном наблюдении. Периодические медицинские осмотры проводятся в соответствии с действующими приказами.

У сотрудников лаборатории, проводящих серологические исследования на ВИЧ инфекцию и гепатиты В и С, ежегодно проводятся контрольные исследования на наличие соответствующих маркеров в сыворотке крови.

Сотрудники лабораторий должны быть обеспечены медицинскими халатами, шапочками, сменной обувью и другими средствами индивидуальной защиты в зависимости от характера выполняемых работ и в соответствии с действующими нормами.

Рабочая одежда и обувь должны быть индивидуальными, соответствовать размерам работающих и храниться отдельно от личной одежды.

Требования к помещениям ИФА лабораторий Диагностические ИФА лаборатории должны иметь 2 входа: один для сотрудников, другой для доставки материала на исследование. Допускается получение материала через передаточное окно. В лабораториях научно-исследовательских учреждений и производственных лабораториях допускается наличие одного входа.

Лаборатория должна быть обеспечена водопроводом, канализацией, электричеством, отоплением и вентиляцией.

Все помещения лаборатории должны иметь естественное и искусственное освещение в соответствии с требованиями действующих нормативных документов.

Помещения лаборатории должны быть разделены на «заразную» и «чистую» зоны.

В «заразной» зоне планировочные решения и размещение оборудования должны обеспечивать поточность продвижения биологического материала.

В «чистой» зоне располагаются:

– комната (гардероб) для одежды;

– комната отдыха и приема пищи;

– комната для работы с документацией и литературой;

– кабинет заведующего;

– подсобные помещения;

В «заразной» зоне должны располагаться:

– комната для приема и регистрации материала;

– комната для разборки и подготовки материала к исследованиям;

– комната для проведения серологических исследований;

Дверь серологического помещения должен иметь смотровое окно и соответствовать правилам противопожарной безопасности, т.е. быть самозакрывающейся. Системы безопасности должны включать противопожарную и электробезопасность.

Окна, двери помещений «заразной» зоны должны быть герметичными. На окна цокольного и первого этажей следует устанавливать металлические решетки, не нарушающие правила пожарной безопасности.

Стены лабораторных помещений «заразной» зоны должны быть покрыты кафелем, масляной или латексной краской. Поверхность пола, потолки должны быть гладкими, без щелей, легко обрабатываемыми, устойчивыми к действию моющих и дезинфицирующих средств, полы не должны быть скользкими.

Лабораторная мебель в «заразной» зоне должна иметь покрытие, устойчивое к действию моющих и дезинфицирующих cредств. Поверхность столов не должна иметь швов и трещин.

Во всех помещениях устанавливают бактерицидные лампы из расчета 2, вт/м3. Необходимо вести учет времени работы каждой лампы с отметкой в журнале.

Помещения лаборатории должны быть непроницаемы для копоти и пыли, грызунов и насекомых, а также оснащены средствами пожаротушения.

В комнате проведения ИФА исследований необходимо установка кондиционеров «зима-лето» для поддержания комнатной температуры от 18° С до 25° С.

Помещения для хранения верхней одежды и личных вещей, помещения для приема пищи и питья, а так же комнаты отдыха должны располагаться вне рабочей зоны лаборатории.

РАЗДЕЛ 2.

ИФА и ПЦР лаборатории Необходимо обеспечить надежную защиту помещений лаборатории. Двери в лабораторию должны быть в обязательном порядке укреплены. Окна зарешечены.

Требования к лабораторному оборудованию Приборы, оборудование и средства измерения, используемые в работе лаборатории, должны быть технически исправны, иметь технический паспорт и рабочую инструкцию по эксплуатации. Средства измерения регулярно подвергают метрологическому контролю. Используемые приборы должны соответствовать нормам безопасности и иметь сертификаты.

Все холодильники и морозильные камеры должны быть снабжены внутренними термометрами. Сотрудники лаборатории должны ежедневно регистрировать температуру в специальном журнале. В случае изменений показаний термометра внутри оборудования, необходимо выяснить причины и устранить неисправности.

Необходимо иметь надежный источник электропитания соответствующей мощности.

Необходимо наличие резервного генератора для питания основного оборудования – инкубаторов, ридеров, холодильников и т.д.

Для проведения исследования используют одноразовые расходные материалы (пробирки, наконечники к автоматическим дозаторам), исключающие возможность перекрестной контаминации исходного материала.

Если такой возможности нет, то допускается применение наконечников к автоматическим дозаторам в течение 3-5 постановок при соблюдении следующих правил обработки:

– После использования замочить в 6% растворе перекиси водорода – Промыть проточной водой 5-6 раз;

– Промыть дистиллированной водой и прокипятить 5 – 10 мин., остудить;

– Промыть 5-6 раз дистиллированной водой с помощью водоструйного насоса (можно использовать насадку для нескольких наконечников, чтобы ускорить процесс);

– Чистые наконечники прополоснуть в 50%-ном растворе спирта;

– Сушить в сухожаровом шкафу при температуре 70-800С (1-1,5 час.) – Нельзя раскладывать наконечники руками – следует работать в чистых резиновых перчатках.

Наконечники и ванночки, применяемые для работы с растворами коньюгата, ОФД/ТМБ используются однократно!

Дозаторы, рабочая поверхность и наружная поверхность корпуса прибоРАЗДЕЛ 2.

ров должны быть устойчивы к действию моющих и дезинфицирующих средств и ультрафиолетового излучения.

Минимальный комплект оборудования и расходных материалов для ИФА лаборатории включает в себя:

– Автоматический ридер – Автоматический вошер – Инкубатор с шейкером (термостат) – Центрифуга на 1500-3000 об/мин – Дозатор 8 канальный переменного объема на: 5-50мкл, 50мкл.

– Дозатор одноканальный переменного объема на: 0,5-10мкл, 20мкл, 100-1000мкл.

– Криопробирки одноразовые на 2 мл – Пробирки центрифужные на 10 мл – Наконечники на: 10мкл, 200 мкл, 1000 мкл – Планшеты 96 -луночные плоскодонные – Холодильник бытовой двухкамерный на +4 С +8 С – Комплект компьютера (монитор, процессор, принтер).

Требования к диагностическим тест-системам Наличие регистрации в департаменте лекарственного обеспечения и медицинской техники.

Инструкции должны быть на государственном или русском языках.

При транспортировке и хранении соблюдать постоянный температурный холодовой режим +4° С +8° С.

Закупка тест-систем осуществляется согласно номенклатуре исследований у официальных дистрибьюторов, производителя с наличием паспорта и сертификата.

Требование к обработке помещений и обеззараживанию материала Текущая уборка помещений проводится ежедневно влажным способом: в «чистой» зоне с применением моющих средств, в «заразной» зоне с применением дезинфектантов.

В боксовых помещениях должна проводиться еженедельная генеральная уборка с применением дезинфицирующих средств путем протирания поверхности мебели, приборов, аппаратов, стен.

После влажной уборки включают бактерицидные лампы.

РАЗДЕЛ 2.

ИФА и ПЦР лаборатории Перед началом работы рабочую поверхность столов дополнительно обрабатывают 70% этиловым спиртом.

По окончании работы все пробирки с образцами, должны быть убраны в холодильники (морозильники), в обязательном порядке проводится дезинфекция рабочих поверхностей столов.

Использованная посуда, твердые отходы из «заразной» зоны лаборатории должны собираться в закрывающиеся емкости и передаваться в автоклавную или дезинфицироваться на месте. Слив необеззараженных жидкостей в канализацию запрещается.

Перенос использованной посуды для обеззараживания должен осуществляться в закрывающихся емкостях, исключающих инфицирование во время транспортирования.

Пробирки и флаконы со сгустками крови обеззараживаются только с использованием дезинфицирующих средств (6% раствор перекиси водорода, 3% раствор хлорсодержащих препаратов).

При погружении в дезинфицирующий раствор емкостей со сгустками крови необходимо соблюдать осторожность. Емкость берут анатомическим пинцетом и погружают ее в наклонном положении до полного заполнения раствором. При правильном погружении воздушных пузырей не образуется, и емкость опускается на дно. После погружения всех емкостей пинцет обеззараживают.

Наконечники обрабатываются только 6% раствором перекиси водорода.

После завершения работы помещение «заразной» зоны лаборатории запирается и сдается на сигнализацию.

Вынос из лаборатории оборудования, лабораторной или хозяйственной посуды, реактивов, инструментов производится только после их дезинфекции и с разрешения ее руководителя.

ГЛАВА

ТРЕБОВАНИя К ОРГАНИЗАЦИИ РАБОТЫ ПЦР ЛАБОРАТОРИЙ

Работу с применением метода ПЦР проводят только при наличии в организации разрешения на деятельность, разработанного и утвержденного в установленном в государстве законодательном порядке, т.е. в соответствии с требованиями и приказами МЗ, методическими рекомендациями, СанПиН, Работу по ПЦР – диагностике организует и проводит специалист с медицинским или биологическим образованием, прошедший обучение на курсах специализации по ПЦР диагностике.

Требования к помещениям ПЦР лаборатории Способность ПЦР нарабатывать ДНК даже с единичной матричной молекулы накладывает определенные условия на организацию лаборатории, использующей данную методику.

Допускается организация ПЦР – лаборатории на территории действующей диагностической лаборатории, при этом, помещения располагают в виде отдельного блока. При строительстве новых или реконструкции имеющихся помещений лабораторию размещают в отдельно стоящем здании.

Общая планировка лаборатории, внутренняя отделка помещений, состояние помещений должны соответствовать СанПиН, СНиП, приказам, методическим рекомендациям, требованиям режимной комиссии принятых в стране и обеспечивать поточность движения исследуемых проб.

Условно помещения ПЦР лаборатории можно разделить на «чистую» и «заразную» зоны. В «чистой зоне» располагается 1 – комната выделения нуклеиновых кислот и 2 – комната для приготовления реакционной смеси. В «заразной»

зоне – 3 комната – комната детекции продукта ПЦР. При использовании ПЦР в «режиме реального времени», допустимо объединение 1 и 2 помещения «чистой» зоны, при условии, что очистка нуклеиновых кислот (НК) и приготовление реакционной смеси будет проходить в разных ПЦР боксах/шкафах биобезопасности.

Таким образом, во избежание загрязнения исследуемых образцов фрагментами ранее полученных реакций (контаминации продуктом амплификации), необходимо организовать отдельные помещения для этапов:

1. Отчистки нуклеиновых кислот 2. Приготовление реакционной смеси 3. Анализа реакционной смеси При размещении ПЦР лаборатории отдельно от других лабораторий необходимо предусмотреть следующие вспомогательные помещения:

– комната приема, регистрации и первичной обработки образцов – подсобные (складские) помещения Выделение нуклеиновых кислот необходимо проводить в ПЦР-боксах (или боксах биологической безопасности – ламинарных шкафах II класса защиты). При большой нагрузке на лабораторию рекомендуется увеличить количество данных боксов, при этом в них не допускается проведение других работ!

РАЗДЕЛ 2.

ИФА и ПЦР лаборатории Если используется метод, при котором необходимо открывать пробирку с продуктами амплификации (электрофорез, ГиФА), то комната детекции должна размещаться как можно дальше от двух других зон (другой этаж, другое здание) и иметь отдельную систему вентиляции, не связанную с другими помещениями.

Это является принципиальным требованием при организации ПЦР – лаборатории!

Помещения ПЦР – лаборатории оборудуют приточно-вытяжной или вытяжной вентиляцией, соответствующей санитарно-эпидемиологическим требованиям. Во всех зонах обязательное наличие УФ ламп.

Требования к лабораторному оборудованию Комплект лабораторного оборудования определяют с учетом используемых наборов реагентов для выделения НК, амплификации и детекции результатов исследований.

Перечень необходимого оборудования, расходного материала и их размещение в рабочих зонах ПЦР-лаборатории Для обработки материала и выделения нуклеиновых кислот – Бокс биологической безопасности II или III класса защиты – Микроцентрифуга (12000-16000 об/мин ) для микроцентрифужных – Твердотельный термостат для пробирок объемом 1,5 мл с диапазоном рабочих температур 25-100°С – Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой или хирургический отсос – Набор автоматических дозаторов переменного объема варьирующих от 0,5-10мкл, 100-200мкл, 100-1000 мкл – Одноразовые полипропиленовые микроцентрифужные пробирки – Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером от 0,5-10мкл, 100-200мкл, 1000 мкл – Одноразовые наконечники без фильтра, для пипеток переменного – Штативы для микропробирок объемом на 1,5 мл – Холодильник с камерами, поддерживающими температуру от +2 до +8°С и минус 20 °С, минус 70°С – для хранения набора выделения НК.

– Холодильник с камерой, поддерживающей температуру от +2 до +8°С для хранения препаратов НК (поскольку не допускается храРАЗДЕЛ 2.

нение проб материала или препаратов НК в одном холодильнике с компонентами набора для проведения анализа) – Емкость с дезинфицирующим раствором (флакон с закрытой крышкой для обработки хирургического отсоса) – Отдельный халат и резиновые перчатки Для приготовления ПЦР-смеси – Бокс биологической безопасности II класса защиты или настольный ПЦР-бокс с бактерицидной лампой – Центрифуга-вортекс до 2000 об/мин – Набор автоматических дозаторов переменного объема от 0,5мкл, 100-200мкл, 1000 мкл – Штативы для наконечников, микропробирок на 0,1-0,2мл и на 1,5мл – Одноразовые полипропиленовые пробирки на 1,5 мл и для амплификации объемом 0,1-0,2 мл – Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером от 0,5-10мкл, 100-200мкл, 1000 мкл – Штативы для наконечников, микропробирок объемом на 1,5; 0,2;

– Холодильник с камерами, поддерживающими температуру от +2 до +8°С, минус 20°С для хранения компонентов для амплификации и – Емкость для сброса отработанных расходных материалов – Отдельный халат и резиновые перчатки.

Для проведения амплификации:

В «режиме реального времени» ПЦР – Амплификатор – Компьютер для взаимодействия с прибором и обработки полученных данных – Система контроля напряжения в сети (UPS) – Принтер – Емкость для сброса отработанных расходных материалов Для электрофоретического анализа продуктов ПЦР – Камера для горизонтального электрофореза.

– Источник постоянного тока с напряжением 150-460 В – Ультрафиолетовый трансиллюминатор с кабинетом для просмотра – Видеосистема с цифровой видеокамерой для регистрации результатов – Компьютер (должен быть связан через компьютерную сеть с компьютером, располагающимся в чистой зоне и предназначенным РАЗДЕЛ 2.

ИФА и ПЦР лаборатории для анализа результатов электрофореза) – Микроволновая печь для плавления агарозы – Колба коническая из термостойкого стекла для плавления агарозы – Штатив для микропробирок на 0,2-0,5 мл – Набор автоматических дозаторов переменного объема от 0,5мкл, 100-200мкл – Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером от 0,5-10мкл, 100-200мкл – Холодильник с камерой, поддерживающий температуру от +2 до + – Емкость для сброса отработанных расходных материалов – Пластиковая емкость объемом 5 литров для дезактивации буфера Для гибридизационно-ферментной детекции продуктов ПЦР – Планшетный спектрофотометр – Компьютер (должен быть связан через компьютерную сеть с компьютером, располагающимся в чистой зоне и предназначенным для анализа результатов гибридизации) – Набор автоматических дозаторов переменного объема от 0,5мкл, 100-200мкл, 1000 мкл – Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером от 0,5-10мкл, 100-200мкл, 1000 мкл – Холодильник с камерой, поддерживающий температуру от +2 до – Емкость для сброса отработанных расходных материалов.

Приборы, оборудование и средства измерения, используемые в работе лаборатории, должны быть технически исправны, иметь технический паспорт и рабочую инструкцию по эксплуатации на языке страны потребителя (языке доступного для конечного потребителя), иметь регистрационный номер, как в стране производителя, так и конечного потребителя. Используемые приборы должны соответствовать нормам безопасности и электромагнитной совместимости, иметь соответствующие сертификаты. При поступлении оборудования в лабораторию, установка, обучение персонала и сервисное обслуживание должно проводиться фирмой-производителем.

Требования к оборудованию и расходному материалу для проведения исследования методом ПЦР:

– каждая рабочая зона должна иметь свой набор мебели, лабораторного оборудования, реагентов, автоматических дозаторов, наконечников, пластиковой и стеклянной посуды, защитной одежды, обуви, резиновых перчаток, уборочного инвентаря и пр., используемых только в данной комнате (рабочей зоны);

– имущество каждой рабочей зоны должно иметь маркировку указанной зоны;

– диапазон смены температуры термостата с твердотельным термоблоком, от 25 до 100°С;

– одноразовые пробирки с плотно закрывающимися крышками, объемом на 1,5 мл., конической формы, для проведения экстракции НК – одноразовые пробирки для проведения этапа амплификации с прозрачными, тонкими стенками, плотно закрывающимися крышками, объемом 0,1-0,2мл;

– одноразовые наконечники с фильтром (aerosol-resistant tips). Желательно использовать наконечники и пробирки с маркировкой – специальные контейнеры для сброса использованных наконечников и пробирок, устанавливаемые на рабочих местах;

– дозаторы, рабочая поверхность и наружная поверхность корпуса приборов должны быть устойчивы к действию моющих и дезинфицирующих средств и ультрафиолетового излучения;

– метрологическая поверка оборудования проводится не менее – для каждого этапа проведения ПЦР– исследований необходимо предусмотреть наличие холодильников (+2+8°С), морозильных камер (не выше минус 20°С);

ПЦР-амплификатор Приборы для проведения ПЦР представляют собой устройства для быстрого изменения температуры реакционной смеси по определенной программе. В литературе встречаются разные варианты названия данного прибора – термоциклеры, ДНК-аплификаторы, ПЦР-амплификаторы, PCR Cyclers. Все современные амплификаторы делятся на две группы, в зависимости от возможности детекции накопления ДНК во время реакции: детектирующие и обычные.

Детектирующие амплификаторы (Real Time PCR Cyclers) как правило, оснащены дополнительной оптической насадкой, которая позволяет регистрировать флуоресценцию в закрытой пробирке непосредственно во время реакции.

РАЗДЕЛ 2.

ИФА и ПЦР лаборатории Основные функциональные узлы оборудования для ПЦР:

1. Термостатирующая часть 2. Оптическая часть детектирующих амплификаторов.

Для правильного протекания реакции амплификации важен температурный режим реакционной смеси в пробирке, а не термоблока (теплоносителя).

Выполнение заданного температурного режима определяется совместной работой нескольких взаимосвязанных компонентов. С точки зрения регулирования температуры, можно выделить следующие компоненты:

1. источник температурного закона 2. регулируемый тепловой насос 3. узел сопряжения теплового насоса и термоблока 5. реакционная смесь.

В качестве источника температурного закона выступает программа, записанная во встроенном управляющем микроконтроллере амплификатора (рис.1).

В качестве регулируемого теплового насоса могут быть использованы: поток воздуха, жидкости или элементы Пельтье.

Рисунок 1.

Рисунок 2.

ПЕЛТЬЕ

Термоблок обычно представляет собой алюминиевую матрицу с лунками по форме реакционных пробирок, однако может быть в виде водяной бани или отсутствовать вовсе, если нагрев и охлаждение выполняется прямым потоком воздуха.

Датчик температуры обычно расположен в термоблоке (рис.2), в зависимости от конструкции, его положение может варьировать. На передачу тепла и установления требуемой температуры реакционной смеси основное влияние оказывают:

1. тепловой контакт теплоносителя с пробиркой 2. теплопроводность стенок пробирки 3. распространение тепла внутри пробирки.

В случае использования амплификатора с твердотельным термоблоком, важно обратить внимание на совместимость термоблока и пробирок. Дело в том, что конусная часть амплификационной пробирки отличается для «одинаковых»

пробирок разных производителей, и может подходить к конкретному прибору с разной эффективностью. Толщина стенок пробирки может существенно влиять на точность расчета температуры реакционной смеси и распространение тепла внутри пробирки.

На точность установки температуры также оказывает влияние утечка тепла из термоблока (на элементы конструкции и в атмосферу). Эффект утечки тепла из термоблока вызывает неравномерности распределения температуры между лунками твердотельного термоблока прямоугольной формы и ведет к различным условиям амплификации для разных пробирок в одном эксперименте (своего рода «краевой эффект»).

На сегодняшний день существует целый ряд способов быстрого изменения температуры реакционной смеси. Наиболее распространенным является использование термоэлектрических элементов (элементов Пельтье). Элементы Пельтье представляют собой тепловые насосы, которые переносят тепло с одной грани элемента на другую при прохождении тока.

Другим распространенным подходом является использование в качестве теплоносителя – воздух. В таких инструментах для нагревания используют горячий воздух, а для охлаждения – наружный воздух. В инструментах с воздушным нагревом/охлаждением пробирки располагаются в роторе, вращающемся со скоростью 1000 об/мин., что позволяет обеспечить высокую однородность поддержания температуры для всех пробирок, делает реакционный объем более доступным для системы оптических измерений, позволяя проводить измерение флуоресценции через стенку или дно пробирки. При использовании в качестве контейнеров стеклянные капилляры, удается достичь великолепных скоростных характеристик.

В тест-системах для ПЦР «в реальном времени» используют флуоресцентные красители со спектрами поглощения и испускания во всем видимом диапазоРАЗДЕЛ 2.

ИФА и ПЦР лаборатории не, а также ближней ультрафиолетовой и инфракрасной областях. При решении большинства задач исследователю необходимо использовать одновременно несколько каналов измерения флуоресценции, важным является подбор правильной комбинации флуорофоров с точки зрения их спектральных характеристик.

Факторы определяющие качество оптических измерений:

– согласование спектральных характеристик флуорофоров и оптического тракта прибора (т.е. длина волны возбуждения и детекции должны соответствовать параметрам флуорофора);

– условия быстрого изменения температуры, накладывающие ограничения на конструкцию оптической части прибора. При использовании воздуха в качестве теплоносителя решения оптической конструкции более эффективные и разнообразные. В традиционных приборах с твердотельными термоблоками, оптический доступ к реакционной смеси возможен только через крышку, вследствие чего необходимо использовать пробирки и крышки с хорошими оптическими свойствами.

В современной ПЦР лаборатории наиболее широко используют амплификаторы с системой детекции в «режиме реального времени», которые характеризуются как системы «открытого типа». На таких приборах можно осуществлять постановку ПЦР с использованием широкого спектра реагентов производства различных отечественных и зарубежных производителей, с использованием разных методических подходов (полностью собранная сухая смесь, готовая смесь для ПЦР, «горячий старт», смесь для ПЦР из отдельных жидких компонентов) Также «открытость» системы может быть охарактеризована как возможность использования широкого спектра расходных материалов. Это очень важно для всех типов диагностических лабораторий, так как позволяет более экономично проводить ПЦР – анализ.

«Закрытые» системы ПЦР требуют использовать реагенты одного производителя, пластик и расходный материал определенного типа, что делает систему «закрытой» и менее выгодной для пользователя.

Ламинарные боксы II класса защиты Бокс применяется для оснащения отдельных рабочих мест в медицинских, фармацевтических и других учреждениях с высокими требованиями к чистоте воздуха (вирусологические и бактериологические лаборатории, работающие с микроорганизмами II-IV групп патогенности).

Основная функция ламинарного бокса защита окружающей среды, оператора и продукта. Ламинарный бокс способен задерживать частицы аэрозолей и капли диаметром 5-100 мкм., которые не видны невооруженным взглядом!

Таблица 1. Характеристики наиболее популярных ламинарных боксов

ЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ NSF 49, DIN

ЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ NSF 49, DIN

Шкаф биологической без- 1000 х Ламинарный Бокс БАВп- 1170 x нарные системы, Россия Ламинарный шкаф (ла- 2060 х РАЗДЕЛ 2.

ИФА и ПЦР лаборатории Принцип работы ламинарного бокса Рисунок 3. Принцип работы ламинарного бокса II класса биологической защиты Комнатный воздух отверстие в передней панели входной HEPA-фильтр рабочая поверхность воздух расщепляется на два потока заднюю выходную вентиляционную Центрифуги Основное назначение – разделение исследуемого материала на фракции По функциональным характеристикам подразделяются на:

По применению различают три класса центрифуг в ПЦР– лаборатории:

– Низкоскоростные (табл.2) – предобработка клинических материалов – Микроцентрифуги (табл.3) – отделение осадка от раствора в процессе выделения НК – Ультрацентрифуги (табл.4) – исследования высокомолекулярных веществ, биологических систем.

Таблица 2. Низкоскоростные центрифуги ОПН3, Россия 1000, 1500, 2800 10 пр. х 15 мл.

BioSan LMC- Латвия Таблица 3. Микроцентрифуги РАЗДЕЛ 2.

ИФА и ПЦР лаборатории Таблица 4. Ультрацентрифуги Beckman (21R,25R,64R) Вортексы – Встряхивание и перемешивание смесей – Быстрое осаждение образца на дно пробирки при 2000 об/мин Таблица 5.Типы вортексов Термостаты Предназначены для термостатирования сухим способом микропробирок 0,5-1,5 мл в диапазоне температур от комнатной до 120°С Таблица 6. Типы термостатов Твердотельный термостат Термо 24х1,5 мл и от +25°С до Память на Биоком, Россия РАЗДЕЛ 2.

ИФА и ПЦР лаборатории Твердотельный Латвия термостат TDB- 32х1,5 мл от +25°С до Встроенный Твердотельный термостат ГНОМ, 40х1,5 мл и от +25°С до Требования к тест-системам (комплектам реагентов) Наличие регистрации в стране производителя и конечного потребителя.

Перерегистрация наборов согласно принятым в стране законам. Наличие инструкции применения набора, протокол адаптации набора к ПЦР– амплификатору вашей лаборатории, паспорт на языке доступном для конечного потребителя. Соответствие набора требованиям по чувствительности и специфичности.

Температурный режим транспортировки (+2 +8°С – для реагентов экстракции НК и минус 20°С для реагентов амплификации). Условия хранения и срок хранения строго соблюдать в соответствии с прилагаемой к набору инструкции.

Реагенты предназначенные для проведения реакции амплификации должны храниться отдельно от образцов ДНК и анализируемого материала в отдельном холодильнике. Запрещается использовать реагенты с просроченным сроком годности.

Требования к проведению работ:

– Противоэпидемический режим при организации и выполнении ПЦР-анализа должен быть обеспечен в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами принятыми в стране;

– Допускается в лабораториях, имеющих санитарно – эпидемиологическое заРАЗДЕЛ 2.

ключение о возможности проведения работ с ПБА 3 группы патогенности, проведение исследований методом ПЦР с детекцией в «режиме реального времени» с целью диагностики парентеральных вирусных гепатитов, ВИЧ инфекции, возбудители которых относятся ко 2 группе патогенности;

– Забор крови осуществлять в стерильные одноразовые пробирки типа вакутейнер, с консервантом К2/К3. Сроки хранения взятого образца – в соответствии с целью исследования. (Например, для определения провирусной ДНК ВИЧ допускается хранение пробирки при +2+8 0С в течении 48 часов);

Рисунок 4. Техника взятия пробирок – Весь материал, поступающий для исследования в ПЦР– лабораторию, должен быть промаркирован и обязательно зарегистрирован в специальном журнале постоянным сотрудником, который несет персональную ответственность за сохранность исследуемого материала в течении требуемого нормативами срока, а также за утилизацию этого материала;

– Каждый этап исследования должен осуществляться отдельным набором автоматических дозаторов, расходного материала;

– Запрещается перемещение оборудования или расходного материала из одного помещения в другое (особенно из электрофоретической комнаты в другие помещения);

– На этапе экстракции НК, приготовления реакционной смеси строго следовать инструкции по применению набора;

– Набор наконечников в специальный штатив осуществлять пинцетом;

РАЗДЕЛ 2.

ИФА и ПЦР лаборатории – Рабочее количество микропробирок (1,5мл) и пробирок для амплификации набирать согласно протоколу исследования и производить пинцетом.

Захват пробирок производить либо за боковые стенки пробирки, либо за перемычку крышки, не задевая внутреннюю поверхность пробирки и крышки (рис.4).

– Смена наконечников после завершения каждой манипуляции является обязательной;

– Каждый из процессов (очистка НК, приготовление реакционной смеси, нанесение образцов в гель) необходимо выполнять в новых одноразовых перчатках;

– Работать в одноразовых перчатках, желательно без талька. Если перчатки припудрены тальком, то до начала работы необходимо тщательно удалить его с поверхности перчаток, т.к. тальк является одним из ингибиторов ПЦР;

– Желательно этапы выделения НК, приготовления реакционной смеси и проведение электрофореза проводить силами разных сотрудников. При выполнении всех этапов одним сотрудником, после проведения электрофореза он не должен заходить в «чистую» зону ПЦР. Продукт амплификации – ампликон, летуч и устойчив в окружающей среде, не опасен для персонала. При открывании пробирки ампликон может попасть на одежду и открытые участки тела, таким образом перенестись в «чистую» зону и послужить причиной контаминации следующих образцов или ПЦР-смеси;

– Все операции при работе на амплификаторе для ПЦР с детекцией в «режиме реального времени» осуществляются, согласно инструкции к прибору и используемому набору реагентов;

– При загрузке пробирок в амлификатор роторного типа желательно не задевать пальцами рук, не делать надписи на боковых стенках. Следы талька, отпечатки пальцев рук на боковой поверхности пробирок могут нежелательно сказаться на результате исследования. Если амплификатор планшетного типа, эти требования касаются крышки амплификационной – Во избежание контаминации открывать крышки амплификационных пробирок после проведения ПЦР с детекцией «в режиме реального времени»

в рабочих зонах лаборатории запрещается! Пробирки после ПЦР удаляют в контейнер для отходов;

– Персонал, работающий в ПЦР лаборатории, где используется метод ПЦР с детекцией «в режиме реального времени», должен пройти соответствующее – Использованные наконечники для автоматических пипеток, пробирки и другие загрязненные НК материалы необходимо автоклавировать или обработать реагентами, вызывающими разрушение НК (ДП-2Т, Россия -Трихлоризоциануровая к-та).

Требования к обработке помещений и обеззараживанию материала Необходимо постоянно поддерживать чистоту во всех зонах лаборатории. Во всех помещениях ПЦР лаборатории должна регулярно проводиться ежедневная влажная уборка.

В комнатах, в которых проводят работу с выделенными НК, рабочие поверхности, штативы, оборудование следует обеззараживать ежедневно УФ лучами. Полы ежедневно подвергают влажной уборке с применением дезинфицирующих средств, регламентированных санитарными правилами, утвержденных в МЗ.

Перед началом работы рабочую поверхность столов дополнительно обрабатывают 70% этиловым спиртом.

Ежемесячно проводят профилактическую обработку рабочей поверхности столов и штативов растворами для деградации НК (ДП-2Т, Россия; DNAZAP™ Ambion, The RNA Company, США).

При возникновении контаминации (получении повторных положительных результатов в отрицательных контролях, а также при тестировании контрольных смывов) в помещениях проводят мероприятия по ликвидации контаминации.

Действия при контаминации лаборатории нуклеиновыми кислотами 1. Сотрудников, проводящих мероприятия по деконтаминации, обеспечивают одноразовыми халатами, шапочками, бахилами и перчатками, одноразовой ветошью, ёмкостями для приготовления необходимых количеств моющих и дезинфицирующих растворов.

2. Каждую зону лаборатории обрабатывают сотрудники, работающие в ней.

3. Для обработки каждой зоны используют новый набор уборочного инвентаря.

4. Каждую зону лаборатории разбивают на участки уборки, например:

– участок 1 – бокс биологической безопасности и оборудование внутри него;

– участок 2 – внешние поверхности бокса биологической безопасности;

– участок 3 – шкафы для расходного материала;

– участок 4 – холодильники для хранения реактивов, образцов проб;

– участок 5 – оборудование, которое используют в работе, но стоит вне бокса биологической безопасности;

– участок 6 – поверхности помещения (стены, окна, батареи, потолок, 5. Обработку проводят от участка к участку последовательно. Каждый участок обрабатывают отдельной ветошью. Перед обработкой персонал надевает РАЗДЕЛ 2.

ИФА и ПЦР лаборатории одноразовую одежду, бахилы, шапочки, перчатки, готовит моющие и дезинфицирующие растворы.

6. Поверхности каждого участка в начале обрабатывают моющим раствором для удаления жировых загрязнений, после чего остатки моющего средства удаляются ветошью, смоченной водой.

7. Затем на поверхность наносят на 30 минут 0,2% раствор ДП-2Т. Остатки дезинфицирующего средства тщательно удаляют ветошью, смоченной водой.

8. После завершения указанной обработки проводят обеззараживание влажных поверхностей ультрафиолетовым излучением в течение 1 часа.

9. Мероприятия, описанные в п.п.7 и 8, повторяют еще раз.

10. Каждый последующий этап обработки проводят в новой одноразовой одежде (халат, шапочка, бахилы, перчатки) с использованием новой ветоши. Для удаления остатков нанесенных на поверхность дезинфицирующих средств ветошь тщательно прополаскивают в чистой воде, обрабатываемую поверхность протирают несколько раз. После каждого этапа обработки ветошь утилизируют.

11. По завершению деконтаминации берут повторные смывы, которые исследуют на наличие ПК возбудителей инфекционных заболеваний, диагностика которых наиболее часто осуществляется в данной лаборатории, а также на выявление НК возбудителей, имеющих короткие – менее 300 п.н. -специфические продукты амплификации (длина специфического фрагмента указана в инструкциях к тест-системе).

12. Для проведения смывов стерильный зонд с ватным тампоном смачивают в ТЕ-буфере (10 mM Tris, mM ЭДТА) и вращательными движениями протирают рабочие поверхности оборудования, мебели дверных ручек, косяков, телефонов и т.п., особое внимание уделяя помещениям совместного посещения работников зоны детекции, продуктов амплификации и других сотрудников лаборатории (столовая, санузел и т.п.). После взятия смыва зонд вращают в течение 10-15 секунд в пробирке типа «эппендорф» с 300-400 мкл ТЕ-буфера, избегая разбрызгивания раствора, и, отжав избыток жидкости о стенки пробирки, удаляют.

13. В случае получения в образцах смывов положительных результатов ПЦР– анализа обработку повторяют.

14. Загрязненный расходный материал (пробирки, наконечники и т.п.) утилизируют.

Проведение ПЦР исследований до завершения деконтаминационных мероприятий не допускается.

РАЗДЕЛ Принципы лабораторной диагностики

СОДЕРЖАНИЕ

I. Лекция. Эпидемическая ситуация по ВИЧ-инфекции в Центральной Азии.

Цель занятия: дать информацию об эпидемиологической ситуации в мире и странах Центральной Азии.

Задачи: по окончании занятия участники должны быть информированы об эпидемиологической ситуации в мире и странах Центральной Азии.

РАЗДЕЛ 3.

Принципы лабораторной диагностики Основные принципы лабораторной диагностики Первый принцип – «принцип выбора направления поиска».

На основании клинического обследования больного определяется круг заболеваний для осуществления дифференциальной диагностики. Существует достаточно небольшое количество болезней, имеющих настолько характерные проявления, что диагноз ставится только на выявлении этих симптомов. Чаще приходится методом исключения отвергать на основании получения результатов тех или иных исследований похожие по своим проявлениям заболевания. С другой стороны плох тот врач, который проводит обследование «на все». Поэтому как малый, так и слишком большой «круг дифференцируемых заболеваний» в общем – то зависит от опыта врача и с этим необходимо согласиться, так как не могут быть все врачи одинаково хорошими специалистами.

Второй принцип «достаточности».

Объем проводимого обследования, и перечень исследований на этапе дифференциальной диагностики должен быть ограничен только высокоинформативными методами, позволяющими отвергнуть или выявить то или иное заболевание из круга подозреваемых. Принцип – много не бывает и чем больше, тем лучше не может быть оправдан на этом этапе обследования больного, хотя бы по той причине, что все равно нельзя провести все существующие методы исследования из-за ограничения временем, финансами, доступностью некоторых исследований для больного и врача.

Третий принцип – «принцип сомнения».

Именно сомнения, но не отрицания. При получении результатов, намеченных исследований и инструментального обследования больного, часто возникает ситуация наличия взаимоисключающих фактов, требующих осуществления их анализа. Кроме того, из-за несовершенства диагностических методов возможны и ложные результаты проведенного исследования. Для разрешения этих диагностических проблем, необходимы дополнительные диагностические мероприятия.

Четвёртый принцип – «принцип жестокости».

Если какие-то диагностические процедуры необходимы для постановки или уточнения диагноза и не проведение их может повлиять на результат диагностики – они должны быть осуществлены. Иногда это достаточно дорогостоящие мероприятия, но если ожидаемые результаты являются значимыми – они должны быть проведены, т.к. в противном случае отсутствие этих данных повлияет на диагноз и лечение.

Пятый принцип – «принцип динамизма».

Выявленные изменения, или данные обследования под влиянием времеРАЗДЕЛ 3.

ни и лечения подвергаются изменениям. Эти изменения должны быть вовремя обнаружены и зафиксированы, и в тех случаях, когда они отличаются от закономерного ожидаемого изменения в том или ином случае – должны быть учтены для изменения диагноза (стадии, степени тяжести, наличие осложнений, переход в хроническое течение и т.д.). Поэтому для мониторинга этих изменений применяются те же методы, что и при первичном обследовании, но, кроме того, и дополнительные, которые ранее не использовались (на ранних этапах они были неинформативны).

Шестой принцип – «принцип преемственности»

Лабораторные исследования, как первичного, так и уточняющего характера должны осуществляться по возможности в одной лаборатории или в одной лабораторной системе в соответствии с принятыми алгоритмами исследования. Такой подход позволяет проводить сравнение полученных результатов, так как в настоящее время в разных учреждениях могут использоваться отличающиеся друг от друга методики лабораторных исследований. Мало того, что они отличаются по цифровым (или иным) показателям полученных результатов, они могут быть основаны на различных принципах выявления тех или иных показателей.

Diagnostics – способный распознавать Лабораторные анализы выполняются практически у всех больных, т.е. значительно чаще, чем другие дополнительные методы обследования пациента. В мировой практике суммарная стоимость лабораторных исследований занимает первое место среди диагностических исследований.

Методы лабораторной диагностики применяют главным образом для подтверждения клинического диагноза или его уточнения, установления причины болезни, для характеристики формы, тяжести течения и определения прогноза болезни, для выбора этиологической и патогенетической терапии, контроля за результатами лечения, а также для обнаружения патологии при скрининговых исследованиях в диспансеризируемых контингентах населения. Эти цели определяют содержание лабораторной диагностики как самостоятельного раздела медицины, основными задачами которого являются:

1. разработка методов лабораторных исследований;

2. разработка требований к качеству выполнения аналитических методов и средств обеспечения этих требований;

3. изучение закономерных связей лабораторно выявляемых патологических отклонений с клиническими изменениями у пациента;

4. установление диагностической и прогностической ценности отдельных лабораторных тестов и их комбинаций;

5. разработка алгоритмов диагностики их страновая адаптация.

РАЗДЕЛ 3.

Принципы лабораторной диагностики Задачи выполняются специалистами лабораторного дела и совместно с клиницистами.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |

Похожие работы:

«_ НАУЧНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ  УДК 620.179.1 Мониторинг технического состояния в проблеме обеспечения техногенной безопасности. Обратная задача Structural Health Monitoring in the Problem of Anthropogenic Safety Provision. Stateof theart Венгринович В.Л. Vengrinovich V.L. В статье излагается современное состояние проблемы мониторинга технического состояния потенциально опасных промышленных объектов с целью обеспечения их безопасности. Особое внимание уделено принципиальным вопросам обработки...»

«Инструкции Бензиновый воздушный 3A0773D компрессор AirMax RU -для сжатия воздухадля применения вне помещенийВАЖНЫЕ ИНСТРУКЦИИ ПО ТЕХНИКЕ БЕЗОПАСНОСТИ Прочтите все предупреждения и инструкции в настоящем руководстве. СОХРАНИТЕ ИХ. Модель Мощность (в л.с.) Максимальное рабочее и марка двигателя давление фунт на кв. МПа бар дюйм 1310G 200 куб. см. Honda 125 0,86 8,6 1720G 270 куб. см. Honda 175 1,21 12,1 PROVEN QUALITY. LEADING TECHNOLOGY. 37- СОДЕРЖАНИЕ Детали компрессора Важная информация 262360...»

«S/2009/611 Организация Объединенных Наций Совет Безопасности Distr.: General 30 November 2009 Russian Original: English Шестой доклад Генерального секретаря об Объединенном представительстве Организации Объединенных Наций в Бурунди I. Введение 1. Настоящий доклад представляется в соответствии с резолюцией 1858 (2008) Совета Безопасности, в которой Совет продлил мандат Объединенного представительства Организации Объединенных Наций в Бурунди (ОПООНБ) до 31 декабря 2009 года и просил меня...»

«Рабочая тетрадь по фармацевтической химии Фармацевтическая химия Ч АСТ Ь 1 ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ соединений; совершенствование ВВЕДЕНИЕ И ОБЩЕ оценки качества лекарственных ХИМИЯ, изучает способы полуФАРМАКОПЕЙНЫЕ средств для обеспечения их максичения лекарственных средств, их МЕТОДЫ АНАЛИЗА мальной терапевтической эффекбиологическую активность, физитивности и безопасности; исследоческие и химические свойства, а вание и разработка методов аналитакже методы качественного и за лекарственных веществ в...»

«Проект ИУВР-Фергана ОТЧЕТ О СЕМИНАРЕ ОПЫТ И ВОПРОСЫ УЧАСТИЯ СТЕЙКХОЛДЕРОВ В РУКОВОДСТВЕ ВОДОЙ В ЗОНЕ ПИЛОТНЫХ КАНАЛОВ (ВОЗ, ПИТЬЕВОЕ ВОДОСНАБЖЕНИЕ, МЕЛИОРАЦИЯ, СТИМУЛИРОВАНИЕ ВОДОСБЕРЕЖЕНИЯ И СОБИРАЕМОСТИ ПЛАТЫ ЗА УСЛУГИ УК) по позиции: А1.1 Завершение (в возможной степени) гидрографизации и вовлечение других стейкхолдеров на трех пилотных каналах Со-директор проекта ИУВР-Фергана от ИВМИ Х. Мантритилаке Со-директор проекта ИУВР-Фергана от НИЦ МКВК, проф. В.А. Духовный Региональный координатор...»

«Автономная некоммерческая организация Центральный научноисследовательский институт трансфузионной медицины и медицинской техники Юридический адрес: 123182, Москва, ул. Щукинская, д.6, корп.2 тел/факс 190-2241 Универсальные технологии генотестирования донорской крови и других клинических материалов на патогены Москва 2005 г. 2 Аннотация Для повышения инфекционной безопасности трансфузионной терапии в крови доноров определяют наличие нуклеиновых кислот, составляющих геном гемотрансмиссивных...»

«ThinkCentre: Руководство по технике безопасности и гарантии Замечание: Перед тем, как воспользоваться этой информацией и самим продуктом, обязательно прочтите и осознайте следующее: v Глава 1, “Важная информация по технике безопасности”, на стр. 1 v Глава 5, “Ограниченная гарантия Lenovo”, на стр. 31 v Глава 8, “Замечания”, на стр. 51 Первое издание (ноябрь 2008) © Copyright Lenovo 2008. Содержание Глава 1. Важная информация по технике безопасности......1 Состояния, требующие немедленных...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ГОСТ Р СТАНДАРТ 53254— 2009 РОССИЙСКОЙ Ф Е Д Е РА Ц И И ТЕХНИКА ПОЖАРНАЯ. ЛЕСТНИЦЫ ПОЖАРНЫЕ НАРУЖНЫЕ СТАЦИОНАРНЫЕ. ОГРАЖДЕНИЯ КРОВЛИ. Общие технические требования. Методы испытаний Издание официальное Москва Стандартинформ ГОСТ Р 53254— Предисловие Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ О техническом регулировании, а правила применения...»

«Директор Департамента государственной политики и регулирования в области геологии и недропользования Минприроды России А.В. Орёл утвердил 26 декабря 2013 г УТВЕРЖДАЮ Директор Департамента государственной политики и регулирования в области геологии и недропользования Минприроды России _ А.В. Орёл _ 2013 г СОГЛАСОВАНО Директор ФГУНПП Геологоразведка В.В. Шиманский __ 2013 г. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Научно-методического Совета по геолого-геофизическим технологиям поисков и разведки твердых полезных ископаемых...»

«ОРГАНИЗАЦИЯ ОБЪЕДИНЕННЫХ НАЦИЙ Совет Безопасности Distr. GENERAL S/20147 24 August 1988 RUSSIAN ORIGINAL: ENGLISH ДОКЛАД МИССИИ, НАПРАВЛЕННОЙ ГЕНЕРАЛЬНЫМ СЕКРЕТАРЕМ В ЦЕЛЯХ ОЗНАКОМЛЕНИЯ С УСЛОВИЯМИ, В КОТОРЫХ НАХОДЯТСЯ ВОЕННОПЛЕННЫЕ В ИСЛАМСКОЙ РЕСПУБЛИКЕ ИРАН И ИРАКЕ Записка Генерального секретаря 1. Заместитель премьер-министра и министр иностранных дел Ирака в своих письмах на имя Генерального секретаря от 2 июля 1988 года (S/19980 и Согг.1, приложение) и 7 июля 1988 года (S/19993,...»

«Service. Пособие по программе самообразования 310 Автомобиль Transporter модели 2004 года 1950 В марте 1950 года было начато серийное производство автомобилей VW Trans porter, выпускаемых первоначально в количестве 10 штук в день. Двигатель и подвеска этого автомобиля были заимст вованы у серийного автомобиля Жук. К особенностям нового автомобиля сле дует отнести несущий кузов, усиленный снизу лонжеронами и поперечинами, и привод на задние колеса от установлен ного сзади двигателя. 1967...»

«Руководство по установке и эксплуатации Преобразователь ток-давление CPC-II 9907-1100, 9907-1102, 9907-1103, 9907-1105, 9907-1106 Руководство RU26448 (Редакция C) ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: ОПАСНОСТЬ ТРАВМИРОВАНИЯ ИЛИ СМЕРТИ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: СЛЕДУЙТЕ ИНСТРУКЦИЯМ Перед выполнением установки, технического обслуживания или эксплуатации данного оборудования необходимо полностью ознакомиться с настоящим руководством и всеми остальными публикациями, содержащими инструкции по соответствующим работам. Соблюдайте...»

«Химия и Химики №3 (2009)   Литпортал Системы оружия двадцать первого века или Эволюция вверх ногами (WEAPON SYSTEMS OF TWENTY-FIRST CENTURY OR THE UPSIDE-DOWN EVOLUTION) Станислав Лем Получив — как именно, я говорить не вправе, — доступ к сочинениям по военной истории XXI века, я прежде всего задумался, как бы получше скрыть полученные таким образом сведения. Это было для меня важнее всего, ведь я понимал, что тот, кто знает эту историю, подобен беззащитному открывателю клада: вместе с кладом...»

«Лаборатория ADR Удобрения на основе нитрата аммония Электронное пособие Перевод с английского А.Е. Пахно, С.К. Казарская Донецк 2011 1 ОГЛАВЛЕНИЕ Предисловие...................................3 Часть 1. Сфера охвата и структура пособия..............5 Часть 2. Официальный текст типовых правил............. 7 Часть 3. Логическая схема......................... 10 Часть 4. Примечания к логической схеме..........»

«S/2012/510 Организация Объединенных Наций Совет Безопасности Distr.: General 29 June 2012 Russian Original: English Доклад Генерального секретаря о деятельности Отделения Организации Объединенных Наций для Западной Африки I. Введение 1. В письме от 20 декабря 2010 года (S/2010/661) Председатель Совета Безопасности сообщил мне о том, что члены Совета согласились продлить мандат Отделения Организации Объединенных Наций для Западной Африки (ЮНОВА) до 31 декабря 2013 года и просил меня сообщать...»

«Теоретические, организационные, учебно-методические и правовые проблемы ПРАВО В ОБЕСПЕЧЕНИИ МЕЖДУНАРОДНОЙ ИНФОРМАЦИОННОЙ БЕЗОПАСНОСТИ Д.т.н., д.ю.н., профессор А.А. Стрельцов (Аппарат Совета безопасности России), д.полит.н., профессор А.В. Крутских (МИД России) Интенсивное развитие информационных технологий (ИТ) и их широкое применение во всех сферах деятельности человека создало условия для активизации постиндустриального развития человечества, формирования глобального информационного...»

«PP1/03/2006/EXT/SH РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОБРАЩЕНИЮ С ЛИЦАМИ, ИЩУЩИМИ УБЕЖИЩА И БЕЖЕНЦАМИ ИЗ ИРАКА В ЕВРОПЕ Апрель 2007 г. I. Введение Европейский совет по делам беженцев и изгнанников (ECRE) является сетью из 76 организаций в 30 европейских государствах. Этот документ является реакцией на обращение с лицами, ищущими убежища и беженцами из Ирака в Европе. 1 Множество иракцев в Европе находятся под угрозой возвращения в Ирак на основании того, что будут находиться в безопасности в некоторых областях,...»

«СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СКАНЕРОВ БЕЗОПАСНОСТИ ЧАСТЬ 1 ТЕСТ НА ПРОНИКНОВЕНИЕ Автор исследования Лепихин Владимир Борисович Заведующий лабораторией сетевой безопасности Учебного центра Информзащита Все материалы отчета являются объектами интеллектуальной собственности учебного центра Информзащита. Тиражирование, публикация или репродукция материалов отчета в любой форме запрещены без предварительного письменного согласия Учебного центра Информзащита Copyright © 2008, Учебный центр Информзащита...»

«УВКБ ООН Агентство ООН по делам беженцев РУКОВОДСТВО УВКБ ООН ПО СООТВЕТСТВИЮ КРИТЕРИЯМ ПРИ ОЦЕНКЕ ПОТРЕБНОСТЕЙ В МЕЖДУНАРОДНОЙ ЗАЩИТЕ ЛИЦ ИЗ ЭРИТРЕИ, ИЩУЩИХ УБЕЖИЩЕ Управление Верховного комиссара ООН по делам беженцев (УВКБ ООН) 20 апреля 2011 г. HCR/EG/ERT/11/01 ПРИМЕЧАНИЕ Руководство УВКБ ООН по соответствию критериям издается Управлением как пособие для сотрудников, принимающих решения, в том числе для сотрудников УВКБ ООН, правительств и частнопрактикующих лиц в проведении оценки...»

«FB2:, 18.12.2009, version 1.0 UUID: 46f03e64fbaa378f38bd905715c3861f PDF: fb2pdf-j.20111230, 13.01.2012 Андрей Кадник Новатор Содержание Краткое содержание первой книги Новатор (книга вторая) #3 Кадник Андрей Новатор Краткое содержание первой книги ДВернувшись в школу после летных каникул, Дима обнаруживает повышенный интерес к своей возлюбленной соненавистным ему хулиганом Цацкимитрий Санцев — заурядный школьник из российской провинции влюблён в одноклассницу Танечку и терзаем ным. стороны...»







 
© 2014 www.kniga.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Книги, пособия, учебники, издания, публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.