WWW.KNIGA.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Книги, пособия, учебники, издания, публикации

 

Pages:   || 2 | 3 |

«(ПОСОБИЕ ДЛЯ ВРАЧЕЙ) Москва – 2004 СОДЕРЖАНИЕ Введение История открытия Helicobacter pylori Эпидемиология H.pylori-инфекции Биологические свойства Helicobacter pylori ...»

-- [ Страница 1 ] --

«Helicobacter pylori - инфекция» 1

НИИ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ Министерства здравоохранения РФ

Научно-производственная фирма «ЛИТЕХ»

Научный Центр Здоровья Детей

Центральная Клиническая Больница МЦ УД Президента РФ Л.В. Кудрявцева, П.Л. Щербаков, И.О. Иваников, В.М. Говорун

HELICOBACTER PYLORY- ИНФЕКЦИЯ:

СОВРЕМЕННЫЕ АСПЕКТЫ ДИАГНОСТИКИ

И ТЕРАПИИ

(ПОСОБИЕ ДЛЯ ВРАЧЕЙ)

Москва –

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

История открытия Helicobacter pylori

Эпидемиология H.pylori-инфекции

Биологические свойства Helicobacter pylori

Диагностика H.pylori-инфекции

Инвазивные методы диагностики H.pylori-инфекции

Неинвазивные методы диагностики H.pylori-инфекции

Генотипирование Helicobacter pylori

Диагностика бактерий рода Helicobacter в камнях

Биологические аспекты резистентности Helicobacter pylori к антибактериальным препаратам..... Эрадикационная терапия

Основные группы препаратов, применяемые для эрадикации Нelicobacter рylori

Схемы современной эрадикационной терапии и их клиническая оценка

Экономические аспекты антихеликобактерной терапии

Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

H. pylori - Helicobacter pylori C.pylori - Campilobacter pyloridis CLO - кампилобактер-подобные организмы СОЖ - слизистая оболочка желудка НПВС – нестероидные противовоспалительные средства ИЛ - интерлейкины ИССО - иммунная система слизистых оболочек ПЦР – полимеразная цепная реакция БУТ – быстрый уреазный тест УДТ – уреазный дыхательный тест ФРФ - фактор роста фибробластов ЭФР - эпидермальный фактор роста ГЭРБ – гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь ЯБЖ – язвенная болезнь желудка ЯБДК – язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки ЭГДС – эзофагогастродуоденоскопия MALT – mucosa-associated lymphoid tisue

ВВЕДЕНИЕ

История открытия Helicobacter pylori Открытие Helicobacter pylori (Н.pylori) и его определяющей роли в пато-генезе хронического гастрита, язвенной болезни и рака желудка, сделанное австралийскими учеными B.Marshall и I.Warren в 1983 году, явилось поистине революционным. Оно позволило выйти на разработку новых, более эффективных этиопатогенетических принципов лечения и профилактики этих заболеваний.

Впервые идея об инфекционном развитии гастродуоденальной патологии возникла в конце ХХ века, когда в желудке животных были обнаружены спиралевидные бактерии. В 1893 году G. Bizzozero выявил спиралевидные бактерии в париетальных клетках желудка собак. В 1896 году H. Salomon установил, что эти бактерии могут передаваться от зараженных мышей кошкам и собакам.

«Helicobacter pylori - инфекция» Первые описания спиралевидных бактерий в желудке человека принадлежат W. Krienitz (1906) и A. Luger (1917), которые обнаружили их на изъязвившейся карциноме желудка. В 1938 году J.L. Doenges, исследуя аутопсийный материал, обнаруживает «спирохеты» в 43% случаев в желудках людей. Однако, эти исследования, проводившиеся на секционном материале, не позволяли качественно оценить аутоптат из-за аутолиза слизистой оболочки желудка и развития посторонних микроорганизмов. Дальнейшие исследования проводятся на операционном и биопсийном материалах. В 1940 году S. Freedberg и L. Barron обнаружили «спирохеты» в 37% случаев в желудках, резецированных по поводу язвенной болезни и карциномы. В 1954 году E.D. Palmer описал спиралевидные бактерии и их локализацию на большом гастробиопсийном материале. Однако при этом он, к сожалению, сделал ошибочный вывод, полагая, что данные микроорганизмы, явлются контаминантами, носят непатогенный характер, колонизируя только на пораженной слизистой оболочке желудка, попадая в него из полости рта.

Более подробное описание бактерий желудка человека было опубликовано в 1975 году в работе H.W. Street «Ультраструктура клеток, мигрирующих через эпителий желудка и их отношение к бактериям», который исследуя микрофлору гастробиоптатов больных язвенной болезнью желудка в 80% наблюдений обнаружил в них Pseudomonas aeruginosa. В 1979 году W. P. Fung с группой исследователей описали спиралевидные бактерии в биоптатах больных с хроническим гастритом, вновь указав на признаки воспаления слизистой оболочки желудка в участках их колонизации.

Начиная с 1852 года, когда впервые в желудке животных была обнаружена уреаза, в литературе появляются работы, связанные с ее изучением. В них указывается на связь между уреазной активностью слизистой оболочки желудка и язвенной болезнью (O.Fitzgerald и P.Murhy, 1954), а также сделано предположение о бактериальной природе уреазы желудка человека. Но, к сожалению, в тот момент источник фермента найден не был.

Итак, к 1980-ым годам накопилось достаточно знаний, указывающих на инфекционную природу хронического гастрита, язвенной болезни и рака желудка.

В период с 1979 по 1981 годы австралийский патологоанатом R. Warren, изучающий биопсийный материал с морфологическими признаками активного гастрита, описывает спиралевидные бактерии, похожие на Campylobacter jejuni, и называет их кампилобактер-подобные организмы (CLO). После чего, гастроэнтеролог B. Marshall, сопоставив клинические данные и морфологические изменения слизистой оболочки желудка (СОЖ), высказывает предположение, что этот микроорганизм может являться причиной развития активного гастрита у людей. Свою гипотезу, в последующем, он подтвердит, выпив чистую культуру этого микроорганизма. В 1982 году B.J.Marshall и J.R.Warren удается из биопсийного материала, взятого из пилорического отдела желудка человека с активным гастритом, культивировать на стандарт-ной кампилобактерной среде бактерии, которые по своим морфологическим и биохимическим свойствам были похожи на бактерии рода Campylobacter. Выделенный микроорганизм был назван Campylobacter pyloridis (C.pylori). Свои результаты B.J.Marshall и J.R.Warren впервые доложили на Втором международном рабочем совещании по изучению кампилобактериозной инфекции в Брюсселе и в том же 1983 году опубликовали в журнале Lancet. В 1989 году C.S.Goodwin и группа ученых окончательно идентифицировали бактерию, дав ей название Helicobacter pylori, а в году был полностью расшифрован ее геном.

Таким образом, в 1983 году была открыта новая страница в изучении этиопатогенетических механизмов развития хронических воспалительных процессов СОЖ и подтверждена правильность инфекционной теории развития гастрита и язвенной болезни. Активизировались исследования вокруг этой проблемы в различных областях медицины патоморфологии, гастроэнтерологии, микробиологии, иммунологии, генетики, эпидемиологии и фармакологии. В различных странах возникли группы по изучению Helicobacter pylori, в частности, в1987 году – Европейская и в 1995 году – Российская группы. Ежегодно проводятся международные конференции, формирующие научно-исследовательские программы по созданию современных технологий и промышленного производства новых диагностических и лекарственных средств.

Изучение патогенных свойств H.pylori привело к переосмыслению взглядов на патогенез и принципы лечения не только хронического гастрита и язвенной болезни, но и аденокарциномы и экстранодальной В-клеточной MALTлимфомы. Установлена прямая зависимость клинической манифестации и частоты рецидивирования хронического гастрита, язвенной болезни и прогрессирования предраковых состояний от степени обсемененности H.pylori слизистой оболочки желудка. По оценке D. Forman (1996), до 75% случаев рака желудка в развитых странах, и около 90% - в развивающихся странах связано с H.pylori-инфекцией. В 1994 году Международное агентство по изучению рака (IARK) отнесло хеликобактерную инфекцию к канцерогенам первого порядка.

В отечественной литературе все большее распространение получает понятие «хеликобактериоз» - по анологии с другими терминами (например – кампилобактериоз, эшерихиоз), принятыми в инфекционной патологии. Многие зарубежные авторы предпочитают использовать понятие «заболевания, ассоциированные с H.pylori». Эти понятия не вполне однозначны, хотя принадлежат к одной и той же области гастродуоденальной патологии.

В 1993 году Н.В. Сафонова и А.Б. Жебрун дали, на наш взгляд, наиболее полное определение этой группе заболеваний: «хеликобактериоз» - это хроническая инфекция, вызываемая патогенными микроорганизмами рода хеликобактер и отличающаяся преимущественной локализацией возбудителя в слизистой оболочке желудка и двенадцатиперстной кишки.

Стремительное накопление теоретических знаний о хеликобактериозе, сопровождается, к сожалению, заметным отставанием в их внедрении в повседневную врачебную практику. В итоге этот разрыв нередко оборачива-ется ошибками в диагностике и выборе тактики лечения H.pylori - инфекции.

Многочисленные эпидемиологические исследования выявили широкое распространение H.pylori-инфекции - ей подвержено около 60 % населения планеты. D.Y. Graham называл H.pylori-инфекцию одной из наиболее часто встречающихся инфекций человека.

К настоящему времени установлено, что существуют два варианта распространенности H.pylori. Согласно первому варианту, характерному в основном для развивающихся стран (Нигерия, Чили, Бразилия, Перу, Таиланд, Саудовская Аравия и др), H.pylori выявляется с высокой частотой уже в детском возрасте до 90%, а к 30-ти годам H.pylori инфицировано почти все население. При другом варианте распространенности H.pylori идет постепенное нарастание инфицированности с возрастом человека - у детей в 5-15 % случаев, а у взрослых в 20-65%. Этот вариант распространенности H.pylori встречается в основном в развитых странах – Финляндии, США, Бельгии, Италии, Франции (П.Л. Щербаков, 1999; R.E. Poundeyr, 1995; S. Pretolani,1997).

Инфицирование в подавляющем большинстве случаев происходит в детском возрасте, при этом имеет место так называемый эффект “возрастных когорт” - люди, рожденные в определенный год (возрастная когорта) имеют определенный риск заражения H.pylori, отличающийся от него в другом поколении. В соответствии с эффектом «возрастных когорт» можно объяснить поразительное снижение частоты инфицирования H.pylori за последние десятилетия в некоторых странах.

Существует мнение, что этнические различия могут отражаться на частоте инфицированности населения H.pylori.

Так, при обследовании негритянского и испанского населения инфицированность H.pylori негритянского населения составила 76%, а белого – 26%. В Новой Зеландии среди выходцев из Танзании инфицированность H.pylori была 70%, из Саома – 44%, а среди европейцев – 15% (A. Morris, 1986). Интересные результаты были получены при обследовании двух независимых популяций в Папуа Новая Гвинея. Так, у жителей побережья антитела против H.pylori были найдены в 2%, а у жителей горной части страны – в 20% (B. Dwuer, 1988). И все же значение этого фактора до настоящего времени остается дискутабельным. Так, например, у детей-турок, проживающих на юге Турции обсемененность H.pylori составила 72%, а проживающих в Германии - 64%.

H.pylori-инфекция носит персистентный характер. Однако лишь часть инфицированных заболевает манифестными формами хеликобактериоза. Причины этого кроются, как предполагают, в неполной диагностике заболевания, особенностях реактивности макроорганизма и/или в различиях вирулентности возбудителя.

Данные о гетерогенности выделяемых штаммов H.pylori уже накапливаются в литературе. Имеются доказательства существования различных генотипов H.pylori которые, возможно, различны по факторам вирулентности.

В настоящее время изучается вопрос о возможности дифференциации различных штаммов H.pylori на основании их гетерогенности по факторам вирулентности.

Источником инфекции является человек. Жизнеспособные штаммы H.pylori выделены из содержимого желудка, двенадцатиперстной кишки, пищевода, фекалий людей с активным гастритом и язвенной болезнью. Не исключается также участие и других приматов в эпидпроцессе, обсуждается, но подвергается сомнению роль домашних животных (свиней, рогатого скота) и продовольственных продуктов из мяса и молока этих животных в передаче H.pylori.

Пути передачи возбудителя Наиболее изученным является контактный механизм передачи инфекции от больного человека или бактерионосителя орально-оральным или фекально-оральным путем. Возможен также механизм передачи инфекции через грязные руки.

Высказываются предположения о наличии трансплацентарного пути передачи хеликобактерной инфекции, на что указывает обнаружение специфических антител к H.pylori в крови новорожденных детей, однако с возрастом их титр снижается вследствие проницаемости плацентарного барьера для этих антител.

В настоящее время получены четкие доказательства ятрогенной передачи H.pylori-инфекции от пациента к пациенту через медицинские инструменты (при гастроскопии и других видах инструментального исследования желудка и двенадцатиперстной кишки) – в тех случаях, когда не учитывается инфекционная этиология заболеваний желудка и не принимаются должные меры по обеззараживанию инструментов.

Наиболее вероятные факторы передачи – вода и пища. Несмотря на свою лабильность в условиях искусственного культивирования, H.pylori способен выживать в охлажденной речной воде в течение нескольких дней.

Имеются данные о возможности выживания H.pylori в зубном налете, слюне, рвотных массах и желудочном соке.

Группы риска Высокий уровень инфицированности населения определяется, прежде всего, неудовлетворительными социальноэкономическими условиями жизни в детстве. Факторами риска являются перенаселенность жилых помещений, общие кровати, отсутствие достаточного количества горячей воды.

Контингентами риска являются семьи хеликобактер-позитивных больных, медицинский персонал гастроэнтерологических клиник (хирурги, эндоскописты, обслуживающий персонал), контингенты специнтернатов, психиатрических стационаров, детских домов.

Обсуждается также влияние характера питания на инфицирование H.pylori. По данным ряда авторов, у вегетарианцев H.pylori обнаруживается значительно реже, чем у людей, употребляющих мясную пищу, однако имеются сообщения, опровергающие это утверждение.

Выделенные спиральные и изогнутые бактерии из биоптатов СОЖ больных антральным гастритом и язвенной болезнью первоначально были классифицированы как C.pylori на основе морфологической (изогнутые, подвижные, грамотрицательные микробы), физиологической (микроаэрофилы, асахаролитические, муколитические) и экологической (адаптированы к жизни в слизистой желудка) характеристик (C. Goodvin, 1989; 1990).

Однако дальнейшие исследования в области таксономии (ультраструктуре) C.pylori отчетливо показали значительные отличия их от рода Campylobacter по следующим параметрам: последовательности аминокислотных остатков в 5S и 16S РНК, составу дыхательных хинонов и высших жирных кислот клетки, структуре белков наружной мембраны, степени гомологии ДНК и особенностям чувствительности к антибиотикам. Изучение фенотипических и ультраструктурных критериев C.pylori и, другого тесно связанного с ним рода, Wolinella, также выявило значительные отличия по профилю клеточных жирных кислот, ростовым характеристикам и ферментативным возможностям. Все это не позволило отнести новый выделенный микроорганизм ни к роду Campylobacter, ни к роду Wolinella, поэтому был образован новый род, получивший название Helicobacter (helix – спираль, bacter - палочка), а изучаемый микроорганизм был назван Helicobacter pylori (J. Fox, 1987; M. Lambert, 1987; P. Lau, 1987; L.Thomson, 1988).

Helicobacter pylori – мелкие, грамотрицательные, неспорообразующие, микроаэрофильные бактерии, в форме изогнутой, S-образной или слегка спиральной формы.

В настоящее время описано 24 вида хеликобактеров, некоторые из них ранее были известны под другими наименованиями (Fox J.2004).

Стареющие бактериальные клетки утрачивают типичную спиралевидную форму и переходят в кокковую (тип 1).

Дегенеративные изменения в кокковую форму могут происходить и при неблагоприятных воздействиях факторов внешней среды (изменение температуры или рН) или неправильном применении антибиотиков (тип 2). Кокковые формы 2 типа теряют фермента-тивную активность и репродуктивную способность, у них редуцируется обмен веществ, что создает благоприятные условия для их сохранения в кишечнике и во внешней среде, откуда они могут передаваться человеку фекально-оральным путём. Попав в желудок, H.pylori вновь трансформируется в спиралевидные, активные формы, способные колонизировать СОЖ.

Кокковидные формы H.pylori имеют огромное значение для диагностики H.pylori-инфекции. Их наличие может привести к ошибкам в диагностике, поскольку эти формы не культивируются, не имеют характерных признаков при световой микроскопии, не продуцируют уреазу или продуцируют ее в малых количествах, способны экспрессировать другие антигены (G. Bode, 1993; L. Cellini 1994).

Толщина бактерии 0,5-1,0 мкм, длина 2,5-3,5 мкм. Бактериальная клетка покрыта гладкой оболочкой, на одном из полюсов имеет 1-6 мономерных жгутиков.

Наличие жгутиков, а также гладкой клеточной оболочки и спиралевидной формы, позволяет этому микроорганизму передвигаться в толще слизи вдоль градиента рН и служит одним из факторов его вирулентности. Кроме того, жгутики способствуют аггрегации H.pylori для колонизации их на эпителиальной поверхности СОЖ (С.Г Довгаль, 1993; М.А.

Рожавин, 1989; R. Sidebothman, 1990) Клеточная стенка H.pylori гладкая, к наружи от ее мембраны определяется электронноплотный гликокаликс (капсулоподобная оболочка) толщиной более 40 нм с радиальной цикличностью около 14 нм, в его состав входят углеводсодержащие полимеры, необходимые для адгезии H.pylori на поверхности эпителиоцитов. Наиболее прочно H.pylori связывается с экстрактом глицеролипидов (сульфатированным алколацил-глицеролипидом) эпителиальных клеток антрального отдела СОЖ, являющимся специфическим рецептором для H.pylori и объясняет его родство к пилорическому отделу желудка.

Наиболее благоприятными условиями для жизни, роста и размножения микроорганизма считаются: температура оС и рН среды 4,0-6,0, хотя они выживают и при рН 2,5. В ходе эволюции, бактериальная клетка приобрела + жизненноважные физиологические свойства, позволяющие ей активно функционировать при «неблагоприятных»

условиях.

H.pylori имеет достаточно широкий набор факторов патогенности, большинство из которых хорошо адаптированы к условиям паразитизма этого микроорганизма в желудке, обеспечивая ему выживание в кислой среде желудочного содержимого и колонизацию слизистой оболочки.

H.pylori продуцируют высокоактивный фермент уреазу, каталазу, муциназу, оксидазу, гемолизин, щелочную фосфатазу, гамма-глутамилтрансферазу, алкогольдегидрогеназу, глюкосульфосфатазу, протеазу, фосфолипазу, белок – ингибитор секреции соляной кислоты, многочисленные адгезины (к цитоскелету, клеточной мембране, ламинину, холестеролу), цитотоксины белковой природы и др. (Л.И. Аруин, 1990; А.Б. Жебрун, 1993; R. Sidebothman, 1990).

При столь широком спектре ферментативной активности H.pylori не содержит ферментов, метаболизирующих углеводы. Метаболизм бактериальной клетки обеспечивается энергией, освобождающейся при утилизации трикарбоновых кислот или/и аминокислот, но не углеводов, к окислению которых он не способен.

Реализация факторов патогенности H.pylori запускает целый ряд механизмов патогенеза инфекции: деструктивные процессы на молекулярном, клеточном и тканевом уровне, цитотоксические эффекты, нарушение секреции, компенсаторные реакции желез, интенсивную воспалительную реакцию с преобладанием нейтрофильной инфильтрации и большим числом в слизистой оболочке плазматических клеток, продуцирующих IgA (В.А. Исаков, 2003).

Бактерии рода Helicobacter и источники их выделения H.muridarum крысы, мыши кишечник (нормофлора, колит) Queiroz D (1992) H.cholecystus сирийские хомяки камни желчного пузыря Franklin C. (1996) H.heilmanii кошки, собаки желудок (нормофлора, гастрит), Lee A. (1993) H.bizzozeronii кошки, собаки желудок (нормофлора, гастрит), Hanninen M. (1996) (Gastrospirillum gominis 1) H.mustelae хорьки, норки желудок (аденокарцинома, MALT- Erdman S. (1997) H.salomonis кошки, собаки желудок (нормофлора, гастрит) Vandamme P. (2000) Современные данные о факторах патогенности Helicobacter pylori патогенности 1. Структура и компоненты - «гель-динамическая» (эластичная морфология бактериальной клетки - наличие жгутиков и подвижность 2. Экстрацеллюлярные факторы - уреаза 3. Способность индуцировать, -индукция фактора активации тромбоцитов активировать или стимулировать - индукция лейкотриенов целлюлярные продукты - индукция прокоагулянтной активности макроорганизма - стимуляция интерлейкинов и фактора некроза опухоли 4. Индукторы аутоиммунных реакций - наличие общих свойств H.pylori с компонентами слизистой желедка С момента открытия Н.pylori прошло чуть более 20-ти лет. За этот период времени было разработано большое количество методов диагностики, позволяющих выявлять и идентифицировать этот микроорганизм. Развитие и усовершенствование этих методов помогло в получении ценной информации об эпидемиологии хеликобактериоза, сыграло большую роль в понимании патогенеза этой инфекции. Это, в свою очередь, позволило разработать наиболее эффективные схемы противохеликобактерной терапии и мероприятия, направленные на профилактику хеликобактериоза.

Тем не менее, ни один из существующих методов диагностики Н.pylori- инфекции не универсален. Пределы возможностей этих методов могут быть ограничены не только их чувствительностью, но, зачастую зависят от возраста пациента, его индивидуальных особенностей, стадии заболевания, а также индивидуальных особенностей течения инфекции.

Все существующие на сегодняшний день методы лабораторной диагностики Н.pylori-инфекции делятся на две большие группы: инвазивные методы и неинвазивные.

- Молекулярно-биологический метод (ПЦР) - Фазово-контрасная микроскопия Все инвазивные методы диагностики Н.pylori-инфекции предусматривают проведение эндоскопического исследования с последующим взятием биопсийного материала. Неинвазивные методы включают в себя различного рода иммунологические исследования, позволяющие определять наличие антител в сыворотке крови или бактериального антигена в фекалиях, ПЦР исследование с определением ДНК Н.pylori в фекалиях и уреазный дыхательный тест с С13 или С14 меченным атомом углерода.

Принципиальное значение для практики имеет проведение диагностики Н.pylori-инфекции до лечения - первичная диагностика, и после проведения противохеликобактерной терапии - контроль эффективности выбранной схемы лечения. Принципы выбора диагностических манипуляций при Н.pylori-инфекции изложены в «Рекомендациях по диагностике и лечению Н.pylori-инфекции у взрослых при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки»

(1997, Российская группа по изучению Нelicobacter pylori).

Первичная диагностика Н.pylori-инфекции должна осуществляться методами, непосредственно выявляющими бактерию или продукты ее жизнедеятельности в организме больного. Данным требованиям удовлетворяют следующие методы диагностики:

1. Бактериологический метод: посев биоптата слизистой оболочки желудка или двенадцатиперстной кишки на дифференциально-диагностическую среду с целью выделения чистой культуры Н.pylori;

2. Гистологический метод – «золотой стандарт» диагностики Н.pylori- инфекции: окраска бактерии в гистологических препаратах слизистой оболочки желудка или двенадцатиперстной кишки по Гимзе, толуидиновым синим, Вартину-Старии, Генте;

3. Дыхательный тест: определение в выдыхаемом больным воздухе изотопов 13С или 14С ; они выделяются в результате расщепления в желудке больного меченной мочевины под действием уреазы Н.pylori;

4. Уреазный тест: определение уреазной активности в биоптате слизистой оболочки желудка или двенадцатиперстной кишки путем помещения его в жидкую гелеобразную среду, содержащую субстрат, буфер и индикатор.

При соблюдении всех правил выполнения методик и надлежащей стерилизации эндоскопической аппаратуры первичный диагноз Н.pylori- инфекции является достаточным для начала противохеликобактерной терапии при обнаружении бактерии одним из описанных методов.

Диагностика эрадикации Н.pylori (оценка адекватности проведенной противохеликобактериальной терапии) направлена на выявление вегетативных и кокковых форм Н.pylori. В «Рекомендациях» даны строгие правила по проведению этого этапа диагностики:

1. Сроки ее проведения – не ранее, чем через 4-6 недель после окончания курса противохеликобактерной терапии, либо окончания лечения любыми антибиотиками или антисекреторными средствами сопутствующих заболеваний.

2. Диагностика эрадикации осуществляется, как минимум, двумя из указанных диагностических методов, причем при использовании методов непосредственного обнаружения бактерии в биопсийном материале (бактериологический, гистологический, уреазный) необходимо исследование 2-х биоптатов из тела желудка и 1-го биоптата из антрального отдела.

Скрининг методы, позволяющие снизить стоимость диагностики Н.pylori-инфекции Для проведения скрининга чаще всего используются методы антител классов А и G в сыворотке, плазме или капиллярной крови обследуемых лиц. Наиболее изученными являются следующие серологические методы:

1. Серологический метод;

2. Экспресс-тесты на основе иммунопреципитации или иммуноцитохимии с использованием в качестве пробы капиллярной крови больных и цветовым усилением продуктов реакции.

Экспресс-тесты могут быть использованы для удешевления процесса первичной диагностики Н.pylori-инфекции, так как положительный результат теста в ясной клинической ситуации позволяет исключить дорогостоящее эндоскопическое исследование, а также использование методов непосредственной диагностики. Нельзя использовать экспресс-тесты для определения эрадикации после лечения.

Бактериологический метод Наибольшую информацию о Н.pylori возможно получить только при выделении его из прижизненных биопсийных образцов. Это единственный метод исследования, обладающий 100% специфичностью. При этом виде исследования возможно не только выделение чистой культуры Н.pylori и ее идентификация, но и изучение морфологических, биохимических и биологических свойств возбудителя. Бактериологический метод исследования дает возможность определять антибиотикорезистентность у Н.pylori и проводить за ней динамические наблюдения.

В эпидемиологической практике выделение чистой культуры Н.pylori необходимо для внутривидового типирования штаммов, что может быть использовано при мониторинге для дифференциации между реинфекцией новым штаммом и рецидивированием, которое может быть обусловлено тем же штаммом.

В научной практике бактериологический метод важен, так как позволяет изучать факторы патогенности Н.pylori и изготовлять препараты для серологической диагностики.

Как и любой метод диагностики, бактериологический метод исследования обладает не только достоинствами, но и недостатками, которые зачастую ограничивают широкое использование этого метода в клинической практике. К недостаткам этого метода относятся, прежде всего, необходимость специального оборудования лаборатории и реактивов, специальных питательных сред, а также обученных кадров специалистов. Все это сопряжено с большими материальными затратами.

Результаты бактериологического исследования отсрочены от момента взятия биопсийного материала минимум на 3-5 дней, а при необходимости получения данных о чувствительности Н.pylori к антибактериальным препаратам длительность исследования увеличивается и составляет в среднем 6-7 дней. Выделение Н.pylori чаще всего происходит при обострении инфекции и наличии выраженных визуальных признаков воспаления. Еще одним из недостатков бактериологического метода является его инвазивность. Для его выполнения необходимо проведение эзофагогастродуоденоскопии (ЭГДС) с взятием биопсийного материала.

Эндоскопия верхних отделов пищеварительного тракта является одним из ведущих методов диагностики при различных воспалительных заболеваниях органов пищеварения. Наиболее полно ее роль проявляется при заболеваниях, ассоциированных с Н.pylori, которые не имеют собственных выраженных клинических проявлений и зачастую скрываются под маской гастритов и язвенной болезни. При выполнении диагностической ЭГДС оценивается состояние стенок полых органов, перистальтика, количество и характер содержимого, вид слизистой оболочки, ее цвет, чистота, поверхность, сосудистый рисунок.

Эндоскопическая картина зависит от степени инвазии Н.pylori и активности процесса. К специфическим признакам Н.pylori-инфекции можно отнести, наличие язв в двенадцатиперстной кишке, множественных разнокалиберных выбуханий на стенках слизистой оболочки антрального отдела желудка, гиперемию слизистой оболочки, наличие мутной слизи в просвете желудка, отек и утолщение складок антрального отдела желудка. Чувствительность и специфичность отдельных признаков может быть различной. Наиболее достоверными являются язвы луковицы двенадцатиперстной кишки (чувствительность и специфичность 100%) и наличие разнокалиберных выбуханий на стенках антрального отдела желудка (чувствительность 93%, специфичность 96%) (П.Л. Щербаков, 2002). Эти выбухания в антральном отделе бывают столь выраженными, что получили название «нодулярного гастрита». При высокой степени обсемененности слизистой оболочки Н.pylori и значительной активности процесса эндоскопически будут определяться несколько признаков: гиперемия слизистой оболочки, мутная слизь в желудке и выраженные выбухания на стенках слизистой оболочки. По мере стихания активности процесса и уменьшении степени инвазии выраженность эндоскопических признаков Н.pylori-инфекции будет уменьшаться. При этом, в первую очередь, содержимое желудка становится прозрачным и гиперемия слизистой оболочки значительно уменьшается. Медленнее других исчезают выбухания слизистой оболочки.

Правила взятия и доставки биопсийного материала Для бактериологического исследования необходимо взятие не менее двух биопсийных образцов из тела и антрального отдела желудка. В целях максимального исключения ошибки проводимого исследования (гипо- или гипердиагностика инфекции) оптимальным считается взятие 3-х биопсийных образцов. Обычно фрагменты слизистой оболочки желудка берутся из антрального отдела желудка по вершинам воображаемого равностороннего треугольника с привратником в центре, на расстоянии 2-4 см от него; из тела желудка по большой и малой кривизне и из свода желудка.

Обязательные условия при эндоскопии:

- во время эндоскопии необходимо уделить особое внимание малой кривизне желудка и луковице двенадцатиперстной кишки, так как при язве в луковице может быть выраженный отек, а также возможен спазм мускулатуры желудка и двенадцатиперстной кишки, при котором достаточно сложно увидеть язву;

- взятие биопсии требует особого внимания. Некоторые язвы иногда кровоточат и при неосторожном взятии биопсии это может привести к кровотечению. Изъязвления после биопсии успешно и достаточно быстро заживают. При биопсии, взятой из здоровой слизистой, риск кровотечения невелик. Если после биопсии начинается кровотечение, пациенту необходимо промыть место кровотечения холодной водой. В случае, если это не помогло, необходимо тампонировать место кровотечения биопсийными щипцами на 2-3 мин. Также для остановки кровотечения можно сделать инъекцию 1 мл 0,01% адреналина в ближайший к кровотечению участок.

Количество биопсийных образцов для бактериологического исследования Первичное исследование антральный отдел, вдоль большой кривизны – Контроль лечения антральный отдел, вдоль большой кривизны – Поскольку Н.pylori – микроаэрофил и очень чувствителен к условиям внешней среды (при избытке кислорода быстро погибает), необходимо строго соблюдать правила транспортировки биопсийного материала на бактериологическое исследование для того, чтобы сохранить этот микроорганизм в жизнеспособном состоянии.

Лучшей, в настоящее время, для транспортировки биопсийных образцов признана Pylori-среда (BioMerioux, Фрынция), которая способна стабильно поддерживать жизнеспособность Н.pylori в биопсийном материале до 2-х суток. Чистая культура Н.pylori в этой среде может сохранять свою жизнеспособность в течение 4-5 дней. Если биопсийные образцы замораживаются при –700С, то посев биопсийного материала можно провести в течение месяца. Однако, глубокое замораживание необходимо проводить только в том случае, когда проведение бактериологического исследования по каким-то веским причинам невозможно провести в течение 24-48 часов.

Первичный посев биопсийного материала проводят на 2 питательные среды – селективную и неселективную.

Для культивирования и выделения Н.pylori разработано большое количество неселективных питательных сред с 5-10% содержанием крови лошади, барана или кролика на основе агара: Muller-Hinton, Brucella, Columbia или Wilkins-Chalgren.

Поскольку природная экологическая ниша Н.pylori не является стерильной, а иногда бывает нельзя исключить возможность контаминации биопсийного образца во время его взятия и транспортировки, то для выделения Н.pylori из биоптатов было предложено использовать специальные селективные питательные среды, содержащие антибактериальные и противогрибковые препараты, способные подавлять рост сопутствующей или контаминационной микрофлоры.

Выбор сред всегда зависит от возможностей микробиологической лаборатории. Среды должны быть свежеприготовленными. Готовые среды хранят при температуре +40С-+60С не более 2-х недель.

Среды, испоьзуемые для транспортировки биопсийного материала Питательные среды для выделения Нelicobacter pylori Неселективная среда колумбийский агар – 37 г Перед посевом биопсийного материала на питательные среды его помещают в 0,5 мл свежеприготовленного физиологического раствора и гомогенизируют при помощи механического гомогенизатора в течение 1 мин (электрическим гомогенизатором при 10 000 об/мин в течение 10-20 с). Затем по две капли гомогенизированного раствора помещают на поверхность чашек с селективной и неселективной питательной средой. Посев производят сплошным газоном с помощью стеклянного шпателя или бактериологической петли.

Дезинфекция гомогенизатора проводится в 2% глутаральдегиде или 96% спирте.

Если лаборатория не имеет оборудования для гомогенизации биопсийного материала, то его непосредственно помещают на чашку Петри с селективной питательной средой и растирают по ее поверхности с помощью петли или стеклянного шпателя. В этом случае выделение чистой культуры Н.pylori менее успешно, так как бактерии бывает сложно отделить от слизистой и сама по себе селективная среда может опосредованно, за счет антибиотиков входящих в ее состав, препятствовать росту Н.pylori.

При культивировании Н.pylori могут возникнуть определенные трудности, которые связаны с созданием микроаэрофильных условий. Необходимую для культивирования атмосферу создают заполнением анаэростатов газовой смесью с помощью коммерческих газогенерирующих пакетов, например производства BioMerioux, Фрынция.

Газогенерирующие пакеты удобны, прежде всего, тем, что используемая в них вода создает в микроанаэростате необходимую для роста Н.pylori влажность. В том случае, если микроанаэростат заполняется газовой смесью извне, внутрь анаэростата необходимо положить фильтровальную бумагу, смоченную водой.

Условия инкубации Нelicobacter pylori Температура +370C Время инкубации:

- первичное исследование – 7 дней - контроль лечения - 14 дней Оптимальный рост кологий наблюдают при рН среды от 6,7 до 8,0. Многие штаммы Н.pylori могут расти и развиваться в достаточно широком диапазоне температур при +320С - +390С, но не растут при +270С - +420С.

Чашки просматривают ежедневно в течение 7 дней. Если исследование проводится после лечения, чашки инкубируют 14 дней.

На неселективной питательной среде Н.pylori на 3-5 сутки при первичном посеве и на 2 сутки при пересевах чистой культуры формирует мелкие, круглые, гладкие, прозрачные, росинчатые колонии диаметром 1-3 мм. На селективной питательной среде колонии Н.pylori приобретают характерное золотисто-желтое окрашивание, за счет присутствующего в этой среде трифенилтетразолий хлорида.

При получении колоний по морфологии сходных с Н.pylori, проводится их идентификация, которая включает в себя окраску мазка по Граму и три биохимические теста – уреазный, каталазный и оксидазный.

При окраске мазка по Граму Н.pylori выглядят в виде грамотрицательных изогнутых S-образных или V-образных палочек.

Уреазный тест с чистой культурой Н.pylori можно ставить в пробирках типа эппендорф. В побирки вносится 2% раствор мочевины по Кристенсену с индикаторои– феноловым-красным, а затем в него добавляется исследуемая культура. Результаты реакции наблюдаются уже в первую секунду – раствор мочевины резко изменяет свою окраску с ярко желтой на темно малиновую. Более медленно, как правило, в этом тесте реагируют кокки, протеи и др. В качестве отрицательного контроля используют культуру E.coli.

1. Мазок, окрашенный по Граму 2. Биохимические тесты:-уреазный -оксидазный - каталазный Тест на способность продукции цитохромоксидазы (оксидазный тест) выполняют следующим образом:

каплю 1% водного раствора тетраметилпарафенилендиамина гидрохлорида наносят на исследуемые колонии непосредственно на поверхности чашки. Через 20-30 с оксидазопозитивные колонии Н.pylori окрашиваются в темный цвет. Этот же тест можно выполнить на фильтровальной бумаге, на которую петлей наносят агаровую культуру и сверху – каплю реактива. Через 5-10 с позитивная культура Н.pylori приобретает пурпурную окраску. Контролем служат суточные агаровые культуры E.coli (негативный контроль) и P.aerugenosa (позитивный контроль).

Тест на каталазную активность проводят в капле Н2О2 на стекле: через 3-5 с в взвеси каталазопозитивной культуры Н.pylori происходит образование пузырьков газа. Позитивным контролем служит суточная агаровая культура E.coli, негативным – любой стрептококк.

Фазово-контрастная микроскопия Н.pylori может быть обнаружен до микробиологического исследования при помощи фазово-контрастной микроскопии. Этот метод весьма удобен для обнаружения Н.pylori, при условии достаточно высокой степени обсеменения.

Преимущества фазово-контрастной микроскопии:

- нет необходимости проводить фиксацию материала и дополнительных окрасок ткани;

- исследование можно проводить в обычных лабораторных условиях;

- результат может быть получен через 1-2 мин.

Процедура выполнения исследования:

1. Поместить биоптат на предметное стекло.

2. Измельчить биоптат на стекле и добавить каплю физиологического расвора.

3. Поместить на измельченный биоптат покровное стекло.

4. Поместить приготовленный препарат в фазово-контрастный микроскоп.

Микроскопия проводится с увеличением в 100 раз с использованием иммерсионного масла.

В препарате – типичные изогнутые бактерии в хаотичном движении.

Гистологический метод Этот наиболее объективнй метод диагностики Н.pylori инфекции, так как позволяет обнаружить возбудитель этой инфекции, определить положение бактериальных тел в слизи, покрывающей СОЖ, наблюдать взаимоотношение Н.pylori с апикальной мембраной эпителиоцитов, а также определить пути взаимодействия микроба с тканями макроорганизма.

Взятие биопсийного материала производится из мест с максимально выраженной гиперемией и отeком. Взятие материала из дна язв и эрозий, а также из их краев, является ошибкой, поскольку в них нет эпителиальных клеток, обладающих свойствами, необходимыми для адгезии и колонизации Н.pylori. Поскольку бактерии Н.pylori могут быть разбросаны по СОЖ в виде очагов, то для повышения чувствительности метода биоптаты целесообразно брать из разных частей желудка. Гистологический метод позволяет также и оценить состояние СОЖ.

При гистологическом исследовании проводится микроскопия парафиновых срезов, окрашенных различными методами - гемотоксилином-эозином, Романовского-Гимза, Вартина-Старри, генциан-виолетом, Гомери, Гента.

Оценка биопсийных образцов проводится в соответствии с Сиднейской классификацией (1990 г.). Н.pylori определяются в виде мелких слегка извитых палочек, находящихся в просвете желудка в непосредственной близости от собственной пластинки СОЖ и на поверхности эпителиальных клеток.

Выделяют 3 степени обсемененности Н.pylori:

1) слабая (+) - до 20 микробных тел в поле зрения;

2) средняя (+) - до 50 микробных тел в поле зрения;

3) высокая (+++) - более 50 микробных тел в поле зрения Гистологическое исследование имеет ряд преимуществ: широкая доступность, удобство хранения и транспортировки препаратов и возможность оценки в любое время любым специалистом, который легко может проводить ретроспективный анализ. Гистологический метод позволяет оценить любую из форм повреждения СОЖ.

Иммуногистохимический метод Биопсийный материал, фиксированный в формалине и залитый в парафин, обрабатывается моноклональными антителами против Н.pylori. Готовые к применению коммерческие наборы с моноклональными антителами работают при разведении 1:200000 и избирательно окрашивают только Н.pylori. Этот метод хорошо зарекомендовал себя при исключительно низкой степени обсемененности СОЖ Н.pylori, когда морфологический метод и уреазный тест дают ложноотрицательные или сомнительные результаты. Он также используется для выявления мофологически измененных (кокковых форм) Н.pylori.

Быстрый уреазный тест (оценка местной уреазной активности) В основу определения уровня желудочной уреазной активности положен следующий принцип: уреаза катализирует быстрый гидролиз мочевины, находящейся в содержимом желудка. В результате реакции образуется аммиак и углекислый газ. рН среды сдвигается в щелочную сторону и это изменение можно зафиксировать с помощью индикатора. Быстрота изменения окраски индикатора зависит от уреазной активности, которая, в свою очередь, зависит от количества бактерий. В некоторых случаях уреазный тест становится положительным через несколько минут. При малом количестве бактерий изменение окраски в уреазном тесте может произойти через несколько часов, а иногда возможен и ложноотрицательный результат.

При проведении уреазного теста нужно учитывать и тот факт, что он может быть положительным у лиц, желудок которых колонизирован H.heilmanii, имеющим близкое сродство с Н.pylori.

В настоящее время разработано большое количество промышленно изготовленных уреазных тестов, среди которых наиболее распространен CLO-тест (Австралия). Коммерческий CLO-тест представляет собой гелеобразную таблетку, содержащую мочевину, феноловый красный (индикатор рН) и бактериостатический агент. Биоптат кладут на поверхность таблетки и при наличии уреазы индикатор изменяет ее окраску от желтой до малиновой. Через 20 минут этот тест положителен в 75% случаев, а через 24 часа в 95% случаев у больных с подтвержденным бактериологически хеликобактериозом.

Время появления малинового тона косвенно указывает на количество микроорганизмов:

(+) - незначительная инфицированность (малиновое окрашивание к концу суток);

(++) - умеренная инфицированность (малиновое окрашивание в течение 2 часов);

(+++) - значительная инфицированность (малиновое окрашивание появляется в течение первого часа) (-) - отрицательный результат (малиновое окрашивание не наступает).

В России чаще всего используется уреазный тест, приготовленный, непосредственно в лаборатории.

Этот тест экономичен, надежен, прост в использовании.

Применяемые реагенты:

0,01М фосфатный буфер рН 6,5 - 100 мл Метод приготовления:

Готовят по обычной рецептуре: 0,01М фосфатный буфер рН 6,5 разливают по флаконам, стерилизуют при +1210С 15 мин. К охлажденному буферу добавляют мочевину – 2 г, раствор фенолового красного и азид натрия (обладающий свойствами консерванта). Цвет реактива должен быть желто-розовым. При подкислении реактива его цвет меняется на соломенно-желтый, при подщелачивании – на малиновый. Приготовленный реактив должен быть соломенно-желтого цвета и может длительно храниться в темной упаковке при температуре +20С - +60С.

Процедура выполнения теста (с 2% мочевиной):

1. Поместить 2 капли реагента в пробирки типа эппендорф.

2. Поместить биопсийный материал в первую пробирку, вторая пробирка используется в качестве контрольной.

3. Плотно закрыть пробирки.

4. Записать время начала выполнения теста.

5. Микропробирки инкубируют при температуре +370С.

6. Учитывать результат через 20 мин, 1 ч, 3 ч, 24ч.

При проведении контроля лечения возможно увеличение интервалов времени изменения цвета реактива или получение ложноотрицательных результатов, поэтому тест в данном случае считается неспецифичным.

Учет результатов и показатели изменения времени окраски реагента через определенные промежутки времени Последующие модификации БУТ дали возможность получения более быстрого результата. При использовании незабуферного раствора мочевины положительный результат регистрируют в течение 1 мин у 90% больных хеликобактериозом, подтвержденным бактериологически. Однако этот метод может давать положительные результаты, если результат оцениваерся позже 1 минуты.

В связи с этим, было предложено использовать 6% раствор мочевины. В этом случае результаты теста учитываются в течение 15 мин.

К недостаткам теста относится его инвазивность, получение ложноотрицательных (при малом количестве микробных тел) или ложноположительных (контаминирование материала другими уреазопродуцентами) результатов, а также невозможность оценить состояние СОЖ.

Этот тест неприемлем для выявления других возможных очагов локализации Н.pylori в желудочно-кишечном тракте - в ротовой полости и толстой кишке из-за нейтральной среды и из-за присутствия там большого количества других уреазопродуцентов. Невозможность использования уреазного теста для обнаружения во внешней среде очевидна не только из-за его недостаточной чувствительности, но и потому, что Н.pylori во внешней среде могут принимать кокковую форму, которая не проявляет ферментативной активности.

Несмотря на указанные недостатки БУТ, предлагаемый для идентификации Н.pylori в эпителии желудка вполне адекватен требованиям диагностики, так как ни один другой микроорганизм не заселяет СОЖ в таком большом количестве и не обладает столь мощной уреазной активностью. Преимуществами уреазных тестов является их простота и возможность получения быстрого (в течение нескольких часов, минут) ответа.

Молекулярно-биологический метод (ПЦР-исследование) В мире накоплен обширный клинико-лабораторный опыт по использованию метода ПЦР (полимеразная цепная реакция) для выявления ДНК Н.pylori в биопсийном материале. Высокие показатели чувствительности и специфичности ПЦР делают этот метод во многом революционным в лабораторной диагностике.

ПЦР представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза (амплификацию) специфической области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеотидтрифосфатов, соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок-праймеров, которые определяют границы амплифицируемого участка.

Каждый цикл состоит из трех стадий с различными температурными режимами. На первой стадии при +940С происходит разделение цепей ДНК, затем при +560С - +600C - присоединение (отжиг) праймеров к комплементарным последовательностям на ДНК-мишени, и при температуре +720C протекает синтез новых цепей ДНК путем достраивания цепей праймеров в направлении 5‘ -3‘. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой выбранных праймеров, в количестве, достаточном для ее детекции с помощью электрофореза или альтернативными ему технологиями.

ПЦР-диагностика обладает рядом преимуществ:

1. высокой специфичностью, которая обусловлена подбором праймеров комплементарных уникальной нуклеотидной последовательности тестируемых микроорганизмов, вирусов и т.д.;

2. адекватной чувствительностью, позволяющей диагностировать не только острые, но и латентные инфекции в клинически значимом титре (возможно выявление даже единичных бактерий или вирусов);

3. сходный химический состав нуклеиновых кислот позволяет разрабатывать универсальные процедуры для выявления различных инфекционных агентов;

4. возможностью идентификации возбудителя в течение 4,5-5 часов.

Важной отличительной особенностью ПЦР-диагностики является относительно низкая стоимость оборудования и тест-систем для проведения анализа, которые сочетаются с универсальностью метода.

ПЦР-лаборатория должна быть разделена на зоны (комнаты), которых должно быть не менее двух. В пре-ПЦРпомещении проводится обработка клинических образцов, выделение ДНК, приготовление реакционной смеси для ПЦР и постановка ПЦР (при наличии условий два последних этапа рекомендуется также проводить в дополнительном отдельном помещении). В этом помещении (помещениях) запрещается проводить все другие виды работ с инфекционными агентами (микробиологический анализ, ИФА, другие диагностические тесты), ПЦР-диагностика которых проводится в данной лаборатории. В комнате приготовления реакционной смеси и в комнате обработки клинических образцов должны быть установлены ультрафиолетовые лампы.

В пост-ПЦР-помещении проводится детекция продуктов амплификации. Это пмещение должно быть расположено как можно дальше от пре-ПЦР-помещений. В пост-ПЦР-помещении важно также исключить движение воздушного потока из пост-ПЦР-помещения в пре-ПЦР-помещение.

Рабочие поверхности в ПЦР-лаборатории должны обрабатываться дезинфицирующими растворами.

Показания для диагностики Н.pylori-инфекции методом ПЦР 1. Острая фаза заболевания;

2. Хроническая фаза заболевания;

3. Установление этиологии хронического инфекционного процесса при гастрите и язвенной болезни;

4. Контроль эффективности проведенного антибактериального лечения.

В случае выявления фрагмента ДНК Н.pylori через 4 недели после курса противохеликобактерной терапии следует провести микробиологическую диагностику хеликобактериоза для исключения ложноположительного результата. При выделении из биопсийного материала Н.pylori необходимо определение его чувствительности к антибактериальным препаратам, которые входили в состав противохеликобактерной терапии. Если проведение микробиологической диагностики невозможно, то необходимо через 5-6 недель провести повторное исследование на хеликобактериоз методом ПЦР.

Научно-производственной фирмой “Литех” при НИИ физико-химической медицины МЗ РФ выпускается набор отечественных реагентов “Хеликопол” для определения ДНК Н.pylori в биопсийном материале. Набор «Хеликопол»

комплектуется отдельным набором для выделения ДНК из биопсийного материала. Инструкция по применению набора реагентов рекомендована к утверждению экспертной комиссией Комитета по новой медицинской технике МЗ РФ (протокол No 3 от 18.03.96 г) и утверждена Министерством здравоохранения РФ 17.05.96 г (ТУ 9398-405-17253567-96).

При выполнении анализа методом ПЦР необходимо строго соблюдать протокол исследования, указанный в инструкции к конкретному ПЦР набору конкретного производителя. В общих чертах в постановке ПЦР можно выделить три основных этапа:

1. Выделение ДНК из клинического образца;

2. Амплификация специфических фрагментов ДНК;

3. Детекция продуктов амплификации.

На данной стадии проведения анализа биопсийный материал подвергается специальной обработке, в результате которой происходит лизис клеточного материала, удаление белковых и полисахаридных фракций, и получение раствора ДНК,свободной от ингибиторов и готовой для дальнейшей амплифи-кации. В наборе для выделения ДНК НПФ «ЛИТЕХ» реализован сорбционный способ очистки ДНК.

Методика экстракции и очистки ДНК Н.pylori:

1. биопсийный материал из желудка и/или двенадцатиперстной кишки помещается в 100 мкл лизирующего раствора, содержащего 10 мМ Трис HCl рН 8,8, 25 мМ ЭДТА, 100 мкг/мл протеиназы К и инкубируется при температуре +650С в течении 4-х часов (до полного растворения биопсийного материала);

2. к полученному раствору добавляется 10 мкл водной суспензии сорбента и 300 мкл буфера (раствор I), состоящего из 10 мМ Трис HCl рН 8,0, 5,5 М гуанидин тиоцианата и 10 мМ ЭДТА;

3. суспензия инкубируется при комнатной температуре в течение 10 мин с периодическим вортексированием;

4. сорбент осаждается центрифугированием в течение 7 сек при 12 000 об/мин;

5. супернатант удаляется с помощью вакуумного насоса;

6. сорбент однократно промывается в 150 мкл промывочного раствора (р-р II);

7. сорбент двукратно промывается в 1000 мкл промывочного раствора (р-р III);

Амплификация специфических фрагментов ДНК На данной стадии происходит накопление коротких специфических фрагментов ДНК в количестве, необходимом для дальнейшей детекции. В методике, предложенной НПФ «ЛИТЕХ» для определения специфических фрагментов генома Н.pylori используется «классический» вариант ПЦР с использованием одной пары праймеров, которые ограничивают специфически синтезируемый фрагмент ДНК.

В комплект набора «Хеликопол» для амплификации входит пробирка с положительным контрольным образцом, который всегда анализируют параллельно с исследуемыми пробами для корректной оценки результатов амплификации на последнем этапе анализа. Кроме того, рекомендуется анализировать и отрицательный контролтный образец, которым может служить деионизованная вода, для оценки чистоты эксперимента (исключения возможности контаминации).

Детекция продуктов амплификации В большинстве методик на данном этапе проводится разделение смеси продуктов амплификации, полученной на 2-ой стадии, методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. До проведения электрофоретического разделения, к амплификационной смеси добавляется раствор бромистого этидия, образущий с двухцепочечными фрагментами ДНК прочные соединения внедрения. Эти соединения под действием ультрафиолетового облучения способны флуоресцировать, что регистрируется в виде оранжево-красных светящихся полос после электрофоретического разделения амплификационной смеси в агарозном геле.

Изображение с такого электрофорезного геля можно документировать фотографическим способом (с использованием оранжевого светофильтра) или при помощи специальных систем гель-документации на базе компьютера, переводящих изображение в цифровой формат.

Электрофоретический метод детекции продуктов амплификации самый простой в исполнении. Тем не менее, такой формат детекциии ПЦР-продуктов в настоящее время является устаревшим, в силу ряда существенных недостатков.

Таковыми являются субъективность оценки результатов электрофореза оператором, низкая производительность, невозможность автоматизации процесса, трудность количественной оценки продуктов ПЦР реакции в каждом конкретном образце. Наибольшую опасность представляет возможность наработки в ходе ПЦР неспецифического продукта, сходного по размерам с детектируемым. В этом случае при существующей системе детекции возможна выдача оператором ложноположительного результата.

Набор «Хеликопол» НПФ «Литех» (К-) - отрицательный котрольный образец, (К+) - положительный контрольный Альтернативой электрофоретическим методам детекции ПЦР-амплифицированной ДНК являются методы ДНКгибридизации. В ходе такого способа детекции амплифицированная ДНК гибридизуется с олигонуклеотидным зондом, специфичным к внутренней последовательности анализируемого фрагмента. Образовавшийся гибрид автоматически регистрируется флуоресцентным или фотометрическим ридером. Таким образом, при гибридизационном способе детекции ДНК специфичность реакции амплификации подтверждается несколько раз. Сначала в ходе самого этапа амплификации (отжига праймеров) и вторично при гибридизации получившегося продукта со специфичным зондом.

Гибридизационный способ детекции был предложен фирмой Хоффман-ла Рош и используется в наборе для ПЦРдиагностики AMPLICOR Chlamydia trachomatis. Из отечественных фирм-производителей гибридизационная схема детекции продуктов амплификации впервые была предложена НПФ «Литех» в технологической схеме «ПлаТАн» в году. В настоящее время для такого способа детекции адаптировано большинство ПЦР наборов производства НПФ «Литех». При использовании данной технологии гибридизация осуществляется в специальных микропланшетах с применением флуоресцентных олигонуклеотидных зондов. Регистрация гибридизации осуществляется прибором – микропланшетным флуориметром Fluoroskan Ascent (Лабсистемс, Финляндия).

Калькуляция результата производится автоматически специально разработанной компьютерной программой и выводится на экран, как в символьном («-»; «+»), так и в цифровом виде (Рисунок 2).

Цитологический метод используется только в России. Метод основан на выявлении бактериальных тел в мазкахотпечатках биоптатов СОЖ. Мазки окрашиваются по методу Романовского-Гимзы. Бактерии располагаются в слизи, имеют спиралевидную или S-образную формы. Помимо Н.pylori выявляется также клеточная инфильтрация, представленная лимфоцитами, нейтрофилами, плазматическими клетками и эозинофилами. По преобладанию тех или иных клеток можно приблизительно судить об активности и выраженности воспаления. Цитологическое исследование позволяет выявить наличие пролиферативных процессов, метаплазии и дисплазии, а также оценить степень их выраженности. Можно обнаружить и неопластические изменения, но этот метод недостаточно информирует о структурных изменениях СОЖ. В странах дальнего зарубежья этот метод не используется из-за его очень низкой чувствительности, которая составляет в среднем 18-20%. Н.pylori в цитологических препаратах можно выявить только в случае максимального обсеменения слизистой оболочки.

Выдача результата ПЦР-анализа ДНК НР при использовании гибридизационной технологии «ПлаТАн»

Если говорить о тенденциях в развитии методов диагностики, то в последние годы произошел сдвиг в сторону неинвазивных методов, где достигнут наибольший прогресс.

Уреазный дыхательный тест (УДТ) Прежде всего, следует сказать, что в развитых странах в последние годы стандартным методом контроля за эрадикацией стал именно этот тест.

Тест основан на способности уреазы разлагать мочевину до НСО3Ї и NH4+. Из НСО3Ї образуется СО2, который попадая в кровоток затем транспортируется в легкие.

Для проведения УДТ необходима мочевина, меченная радиоактивным углеродом 13С или 14С. Чаще в клинической практике используется нерадиоактивный стабильный углерод 13С. 14С используется реже, так как является источником излучения низко энергетических -частиц, которые обнаруживаются сцинтиляционным счетчиком.

Изотоп количественно определяют газовым хроматомас-спектрометром или с помощью инфракрасного и лазерного оборудования.

В начале исследования берутся 2 фоновые пробы выдыхаемого воздуха. Далее пациент съедает легкий завтрак и тестовый субстрат и в течение 1 часа, с интервалом в 15 минут у него берут по 4 пробы выдыхаемого воздуха. Уровень радиоактивного изотопа в выдыхаемом воздухе определяют в течение 10-30 минут. Затем пробирки направляются на масс-спектрометрию. Результат выражается как приращение 13СО2 – д13СО2, его экскреция (%о) и считается положительным при значениях выше 5%о. В ряде стран используется определение изотопического отношения концентраций 13СО2/12СО2, что позволяет свести к минимуму влияние на конечный результат методических и инструментальных погрешностей.

В развитых странах данный тест считается основным для выявления Н.pylori-инфекции, однако сдерживающими факторами для повсеместного использования этой методики являются стоимость оборудования (масс-спектрометр) и изотопа. Поскольку уменьшение стоимости изотопа невозможно, были предложены варианты масс-спектрометров на основе лазерного и инфракрасного излучения, стоимость которых существенно ниже. С другой стороны, использование микрокапсул для упаковки мочевины, меченной радиоактивным изотопом, позволило свести к минимуму трудности, связанные с хранением, утилизацией и безопасностью данного изотопа. В США продажа микрокапсул с мочевиной, меченной углеродом, разрешена FDA наравне с обычными лекарственными препаратами через аптечную сеть, что является свидетельством полной безопасности данного изотопа для обследуемых и окружающей среды. Появление такой формы меченной мочевины существенно повышает конкурентноспособность этой методики, т.к. стоимость и самого изотопа, и оборудования для его проведения в среднем меньше в 10 раз, чем масс-спектрометра.

Показаниями для проведения УДТ служат: эпидемиологические исследования, скрининг перед эндоскопией и наблюдение за больным после лечения.

Иммунологический метод Колонизация Н.pylori вызывает системный иммунный ответ. Через 3-4 недели после инфицирования в слизистой оболочке и в крови больных появляются антитела к Н.pylori. Эти антитела определяются путем иммуноферментного анализа. Выявляют антитела IgG, IgA, IgM-классов в крови и секреторные sIgA, sIgM в слюне и желудочном соке.

Поскольку инфекция является хронической и ее спонтанный клиренс невозможен, то положительные серологические тесты у нелеченных пациентов указывают на наличие текущей инфекции. Несмотря на то, что уровень антител в процессе успешной эрадикации падает, серологическая реакция остается положительной в течение ряда лет.

Этот “серологический рубец” ограничивает возможности исследования крови для оценки эффективности лечения или для диагностики наличия у больного Н.pylori. Однако быстрое падение уровня антител косвенно может указывать на санацию СОЖ.

Имеется несколько модификаций этого теста:

-ELISA- (ферментный иммуносорбентный метод), реакции фиксации комплемента, бактериальной и пассивной гемагглютинации.

Классический иммуноферментный анализ с количественным определением в сыворотке или плазме крови больных антихеликобактерных антител разных классов характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью, в пользу чего свидетельствуют сравнительные исследования наборов для проведения таких анализов, выпускаемых различными производителями. Данный метод идеален для первичной диагностики, так как при высокой чувствительности и специфичности (более 90% по сравнению с инвазивными методами, включая ПЦР) он на сегодняшний день самый дешевый. Увеличение чувствительности и специфичности метода, вследствие совершенствования технологии, позволило применить его для диагностики эрадикации, и если 5 лет назад диагностика эрадикации с помощью иммуноферментного анализа была возможна только через 8-12 месяцев после лечения, то для выпускаемых в настоящее время наборов для ИФА этот срок уменьшился до 3 месяцев.

Использование же высокочувствительных наборов, в основу которых положен непрямой ИФА с применением антигена Н.pylori, меченного биотином, позволяет зафиксировать снижение концентрации специфических антител уже через 30-40 дней после окончания успешного лечения, и, таким образом, укладывается в сроки оценки эрадикации, принятые для инвазивных методов и дыхательного теста. Учитывая это обстоятельство, и то, что стоимость такого анализа ненамного выше обычного ИФА, следует признать его весьма перспективным.

Безусловной сенсацией 1998 года явилось появление на рынке теста для количественного определения антигена Н.pylori в фекалиях больных с помощью ИФА. Мультицентровое исследование в странах ЕС, проведенное более чем на 400 больных, подтвердило его высокую эффективность в определении эрадикации в сравнении с инвазивными методиками и дыхательным тестом. Более того, полученные данные свидетельствуют, что с помощью этого теста можно мониторировать лечение, то есть прогнозировать эффект антихеликобактерной терапии. Стоимость одного анализа пока остается на уровне дыхательного теста. Тест также зарегистрирован FDA в США.

Иммуноблотинг существенно уступает другим иммунологическим методам как по стоимости, так и по трудоемкости выполнения анализа, однако только с его помощью можно, имея лишь сыворотку крови больного, получить данные о свойствах штамма Н.pylori (продуцирует ли он CagA и VacA).

На конференциях Канадской группы по изучению Helicobacter pylori (CSHPG) в 1999 году и Европейской группы по изучению Helicobacter pylori (ESHPG) в 2000 году были приняты рекомендации по диагностике и лечению Н.pyloriинфекции у детей, в которых указывалось на предпочтительность неинвазивной диагностики этой инфекции, особенно при контроле лечения (P. Sherman, 1999; B. Drumm, 2000). На основании этих рекомендаций в Европе и Америке для диагностики Н.pylori-инфекции в настоящее время используют иммуноферментный анализ (ИФА) для определения антител против H.pylori (серологический метод) и уреазный дыхательный тест с С13 меченым атомом углерода ([13C]UBT).

Однако, серологический метод на практике оказался малоэффективным для диагностики Н.pylori-инфекции у детей. Так, при первичной диагностике Н.pylori-инфекции у детей в ряде случаев отмечается слабый иммунный ответ, а это, в свою очередь, затрудняет верификацию антител против H.pylori. Из-за медленного снижения титра антител после успешно проведенной противохеликобактерной терапии, которое продолжается в течение 6 месяцев, серологический метод, как оказалось, мало пригоден и при раннем контроле лечения как у детей, так и у взрослых (A. Cutler, 1996).

Несмотря на широкое использование в клинической практике в Европе и Америке уреазного дыхательного теста с 13 меченым атомом углерода он имеет ограничения при использовании его у детей раннего возраста (J. DominiguezС Munos, 1997). В России этот тест не нашел широкого распространения из-за высокой стоимости оборудования и мочевины с С13 меченым атомом углерода.

Несколько лет назад в Европе появился новый неинвазивный тест, на основе ИФА, позволяющий определять антиген H.pylori в кале – Premier Platinum HpSA (Meridian Diagnostics, Италия). Многочисленные мультицентровые исследования, как в нашей стране, так и за рубежом показали высокую чувствительность и специфичность этого теста при первичной диагностике Н.pylori-инфекции и контроле лечения (A. Markristatis, 1998; D. Vaira, 1999; В.М. Говорун, 2000). Этот тест был признан «золотым стандартом» в диагностике Н.pylori-инфекции. Единственным ограничением широкого использования этого теста в клинической практике остается его высокая стоимость по сравнению с другими методами диагностики хеликобактериоза.

Попытки создания альтернативного, более дешевого, неинвазивного метода диагностики Н.pylori-инфекции на основе ПЦР до настоящего времени заканчивались неудачей из-за большого количества ложно-положительных результатов (A. Markristatis, 1998; D. Vaira, 1999; L Trevisani, 1999). Тем не менее, на базе научной лаборатории НПФ «ЛИТЕХ» был разработан новый тест для диагностики Н.pylori- иннфекции в кале на основе ПЦР.

Чувствительность нового неинвазивного метода диагностики Helicobacter pylori–инфекции в кале у взрослых составила 91,1%. Созданная тест-система на основе ПЦР, позволяет верифицировать ДНК H.pylori в кале у детей и взрослых и не уступает по чувствительности и специфичности Premier Platinum HpSA - тесту.

При проведении первой серии экспериментов верификации ДНК H.pylori в кале у взрослых чувствительность созданного нами теста оказалась значительно ниже и составила 75,6%. Нами, в свою очередь, было сделано предположение, что снижение чувствительности ПЦР-теста при первичной диагностике H.pylori-инфекции у взрослых связано, скорее всего, с более длительной эвакуацией каловых масс. Более длительная эвакуация каловых масс у взрослых, по сравнению с детьми, по-видимому, способствовала разрушению ДНК H.pylori. В связи со сделанным предположением, для увеличения скорости эвакуации кала, всем взрослым пациентам накануне исследования в качестве слабительного был назначен Дюфалак (СолвейкФарма, Франция) по 30 мл утром и вечером. После назначения слабительного и сокращения времени эвакуации кала чувствительность ПЦР-метода при первичной диагностике H.pylori–инфекции у взрослых стала такой же, как при первичной диагностике у детей и составила 91,1%.

Использование ПЦР-теста на 4-ой неделе после успешно проведенной противохеликобактерной терапии показало низкую специфичность, созданного нами теста, которая составила – 75,7%.

При проведении контроля лечения на 6-ой неделе нами была отмечена тенденция к снижению количества ложноположительных результатов и специфичность, созданного нами теста составила – 93,9%.

На 8-ой неделе специфичность теста составила 100%. Нами не было получено ни одного ложноположительного результата.

В 1999 г L. Trevisani и соавт. в 2000 г R. Ohkura и соавт. также обратили внимание на высокий процент ложноположительных результатов при постановке Premier Platinum HpSA теста на 4-6 неделе после успешно проведенной противохеликобактерной терапии. Полученные ложноположи-тельные результаты они объяснили возможностью персистенции в организме пролеченных пациентов кокковых форм H.pylori, количество которых, скорее всего, начинает со временем снижаться и полностью отсутствует на 8-12 неделе.

G. Masoero и соавт. показали, что подобные проблемы могут встречаться и при использовании для контроля лечения 13С УДТ.

Тем не менее, следует отметить, что потеря специфичности при использовании неинвазивных методов для контроля лечения не сопровождается потерей их чувствительности.

К преимуществам созданного нами ПЦР-теста можно, прежде всего, отнести его неинвазивность, простоту и быстроту выполнения (на постановку 30 исследований необходимо 4,5 - 5 часов) и относительно низкую себестоимость по сравнению с ИФА, дыхательным тестом, бактериологическим и гистологическим методами исследования. Ввиду невысокой стоимости данного теста он может быть использован не только для первичной диагностики H.pyloriинфекции, но и для эпидемиологических исследований.

Распределение генотипов Helicobacter pylori в различных регионах РФ с учетом гастродуоденальной Несмотря на высокий процент инфицирования населения H.pylori подавляющее большинство инфицированных лиц не имеют клинических проявлений на момент диагностики, но они, тем не менее, представляют собой группу риска, в которой с течением времени развивается хронический гастрит, ЯБЖ, ЯБДК, экстранодальня В-клеточня MALTлимфома или аденокарцинома желудка.

К настоящему времени у двух штаммов H.pylori (J99 и 26695) определены полные последовательности генома.

Геном H.pylori содержит 1600 генов (J. Tomb, 1997; R. Alm, 1999). Ряд генов, продукты которых – белки CagA, VacA, IceA, BabA, считаются факторами патогенности.

Ген cagA (cytotoxin-associated – маркер gene) островка патогенности - cag (cag-PAI) кодирует белки IV секреторной системы H.pylori, функция которой состоит в доставке эффекторных молекул микроорганизма в клетки макроорганизма.

Они позволяют H.pylori модулировать метаболизм эпителиоцитов слизистой оболочки желудка, включая и экспрессию протоонкогенов.

Продукты генов, входящих в состав островка патогенности, способны переносить cagA непосредственно в эпителиоциты слизистой оболочки желудка, где он подвергается фосфорилированию. Фосфорилирование cagA внутри эпителиоцитов приводит к изменению их цитоскелета, в результате чего происходят морфологические изменения эпителиоцитов. Гены островка патогенности также принимают участие в модуляции экспрессии генов эпителиальных клеток, кодирующих митоген-активируемые протеинкиназы, ядерный фактор kB (NF-kB) и активирующий белок-1 (АР-1).

Транскрипция гена интерлейкина 8 (ИЛ-8) эпителиоцитами слизистой оболочки желудка также зависит от экспрессии ряда генов, входящих в состав островка патогенности H.pylori.

Другой фактор патогенности H.pylori - ген vacA (vacuоlating-associated cytotoxin) является цитотоксином, который экскретируется и повреждает эпителиальные клетки желудка. При низких значениях рН неактивные додекамеры токсина распадаются на мономеры, которые взаимодействуют с липидным бислоем и восстанавливаются как гексамерные, анион-селективные мембранные каналы. Увеличение проницаемости анионов через эти каналы является свойством всех vacA-продуцирующих штаммов H.pylori (T. Cover, 1992; 1996).

Вакуолизирующий цитотоксин кодируется геном vacA, который присутствует фактически у всех штаммов H.pylori.

Ранее были описаны различные аллельные варианты двух вариабельных участков этого гена. Так, vacA s регион (кодирующий сигнальный пептид) существует в виде s1 или s2 аллельных типов. В s1 типе были идентифицированы s1a, s1b и s1c субтипы. Средний m регион существует в двух аллельных вариантах - m1 или m2 (J. Atheron, 1995;

1997).

Уровень секреции вакуолизирующего цитотоксина определяется мозаичной структурой гена, кодирующего VacA.

Генотипы штаммов H.pylori s1m1 и s1m2 vacA имеют максимальный или средний уровень секреции цитотоксина.

Генотип штаммов H.pylori s2m2 проявляет незначительную токсическую активность (T. Cover, 1992; J. Guruge, 1998).

Между cagA- и vacAs1- генотипами штаммов H.pylori существует строгая ассоциация - большинство vacAs1- штаммов являются cagA позитивными.

Относительно недавно описанный ген iceA (induced by contact with epithelium) существует в двух аллельных формах - iceA1 и iceA2. Предполагается, что iceA1 является маркером язвенной болезни желудка. У больных, инфицированных H. pylori c генотипом iceA1, инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки желудка полиморфно-ядерными нейтрофилами выше, чем у инфицированных H. Pylori с другим генотипом. В ряде работ было показано, что адгезия к эпителиальным клеткам желудка in vitro индуцируется экспрессией IceA1 белка. Однако in vivo детектируются как iceA1, так и iceA2 транскрипты (R. Peek, 1998).

Факторы бактериальной адгезии на эпителий желудка человека также могут вносить вклад в специфический тропизм и патогеность штаммов H. pylori. Ген babA (blood group antigen-binding adhesin) является медиатором адгезии H.

pylori с системой антигенов Lewis (Le) на эпителиальных клетках желудка. In vitro было показано, что H.pylori специфически связывается с поверхностью клеток слизистой желудка и регулируется фукосилированными антигенами этой группы. Более того, эксперименты на трансгенных мышах, экспрессиру-ющих Lewis В эпитоп в эпителиальных клетках желудка, показали, что он функционирует как рецептор для H.pylori адгезина и запускает процесс прикрепления бактерии к поверхности слизистых клеток желудка. Прикрепление H. pylori к поверхности слизистых клеток желудка у трансгенных мышей вызывает развитие хронических гастритов и атрофий (R. Falk, 1995; J. Guruge, 1998). Ген, кодирующий белок BabA, был клонирован и идентифицирован как babA2. Адгезия H.pylori, как полагают, служит для защиты бактерии от кислой среды желудка, а также от ее возможного смещения (перемещения) вследствие его перистальтики (J. Guruge, 1998).

В настоящее время не все молекулярно-биологические и клинико-диагностические лаборатории имеют возможность культивирования H.pylori. Между тем, определение факторов патогенности H.pylori, выделенных от пациентов, проживающих в различных регионах РФ, и создание генотипической карты может быть определяющим фактором в эпидемиологии и лечении H.pylori-инфекции.

Целью работы, проводившейся в научной лаборатории НПФ «ЛИТЕХ», являлось генотипирование клинических изолятов H.pylori из различных регионов РФ (Москва и Московская область, Красноярск, Уфа и Казань), а также разработка метода генотипирования штаммов H.pylori непосредственно в биопсийном материале слизистой оболочки желудка с помощью ПЦР.

Частота встречаемости vacAs1, cagA, iceA1 и babA2 генотипов в биопсиях и клинических изолятах Клинические изоляты H.pylori и H.pylori, верифицированные непосредственно в биопсийном материале с помощью ПЦР, были проанализированы на одновременное присутствие vacAs1, cagA, iceA1 и babA2 генотипов.

Исследования одновременного присутствия у клинических изолятов H.pylori генотипов vacAs1, cagA, iceA1 и babA показали, что при babA2 положительном генотипе H.pylori 12 из 15 изолятов имели vacAs1 генотип (P=0.385), iceA положительный генотип имели 14 клинических изолятов H.pylori (P=0.489). При исследованиях биопсийного материала были получены следующие результаты: vacAs1 генотип H.pylori был верифицирован в 31 случае ( 2=4.789, P=0.028), cagA встречался в 34 случаях ( 2=4.134, P=0.042) и iceA1 генотип в 28 случаях (P=0.207).

В клинических изолятах H.pylori распределение генов патогенности было следующим: тип 1 (vacAs1, cagA и babA2) - 50%, тип 2 (vacAs1, cagA, iceA1 и babA2) –46%. При исследовании биопсийного материала, верифицированного на наличие H.pylori, было обнаружено следующее сочетание генов: vacAs1, cagA и babA2 (тип 1) - 36% случаев, а vacAs1, cagA, iceA1 и babA2 (тип2) - 30%.

Значительных отличий между типами H.pylori 1 и 2 при изучении биопсийного материала и между клиническими изолятами H.pylori не наблюдалось. Но при сравнении клинических изолятов H.pylori и H.pylori, верифицированных в биопсийном материале, разброс в распределении типов 1 и 2 H.pylori был достаточно велик (до 20%).

Распределение генотипов H.pylori в биопсиях при различных заболеваниях желудка Результаты генотипирования H.pylori при ЯБДК и хроническом гастродуодените приведены в Таблице. CagA генотип H.pylori встречался в биопсийном материале, полученном от пациентов как с ЯБДК, так и с хроническим гастродуоденитом (относительное содержание оценивалось только для значимых выборок). Так cagA генотип H.pylori был верифицирован в 92% случаев у пациентов с ЯБДК и в 94% случаев у пациентов с хроническим гастродуоденитом.

Однако 2 – тест, также как и тест Фишера не выявил каких-либо предпочтительных ассоциаций между cagA и конкретным заболеванием.

Частота встречаемости генотипа H.pylori vacAs1 при ЯБДК и хроническом гастродуодените также не носит значимого характера. Нам не удалось зарегистрировать каких-либо строгих ассоциаций между vacAs1, vacAm1, iceA1 и babA2 генотипами H.pylori и ЯБДК и хроническим гастродуоденитом. Исходя из данных, представленных в Таблице, можно предполагать, что распределение генотипов H.pylori при ЯБДК и хроническим гастродуодените носит скорее всего случайный характер.

Окончательно вопрос о необходимости генотипирования H.pylori в биопсиях возможно решить только после изучения биопсийного материала, полученного от пациентов с хроническим гастритом, ЯБЖ, экстранодальной Вклеточной MALT-лимфомой или аденокарциномой желудка.

Распределение генотипов cagA, vacA, iceA и babA2 H.pylori в Москве и Московской области В Москве и Московской области VacAs1 генотип H.pylori был верифицирован в 63% случаев при изучении биопсийного материала и в 77% случаев при изучении клинических изолятов H.pylori. 18 штаммов H.pylori, верифицированных в биопсийном материале, и 2 клинических изолята H.pylori имели генотип vacAs2. Интересно, что штаммы H.pylori, имеющие смешанный генотип vacA (s1/s2 или m1/m2), указывающий на присутствие более чем одного штамма H.pylori, были верифицированы в биопсийном материале в 44 (50%) случаях и в 4-х клинических изолятах H.pylori (30%).

При исследовании биопсийного материала в 81 (93%) случае нами был зарегистрирован маркер островка патогенности H.pylori, который в 100% случаев присутствовал и в клинических изолятах H.pylori. К сожалению, нам не удалось выявить, как отдельный, iceA2 генотип ни в биопсийном материале, ни в клинических изолятах. IceA2 генотип выявлялся только в сочетании с iceA1 генотипом в 18 (21%) образцах биопсий и в 5 (38%) клинических изолятах H.pylori.

IceA1 генотип был зафиксирован в 52 образцах биопсий и 6 клинических изолятах H.pylori. IceA генотип не был выявлен в 17 (20%) биопсий и у 2 (15%) клинических изолятов H.pylori. BabA2 ген верифицирован у H.pylori при исследовании биопсийного материала в 34 (39%) случаях. Этот же ген присутствовал в 8 (62%) клинических изолятах H.pylori.

Нами также были выявлены комбинации vacA s- и m- регионов, cagA, iceA и babA2 генотипов H.pylori. Из возможных генотипов H.pylori vacS1, cagA, iceA1 и babA2 генотип встречался в 31% случаев у H.pylori верифицированного в биопсийном материале, и у 54% клинических изолятов H.pylori. Ни одного образца с генотипом vacAs2/m1 нами найдено не было. Неслучайный характер распределения комбинаций генотипов подтверждается ассоциацией отдельных, индивидуальных генотипов cagA, vacA, iceA и babA. СagA положительные H.pylori в биопсиях и клинических изолятах чаще всего имели vacAs1 (p0.001) и iceA1 (p0.001) генотипы.

Как видно из данных, представленных в Таблице результаты генотипирования генов патогенности у H.pylori, верифицированного в биопсийном материале и в клинических изолятах, значительно различаются, особенно для vacAm1, babA2 генотипов.

Тем не менее, на имеющемся биологическом материале (биопсии, клинические изоляты) возможно оценить достоверность результатов, полученных при генотипировании H.pylori в биопсиях по отношению к клиническим изолятам (стандарт генотипирования). Так для vacA, cagA и iceA ошибка определения генотипа в биопсиях по сравнению с культурами составляет 10-15%, а для babA2 20-25%. Результаты генотипирования в биопсиях несколько занижены по отношению к культурам, что вероятно связано с сохранностью ДНК H.pylori (некоторая часть ПЦР анализа ДНК из биопсий производилась ретроспективно).

Распределение генотипов cagA, vacA, iceA и babA2 H.pylori в различных регионах Российской Федерации Анализ клинических изолятов из Москвы и Московской области (n=13), Красноярска (n=3), Уфы (n=3) и Казани (n=5) показал, что распределение cagA положительного генотипа H.pylori не зависит от регионального распределения, поскольку CagA генотип был выявлен во всех клинических изолятах. VacAs1 генотип H.pylori был выявлен в 33% клинических изолятов из Красноярска и в 100% клинических изолятов из Уфы. Приблизительно одинаковое распределение vacAs1 гнотипа H.pylori встречается в Москве - 77% случаев и в Казани - 60% случаев. Интересно, что распределение vacAm1 генотипа H.pylori не имеет региональной специфичности и встречается в 20% клинических изолятов из Казани и в 33% клинических изолятов из Уфы. Нам не удалось выявить смешанных генотипов H.pylori в Уфе, в то время как в Красноярске 33% клинических изолятов соответствовали vacAs1/s2 генотипу. 31-33% клинических изолятов из Москвы и Уфы и 60-67% из Казани и Красноярска соответствовали vacAm1/m2 генотипу. IceA2 генотип был выявлен только в сочетании с iceA1 генотипом (38% клинических изолятов из Москвы и 60% из Казани). Среди клинических изолятов из Красноярска и Уфы данный генотип вообще не встречался. В клинических изолятах из Уфы и Красноярска в 100% случаев присутствовал iceA1 генотип. Этот же генотип в клинических изолятах из Москвы и Казани встречался в 46% и 40% случаев, соответственно. Значительно варьировало распределение babA2 положительного генотипа у клинических изолятов из различных регионов РФ. Так babA2 генотип встречался в 33% клинических изолятов из Уфы и в 100% клинических изолятов из Красноярска. Необходимо также отметить, что распределение babA генотипа по регионам РФ имеет ассиметричный характер по отношению к vacAs1 генотипу. Так, если в Красноярске и Уфе vacAs1 генотип встречался в 33% и 100% случаев, то babA2 генотип в 100% и 33%, соответственно. Суммируя приведенные выше результаты, можно предполагать, что распределение генотипов H.pylori в различных регионах РФ носит, скорее всего, не случайный характер.

Частота встречаемости и корреляция в vacA s1, cagA, babA и iceA1 в биопсиях и изолятах H.pylori Распределение генотипов cagA, vacA, iceA и babA2 H.pylori по регионам России Распределение генотипов cagA, vacA, iceA и babA2 H.pylori в Москве и Московской области vacA cagA iceA babA Тип 1 – сочетание vacA s1, cagA, babA, тип 2 - vacA s1, cagA, babA, iceA Распределение генотипов H.pylori при различных заболеваниях желудка Тип 1 – сочетание vacA s1, cagA, babA, тип 2 - vacA s1, cagA, babA, iceA Таким образом, важность представлений о распределении генотипов H.pylori при различных заболеваниях может быть обусловлена следующими фактами: штаммы СagA оказывают более значимое воздействие на прогноз заболевания, чем штаммы без СagA (M. Blaser, 1995; T. Cover, 1995; 1996); штаммы с типом s1VacA чаще ассоциированы с заболеваниями желудка, чем штаммы s2VacA (J. Ateron,1997); BabA2 штаммы H.pylori строго связаны с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки (Р=0.0002) и аденокарциномой (Р=0.033) в отличии от VacAs1 и CagA штаммов, которые ассоциированы только с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки (Р=0.004); и наконец, эффективность лечения также во многом зависит от генотипа H.pylori (L.. VanDoorn, 1997).

Данные о распределении генотипов H.pylori в различных регионах РФ во многом могут облегчить диагностику H.pylori-ассоциированных заболеваний в определенных географических районах. В нашей работе мы впервые попытались охарактеризовать распределение генотипов H.pylori в РФ, а также выявить возможность их ПЦР-анализа непосредственно из биопсий.

Географическое распределение генотипов клинических изолятов H.pylori обычно оценивают на основе анализа s и m локусов VacA. Для клинических изолятов H.pylori характерны два основных типа s-региона - s1 и s2, которые различаются как по размеру, так и по аминокислотной последовательности. Их высокая консервативность подтверждена работами T. Athreton и соавторами (1995), который изучал распределение генотипов в США. В настоящее время идентифицированы 3 субтипа: s1a, s1b и s1c.

В нашей работе показано, что наиболее часто генотип vacAs1 встречается в центральном регионе РФ – до 100% клинических изолятов H.pylori. Распределение vacAm1 достаточно равномерно по всем регионам и варьирует от 20% в Казани до 33% в Красноярске и Уфе. Наиболее распространенный генотип H.pylori в РФ vacA s1/m1.

Геном H.pylori содержит только одну копию гена vacA, поэтому регистрация смешанных генотипов свидетельствует о присутствии более чем одного штамма в клиническом образце. Нами была определена очень высокая доля смешанных генотипов H.pylori по vacA гену: 50% в биопсиях и 30-40% в клинических изолятах. В Голландии и Португалии доля смешанных генотипов H.pylori составляет 8 и 29%, соответственно. Этот феномен, вероятно, можно соотнести с уровнем инфицирования населения H.pylori. Так, в Португалии уровень инфицирования H.pylori взрослого населения составляет приблизительно 80%, в то время как в Голландии инфицировано всего 30% населения. В России 90%, а в некоторых регионах и 100% взрослого населения инфицированы H.pylori ( L. VanDoorn, 1998). Таким образом, риск коинфекции или суперинфекции смешанными штаммами может быть выше в странах с высоким уровнем инфицирования населения H.pylori по сравнению со странами с низким уровнем инфицирования. С другой стороны, до сих пор неизвестно, может ли инфекция смешанной культурой H.pylori увеличить риск серьезных клинических проявлений, таких как язва или рак желудка, также остается открытым вопрос о подходе к лечению таких пациентов.

Никакой специфичности распределения cagA гена по регионам РФ нами не обнаружено. Все проанализированные нами изоляты H.pylori, полученные из регионов РФ, содержали cagA ген (100%). Полученные данные значительно отличаются от распределения cagA в Северной и Восточной Европе – 71%, но сопоставимы с результатами, полученными во Франции и Португалии – 95 и 100%, соответственно.

Генотип iceA1 является маркером язвенной болезни желудка. Распределение генотипа iceA1 H.pylori в регионах РФ имеет большую географическую специфичность. Так, в Москве 46% клинических изолятов имели генотип iceA1, в Казани – 40% и 100% в Красноярске и Уфе. Интересно отметить достаточно большую разницу в частоте встречаемости генотипа iceA1 H.pylori между двумя соседними городами Казанью и Уфой и абсолютно полное совпадение частоты выявляемости этого генотипа в Красноярске и Уфе. Следует также отметить, что нами был зарегистрирован только генотип iceA1 H.pylori и ни одного клинического изолята с генотипом iceA2.

Нами также была отмечена неравномерность присутствия babA2 гена у H.pylori в различных регионах РФ. В Уфе babA2 ген был выявлен в 33% клинических изолятов, а в Красноярске в 100%. В работах Gerhard (для немецкой популяции) было продемонстрировано, что содержание babA2 гена строго ассоциировано с заболеваниями желудка.



Pages:   || 2 | 3 |


Похожие работы:

«Новые достижения в эмбриологии Кайхонг M.A., дипломированный врач, д.м.н. Бейджинг, Китай P-085 Влияние дефицита массы тела матери на морфокинетику эмбрионов по данным видеонаблюдения и анализа временных интервалов T. Фреур и соавт. Отделение биологии и репродуктивной медицины Университетский клинический центр Нант, Франция Введение • Исследование направлено на сравнение ранних морфокинетических параметров развития эмбрионов по данным Эмбриоскопа® • Выполненные в 2011 г. и 2012 г. циклы ИКСИ...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Тверской государственный университет УТВЕРЖДАЮ Декан факультета географии и геоэкологии _Е.Р. Хохлова 22 февраля 2010 г. Учебно-методический комплекс по дисциплине ГЕОМОРФОЛОГИЯ, 1 курс 020400.62 География очная форма обучения Обсуждено на заседании кафедры Составитель: физической географии и к.г.н., доцент региональной геоэкологии _А.Г. Жеренков _ февраля 2010 г. Протокол №...»

«МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ Синева Ирина Михайловна ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ В ПАЛЕОАНТРОПОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ КОСТЕЙ ВЕРХНЕЙ И НИЖНЕЙ КОНЕЧНОСТИ 03.03.02 – антропология по биологическим наукам ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: д.б.н. В.Ю. Бахолдина, д.м.н. В.Н. Звягин Москва – ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.. 1.1. Исследования в области определения...»

«РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Дальневосточное отделение Камчатский филиал Тихоокеанского института географии Публикации Камчатского филиала Тихоокеанского института географии ДВО РАН 2001-2004 гг. Аннотированный библиографический указатель Выпуск 3 Петропавловск-Камчатский 2005 2 УДК 016: 577 Публикации Камчатского филиала Тихоокеанского института географии ДВО РАН, 2001гг.: Аннотированный библиогр. указ. Вып.3. – Петропавловск-Камчатский: Изд-во Камчатпресс, 2005. – 108 с. Библиографический...»

«А. И. Угрюмов, В. П. Коровин НА ЛЬДИНЕ К СЕВЕРНОМ У ПОЛЮ СУ История полярных дрейфующих станций (? flf&/it ia ^4 #f m xjTjzsj, с? T ГИДРОМЕТЕОИЗДАТ САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2004 УДК 9 1 0.4 2 1 А. И. Угрюмов, В. П. Коровин. На льдине к Северному полюсу. История по­ лярных дрейфующих станций. Это простой и увлекательный рассказ об организации и проведении в жизнь крупнейшего экспедиционного проекта X X века — о дрейфующих научно-исследо­ вательских станциях в Северном Ледовитом океане со времени...»

«Санкт-Петербургский государственный университет биолого-почвенный факультет кафедра ихтиологии и гидробиологии МАТЕРИАЛЫ XV научного семинара Чтения памяти К.М.Дерюгина Санкт-Петербург 2013 Санкт-Петербургский государственный университет биолого-почвенный факультет кафедра ихтиологии и гидробиологии МАТЕРИАЛЫ XV научного семинара Чтения памяти К.М.Дерюгина (СПбГУ, кафедра ихтиологии и гидробиологии, 7.12.2012 г.) Санкт-Петербург 2013 В сборнике приведены материалы 15-го ежегодного научного...»

«СОДЕРЖАНИЕ ОТ РЕДАКТОРА..3 ВВЕДЕНИЕ..6 ГЛАВА 1. Характеристика природных условий района расположения Башкирского государственного природного заповедника.7 ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований.13 ГЛАВА 3. Синтаксономия лесов Башкирского государственного заповедника..15 3.1. Класс Vaccinio-Piceetea..21 3.1.1. Ассоциация Violo rupestris-Pinetum sylvestris.27 3.1.2. Ассоциация Pleurospermo uralensis-Pinetum sylvestris.28 3.1.3. Ассоциация Digitali grandiflorae-Pinetum sylvestris.29 3.2. Класс...»

«ЕВРОПЕЙСКАЯ ЭКОНОМИЧЕСКАЯ КОМИССИЯ ОРГАНИЗАЦИИ  ОБЪЕДИНЕННЫХ НАЦИЙ     КОМИТЕТ ПО ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ ПОЛИТИКЕ   КОНФЕРЕНЦИЯ ЕВРОПЕЙСКИХ СТАТИСТИКОВ     Совместная межсекторальная рабочая группа по экологическим показателям            Пятая  сессия  Женева, 4 – 6 июля 2012 г.   Пункт 5 предварительной  повестки  дня          ПОКАЗАТЕЛИ   по биологическому разнообразию, не включенные в  Руководство    Пересмотренная неофициальная записка Секретариата1 ...»

«УПРАВЛЕНИЕ ЭКОЛОГИИ И ПРИРОДНЫХ РЕСУРСОВ ЛИПЕЦКОЙ ОБЛАСТИ ДОКЛАД СОСТОЯНИЕ И ОХРАНА ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ЛИПЕЦКОЙ ОБЛАСТИ В 2013 ГОДУ Липецк – 2014 УДК -502.1 ББК – 20.1 (2Р-4Ли) Д 63 Состояние и охрана окружающей среды Липецкой области в 2013 году. Доклад. В докладе дан анализ современного состояния окружающей среды и природопользования на территории области и в муниципальных образованиях, отражено влияние экологических факторов среды обитания на здоровье человека. Также в данном издании приведены...»

«ПРОЕКТ УТВЕРЖДЕНА приказом Минприроды России от __2013г.№_ СХЕМА КОМПЛЕКСНОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ И ОХРАНЫ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ БАССЕЙНА РЕКИ ВОЛХОВ Книга 3 Целевые показатели Пояснительная записка 1 ПРОЕКТ Схема комплексного использования и охраны водных объектов Пояснительная записка к книге 3 Целевые показатели 1 Общая характеристика целевого состояния речного бассейна по завершении выполнения мероприятий схемы Общая схема рассматриваемой части бассейна реки Волхов с указанием административных единиц и...»

«Глава 5 РАЗНООБРАЗИЕ И ХОРОЛОГИЯ ОХРАНЯЕМЫХ РЕДКИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ На севере Восточной Европы одним из наиболее чувствительных показателей по отношению к антропогенным и техногенным воздействиям являются состояние растительного покрова и его изменение под влиянием этих факторов. Современное состояние растительности отдельных регионов – результат длительного развития под влиянием природных и антропогенных процессов. Причем антропогенные процессы в районах интенсивного освоения природных ресурсов...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ ГРОДНЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Кафедра энтомологии и биологической защиты растений Вредители зерновых культур Практическое пособие для слушателей факультета повышения квалификации и студентов агрономических специальностей Гродно 2010 УДК 633.1: 632.7(083.132) ББК 44.6 В 81 Автор: Л.Г. Слепченко. Рецензент: кандидат сельскохозяйственных наук Е.В. Сидунова. Вредители зерновых культур :...»

«Шошина Е.В., Капков В.И. Экологические особенности промысловых фукусовых. УДК 574.5 : 470.21 Е.В. Шошина, В.И. Капков Экологические особенности промысловых фукусовых водорослей Мурманского побережья Баренцева моря E.V. Shoshina, V.I. Kapkov Ecological features of harvesting fucoid algae of the Murman coast of the Barents Sea Аннотация. Проведено исследование экологических адаптационных приспособлений популяций фукусовых водорослей в составе литорального фитоценоза, которые обеспечивают...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Проект Формирование коллекции материалов, описывающих лучший опыт педагогов по использованию ЭОР в системе общего образования и организация информационной кампании по их продвижению в профессиональной и медиа коммуникационной среде Опыт комплексного применения информационнокоммуникационных технологий в школе ООО АГТ по заказу Министерства образования и науки РФ ООО АГТ по заказу Министерства образования и науки 1 ВЫБРАННЫЕ ШКОЛЬНЫЕ ПРАКТИКИ...»

«Колчуринский Н.Ю., Лунный А.Н. Происхождение человека от обезьяны – факт, гипотеза или миф? Москва, 2011 1 Содержание Вступление.. 4 Глава 1. Современные предки человека (автор Колчуринскийв Н.Ю., кандидат психологических наук)..8 §1.Конец Люси.. 8 §2. Король умер, да здравствует король? §3.Другие люди? §4. Эволюционно-антропологический гомункулюс 2010. 44 Глава 2. Как правильно интерпретировать данные по геномам древних людей? (автор - Лунный А.Н., доктор биологических наук).. 46...»

«КАТАЛОГ ПРОДУКЦИИ Ингредиенты для пищевой, косметической и фармацевтической промышленности СОДЕРЖАНИЕ ЗАО ТОРГОВЫЙ ДОМ ТОРГСИН 4 Эксклюзивные продукты ЗАО Торговый Дом Торгсин 6 НАШИ ОСНОВНЫЕ ПАРТНЕРЫ 10 DSM 11 Lallemand Inc 30 Lysi 38 Blue Macaw Flora 41 Cargill 43 Creagri 45 Emsland Group 46 QingdaoSamin 47 QH NUTRACEUTICALS Winner GmbH Ингредиенты для пищевой, фармацевтической и косметической промышленности ЗАО ТОРГОВЫЙ ДОМ ТОРГСИН 4 ЗАО Торговый дом Торгсин ШИРОКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ Самое ценное,...»

«Оренбургский государственный университет Научная библиотека Справочно-библиографический отдел Основы здорового питания Научно-вспомогательный указатель Оренбург 2009 1 УДК 019.9:613.2 (083.8) ББК 91.9:5я1 О-75 Основы здорового питания : науч.-вспом. указ. / под ред. Н. П. Заварыкиной ; сост. Н. К. Бикбова, М. А. Бушина, Н. Ю. Викулова. - Оренбург : ИПК ГОУ ОГУ, 2009. – с. В библиографическом указателе представлены описания книг, монографий, диссертаций, учебников, учебных пособий, статей из...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учрежение высшего профессионального образования Новосибирский национальный исследовательский государственный университет Факультет естественных наук Утверждаю Федорук М.П. План одобрен Ученым советом факультета Ректор УЧЕБНЫЙ ПЛАН Протокол № _ 20_ г. подготовки аспирантов 15.02. Форма обучения: очная 03.01. 03.01.03 - Молекулярная биология Кафедра Молекулярной биологии Квалификация...»

«ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА РОССИИ ПО ГИДРОМЕТЕОРОЛОГИИ И МОНИТОРИНГУ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ИНСТИТУТ ГЛОБАЛЬНОГО КЛИМАТА И ЭКОЛОГИИ ФЕДЕРАЛЬНОЙ СЛУЖБЫ РОССИИ ПО ГИДРОМЕТЕОРОЛОГИИ И МОНИТОРИНГУ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ И РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ЕЖЕГОДНИК СОСТОЯНИЯ ЭКОСИСТЕМ ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОД РОССИИ (по гидробиологическим показателям) 2011 год Под научной редакцией профессора, доктора биологических наук В. А. АБАКУМОВА МОСКВА УДК Ежегодник состояния экосистем...»

«ПРЕДИСЛОВИЕ В науках о земле почва занимает особое положение, так как она является биокосным телом, то есть производным взаимодействия живой части природы – биоты (растений, животных, микроорганизмов) с косной (мертвой) частью природы – горными породами. Этим объясняется большое внимание к изучению почвоведения, географии почв при подготовке специалистов по естественным наукам. Почва является непосредственным объектом изучения почвоведов. Наряду с этим вопросам почвоведения, географии почв...»




 
© 2014 www.kniga.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Книги, пособия, учебники, издания, публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.