WWW.KNIGA.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Книги, пособия, учебники, издания, публикации

 

Pages:   || 2 |

«Область изобретения Изобретение относится к способам получения нерекомбинантных штаммов Saccharomyces, к штаммам Saccharomyces и к их использованию. Предыдущий уровень ...»

-- [ Страница 1 ] --

010892

Область изобретения

Изобретение относится к способам получения нерекомбинантных штаммов Saccharomyces, к штаммам Saccharomyces и к их использованию.

Предыдущий уровень техники

Все ссылки, включая любые патенты или заявки на патенты, цитированные в данном описании,

включены в текст посредством ссылки. Никакого признания не делается относительно того, что любая ссылка составляет предыдущий уровень техники. Обсуждение ссылок точно определяет, что их авторы утверждают, и заявители оставляют за собой право оспаривать точность и применимость цитированных документов. Следует признать, что, хотя ряд публикаций предыдущего уровня техники рассматривается в данном описании, эта ссылка не должна истолковываться как признание того, что любой из рассматриваемых документов образует часть общего знания в данной области в Австралии или любой другой стране.

Одной из самых экономически важных групп дрожжей является род Saccharomyces, штаммы которого используют в пивоварении, хлебопечении, виноделии, винокурении и различных других отраслях промышленности, связанных с дрожжами. Виды Saccharomyces, определены филогенетически исследователем Kurtzman (2003) FEMS Yeast Research 3:417-432 и включают в себя S.cerevisiae, S.paradoxus, S.mikatae, S.cariocanus, S.kudriavzevii, S.pastorianus и S.bayanus.

Виды Saccharomyces являются одними из самых эффективных микроорганизмов, способствующих превращению сахаров, таких как глюкоза, фруктоза, сахароза и мальтоза, в биомассу, и брожению указанных сахаров до этанола. В результате виды Saccharomyces и, в частности, Saccharomyces cerevisiae, являются одними из самых широко используемых микроорганизмов в промышленных способах. Например, в пивоварении, винокурении и виноделии Saccharomyces используют для сбраживания сахаров, таких как глюкоза, фруктоза, сахароза и/или мальтоза, с образованием этанола. В производстве топливного этанола штаммы Saccharomyces cerevisiae выбирают из-за их способности быстро превращать высокие концентрации сахаров, таких как глюкоза, фруктоза, сахароза и мальтоза, в большие количества этанола.

В хлебопекарной промышленности штаммы Saccharomyces cerevisiae используют, главным образом, изза их способности образовывать двуокись углерода из сахаров, таких как глюкоза, фруктоза, сахароза и/или мальтоза, для выпечки хлеба из дрожжевого теста. Другие области применения Saccharomyces cerevisiae включают в себя производство дрожжевых экстрактов и других вкусовых и ароматизирующих продуктов, источников ферментов, таких как инвертаза, производство различных биохимических препаратов, промежуточных продуктов, белков, аминокислот рибонуклеиновых кислот и нуклеотидов, кофакторов и витаминов.

Миллионы тонн дрожжей выращивают каждый год в производственных процессах. Поэтому способность Saccharomyces расти на общеупотребительных и возобновляемых источниках углерода представляется важной с точки зрения рентабельности производства дрожжевой биомассы для промышленных целей и для получения экономически выгодных побочных продуктов метаболизма дрожжей. В частности, способность Saccharomyces к росту на отходах от других промышленных процессов имеет значение для окружающей среды и для экономики. Таким образом, например, биомассу хлебопекарных дрожжей часто получают путем выращивания дрожжей на мелассе, которая является отходом производства сахара, или на сиропах, богатых глюкозой и мальтозой, образующихся при промышленном гидролизе крахмала.

Сущность изобретения Изобретение относится к способу производства штамма Saccharomyces, который способен расти при желаемой скорости роста (такой как по меньшей мере одна генерация за 48 ч), используя ксилозу в качестве единственного источника углерода, и к штаммам Saccharomyces, которые растут на ксилозе с указанными скоростями роста, и к их использованию.

Ксилоза служит примером природного, общеупотребительного и возобновляемого сахара, доступного из растительной биомассы, который, как было показано ранее, микроорганизм Saccharomyces не способен утилизировать. См., например, публикацию Barnett et al. "Yeast Characteristics and Identification" 2nd edition (1990), Cambridge University Press, в которой авторы утверждают, что дрожжи вида Saccharomyces cerevisiae не способны утилизировать ксилозу в качестве единственного источника углерода для роста. Ксилоза является главным возможным источником для выращивания дрожжей и для промышленных продуктов, включающих этанол, из дрожжей. Использование ксилозы в качестве источника сахара для дрожжей создаст большие преимущества в области экономики и экологии. Например, производство топливного этанола из богатых ксилозой материалов должно быть основным источником возобновляемой энергии.

В первом аспекте изобретение относится к способу получения штамма Saccharomyces, который способен расти с желаемой скоростью роста, используя ксилозу в качестве единственного источника углерода для роста, включающему:

(a) обеспечение популяции генетически различных нерекомбинантных дрожжевых клеток Saccharomyces;

(b) культивирование дрожжевых клеток при условиях, которые допускают комбинирование ДНК -1между дрожжевыми клетками;

(c) проведение скринирования или селекции дрожжевых клеток в пользу дрожжевых клеток, которые имеют повышенную скорость роста при использовании ксилозы в качестве единственного источника углерода для роста;

(d) выделение одной или более дрожжевых клеток, которые проявляют желательную скорость роста.

Обычно дрожжевые клетки культивируют в условиях, которые допускают комбинирование ДНК между парами дрожжевых клеток.

Обычно желательной скоростью роста является увеличение скорости роста относительно скорости роста дрожжевых клеток штаммов Saccharomyces, к которым способ не был применен.

Например, штаммы Saccharomyces, такие как штамм NL67. Более характерно, желательной скоростью роста является по меньшей мере одна генерация за 48 ч, более характерно по меньшей мере одна генерация за 24 ч.

Обычно дрожжевые клетки подвергают скринированию или селекции в пользу дрожжевых клеток, которые имеют желательную скорость роста, путем инкубации дрожжевых клеток в среде или на среде, содержащей ксилозу. Обычно содержащей ксилозу средой является культуральная среда, содержащая ксилозу. Культуральная среда может содержать ксилозу в качестве единственного источника углерода, или ксилоза может быть одним из многих источников углерода. Обычно ксилоза является единственным источником углерода в среде, содержащей ксилозу. Обычно культуральная среда, содержащая ксилозу, является минимальной минеральной средой, содержащей ксилозу. Обычно дрожжевые клетки инкубируют на среде или в среде, содержащей ксилозу, в течение достаточного периода времени, чтобы клетки приобрели желательную скорость роста, используя ксилозу в качестве источника углерода для роста.

В одном воплощении изобретения прошедшие скринирование или отобранные дрожжевые клетки образуют популяцию генетически различных нерекомбинантных дрожжевых клеток, и стадии (b) и (с) повторяют до тех пор, пока не получат дрожжевые клетки с желательной скоростью роста.

В одном варианте осуществления изобретения стадию (b) выполняют до стадии (с). В другом варианте осуществления изобретения стадию (с) выполняют до стадии (b). B еще другом варианте осуществления изобретения стадии (b) и (с) выполняют одновременно.

Во втором аспекте изобретение относится к способу получения штамма Saccharomyces в культуре, который способен расти при желательной скорости, используя ксилозу в качестве единственного источника углерода для роста, включающему:

(a) обеспечение популяции генетически различных нерекомбинантных дрожжевых клеток Saccharomyces;

(b) культивирование дрожжевых клеток при условиях, которые допускают комбинирование ДНК между дрожжевыми клетками;

(c) проведение скрининга или селекции дрожжевых клеток путем инкубации дрожжевых клеток на среде или в среде, содержащей ксилозу;

(d) повторение стадий (b) и (с) с прошедшими скринирование или отобранными клетками, образующими популяцию генетически различных нерекомбинантных дрожжевых клеток Saccharomyces, до тех пор, пока одна или более дрожжевых клеток не приобретут способность расти при желаемой скорости роста, используя ксилозу в качестве единственного источника углерода для роста.

Обычно способ включает в себя дополнительную стадию (е) выделения одной или более дрожжевых клеток, растущих при желательной скорости роста. В одном воплощении изобретения одна или более дрожжевых клеток, которые выделяют, представляют один штамм Saccharomyces. B другом воплощении изобретения одна или более дрожжевых клеток, которые выделяют, представляют популяцию генетически различных клеток дрожжей.

В одном варианте осуществления изобретения дрожжевые клетки подвергают отбору на стадии (с).

Дрожжевые клетки могут быть отобраны на стадии (с) путем инкубации дрожжевых клеток на среде или в среде, содержащей ксилозу, в течение достаточного периода времени, чтобы дрожжевые клетки проявили способность к росту на ксилозе как на единственном источнике углерода, чтобы расти, используя ксилозу в качестве источника углерода, и, впоследствии, путем сбора выращенных дрожжевых клеток.

Дрожжевые клетки могут быть подвергнуты селекции на стадии (с) путем инкубации дрожжевых клеток на среде или в среде, содержащей ксилозу, в течение периода времени, достаточного для того, чтобы дрожжевые клетки достигли повышенной скорости роста, используя ксилозу в качестве единственного источника углерода, чтобы расти при использовании ксилозы как источника углерода, и, после этого, путем сбора выращенных дрожжевых клеток.

В другом варианте осуществления изобретения дрожжевые клетки подвергают скринированию на стадии (с). Дрожжевые клетки могут быть подвергнуты скринированию на стадии (с) путем инкубации дрожжевых клеток на среде или в среде, содержащей ксилозу, в течение достаточного периода времени, чтобы дрожжевые клетки достигли повышенной скорости роста при использовании ксилозы в качестве единственного источника углерода для того, чтобы расти, используя ксилозу как источник углерода, и потом путем сбора дрожжевых клеток, которые имеют повышенную скорость роста, используя для роста -2ксилозу как источник углерода.

Также предполагают, что в части повторений стадий (b) и (с) дрожжевые клетки должны быть отобраны, и в части повторений стадий (b) и (с) дрожжевые клетки должны быть скринированы.

Стадии (b) и (с) могут быть повторены любое число раз, достаточное для того, чтобы получить дрожжевой штамм, который окажется способным к росту при желательной скорости, используя ксилозу в качестве единственного источника углерода для роста. Специалисты в данной области должны признать, что число раз повторяемых стадий (b) и (с) будет зависеть от среды, которая используется, исходных штаммов дрожжей, условий культивирования и т.д. В одном воплощении изобретения стадии (b) и (с) повторяют по меньшей мере один раз, обычно по меньшей мере 2 раза, более предпочтительно по меньшей мере 5 раз, даже более предпочтительно по меньшей мере 10 раз, еще более предпочтительно по меньшей мере 20 раз, подходяще по меньшей мере 30 раз.

Дрожжевые клетки могут быть подвергнуты скринированию или селекции на твердой среде или в жидкой среде, содержащей в обоих случаях ксилозу. В одном воплощении изобретения клетки подвергают скринированию или селекции на твердой среде, содержащей ксилозу. В другом воплощении изобретения клетки подвергают скринированию или селекции в жидкой среде, содержащей ксилозу. В еще другом варианте осуществления изобретения клетки подвергают скринированию или селекции на твердой среде, содержащей ксилозу, с последующим скринированием или отбором в жидкой среде, содержащей ксилозу. Например, дрожжевые клетки могут быть подвергнуты скринированию или селекции множество раз путем повторения стадий (b) и (с), используя твердую среду, содержащую ксилозу, с последующим скринированием или отбором множество раз путем повторения стадий (b) и (с), используя жидкую среду, содержащую ксилозу.

Твердая среда, содержащая ксилозу, может быть любой твердой средой, которая содержит ксилозу в качестве источника углерода и которая обеспечивает избирательное предпочтение по отношению к штамму, способному утилизировать ксилозу как единственный источник углерода. Например, содержащая ксилозу твердая среда может быть сложной твердой средой, в которой ксилоза является одним из множества источников углерода, или содержащая ксилозу твердая среда может быть минимальной твердой средой, в которой ксилоза является единственным источником углерода. Обычно содержащая ксилозу твердая среда будет твердой минимальной средой, содержащей ксилозу в качестве единственного источника углерода.

Жидкая среда, содержащая ксилозу, может быть любой жидкой средой, которая содержит ксилозу в качестве источника углерода. Например, жидкая, содержащая ксилозу среда может быть сложной жидкой средой, в которой ксилоза является одним из множества источников углерода, или жидкая, содержащая ксилозу среда может быть минимальной жидкой средой, в которой ксилоза является единственным источником углерода. Обычно жидкая, содержащая ксилозу среда будет жидкой минимальной средой, содержащей ксилозу в качестве единственного источника углерода. Обычно жидкая минимальная среда является минимальной минеральной средой, содержащей ксилозу в качестве единственного источника углерода.

Желательная скорость роста обычно составляет, по меньшей мере, одну генерацию за 48 ч. Желательная скорость роста может быть выше, чем одна генерация за 24 ч. Желательная скорость роста может быть выше, чем одна генерация за 12 ч. Желательная скорость роста может быть выше, чем одна генерация за 10 ч. Желательная скорость роста может быть выше, чем одна генерация за 8 ч. Желательная скорость роста может быть выше, чем одна генерация за 4 ч. Желательная скорость роста может быть выше, чем одна генерация за 2 ч.

Получаемый штамм Saccharomyces может быть штаммом из любого вида рода Saccharomyces, который способен расти при желательной скорости роста, используя ксилозу в качестве единственного источника углерода. Квалифицированные специалисты в данной области должны признать, что получаемый штамм будет зависеть от видов, которые образуют генетически различную популяцию нерекомбинантных дрожжевых клеток Saccharomyces. Примеры соответствующих видов дрожжей включают S.cerevisiae, S.paradoxus, S.mikatae, S.cariocanus, S.kudriavzevii, S.pastorianus и S.bayanus. Обычно штамм является штаммом вида Saccharomyces cerevisiae. Обычно штамм должен проявлять способность к спариванию с Saccharomyces такого же вида. Обычно штамм должен быть способен спариваться с Saccharomyces cerevisiae.

Дрожжи могут быть культивированы при любых условиях, которые допускают комбинацию ДНК между дрожжевыми клетками, при условии, что комбинирование ДНК не осуществляется методами рекомбинации. Дрожжевые клетки могут быть культивированы при условиях, которые позволяют комбинацию ДНК между дрожжевыми клетками, например, посредством спаривания или цитодукции или любыми другими методами, известными в данной области для комбинации ДНК дрожжевых клеток, отличными от рекомбинантных методов. В одном варианте осуществления изобретения дрожжевые клетки культивируют при условиях, которые позволяют спаривать дрожжевые клетки. Обычно спаривание дрожжей включает в себя процесс спорообразования, проращивания спор и спаривание проросших спор.

Способы спаривания дрожжей известны специалистам в данной области и описаны в публикациях, например, Fowell (1969) "Sporulation and hybridization of yeast", in The Yeasts (A.H. Rose and J.S. Harrison, genetic manipulations of industrial yeasts" in, Topics in Current Genetics, Vol. 2. Functional Genetics of Industrial Yeasts (J.H. de Winde, ed.), Springer-Verlag Berlin Heidelberg, или способы могут быть комбинированы.

Популяция генетически различных нерекомбинантных клеток дрожжей может представлять собой природные изоляты Saccharomyces из любого источника, изоляты Saccharomyces, подвергшиеся спонтанной мутации, или могут быть получены путем воздействия мутагена на один или более штаммы Saccharomyces. Популяцию генетически различных нерекомбинантных клеток дрожжей могут представлять собой штаммы из одного вида или штаммы из множества видов. Виды, подходящие для использования в качестве генетически различной популяции нерекомбинантных клеток дрожжей, включают в себя S. cerevisiae, S. paradoxus, S. mikatae, S. cariocanus, S. kudriavzevii, S. pastorianus и S. bayanus. Обычно штаммы представлены видом Saccharomyces cerevisiae. Обычно штаммы проявляют способность спариваться с Saccharomyces такого же вида. Обычно штаммы проявляют способность спариваться с Saccharomyces cerevisiae.

Специалистам в данной области будет очевидно, что кроме популяции генетически различных нерекомбинантных клеток дрожжей, рекомбинантные дрожжевые клетки могут быть включены на стадии (b) и (с) как отдельная популяция.

В третьем аспекте изобретение относится к способу генерации производного штамма Saccharomyces с повышенной скоростью роста, использующего ксилозу в качестве единственного источника углерода для роста, включающему:

(a) получение дрожжевых клеток штамма как части популяции генетически различных клеток дрожжей Saccharomyces;

(b) культивирование популяции генетически различных нерекомбинантных клеток дрожжей Saccharomyces при условиях, которые допускают комбинирование ДНК между клетками дрожжей в популяции;

(c) проведение скринирования или отбора дрожжевых клеток в пользу производных штамма, которые обладают повышенной скоростью роста на ксилозе;

(d) выделение одного или более производных штамма, которые обладают повышенной скоростью роста при использовании ксилозы в качестве единственного источника углерода относительно скорости роста штамма, использующего ксилозу как единственного источника углерода.

Обычно клетки дрожжей подвергают скринингу или селекции путем инкубации дрожжевых клеток на среде или в среде, содержащей ксилозу.

В одном воплощении изобретения клетки дрожжей подвергают отбору на стадии (с). Клетки дрожжей могут быть отобраны на стадии (с) путем инкубации дрожжевых клеток на среде или в среде, содержащей ксилозу, в течение достаточного периода времени, чтобы клетки дрожжей смогли приобрести способность к росту на ксилозе как на единственном источнике углерода для роста, используя ксилозу в качестве источника углерода. Клетки дрожжей могут быть отобраны на стадии (с) путем инкубации дрожжевых клеток на среде или в среде, содержащей ксилозу, в течение достаточного периода времени, чтобы клетки дрожжей имели повышенную скорость роста при использовании ксилозы как единственного источника углерода для роста, используя ксилозу в качестве источника углерода.

В другом воплощении изобретения клетки дрожжей подвергают скринированию на стадии (с).

Дрожжевые клетки могут быть скринированы на стадии (с) путем инкубации дрожжевых клеток на среде или в среде, содержащей ксилозу, в течение достаточного периода времени, чтобы клетки дрожжей достигли повышенной скорости роста при использовании ксилозы как единственного источника углерода для того, чтобы расти, используя ксилозу в качестве источника углерода, и после этого путем сбора клеток дрожжей, которые растут с наибольшей скоростью, используя ксилозу в качестве источника углерода.

Стадии (b) и (с) могут быть повторены, благодаря чему производные штамма образуют, по меньшей мере, часть популяции генетически различных штаммов Saccharomyces до тех пор, пока одно или более производных не приобретут способность к повышенной скорости роста на ксилозе как на единственном источнике углерода для роста.

В прошлом для того, чтобы обратиться к проблеме неспособности Saccharomyces cerevisiae использовать ксилозу, другие исследователи использовали технологии рекомбинантных ДНК для введения генов, полученных из дрожжей, которые могли утилизировать ксилозу в качестве источника углерода, чтобы Saccharomyces приобрели способность утилизировать ксилозу (например, Sonderegger and Sauer (2003) Applied and Environmental Microbiology 69: 1990-1998). В этих подходах гены для утилизации ксилозы были клонированы из организмов, которые были способны утилизировать ксилозу для роста, и потом внесены в Saccharomyces cerevisiae. Например, ксилозаизомераза грибов из вида Piromyces была интегрирована в геном Saccharomyces cerevisiae, чтобы производить штаммы, которые растут медленно на ксилозе как на единственном источнике углерода (Kuyper et al. 2003). Ксилозаредуктаза из Pichia stipitis также была клонирована в Saccharomyces cerevisiae, чтобы производить дрожжи, которые могли бы утилизировать ксилозу как единственный источник углерода для роста (Wahlbom et al. 2003).

(GRAS), и если рекомбинантные технологии используют, чтобы получить штаммы Saccharomyces cerevisiae, которые утилизируют ксилозу, то они теряют статус GRAS. Поэтому с точки зрения промышленной и экономической выгоды необязательно использовать штаммы Saccharomyces cerevisiae, которые содержат гены из других родов или видов, или которые получают с помощью технологий рекомбинантных ДНК. Действительно, штаммы, которые получены посредством технологий рекомбинантных ДНК, не применяются в промышленности, где существуют социально-политические или экологические или другие барьеры к использованию таких штаммов.

Использование технологий рекомбинантных ДНК уменьшает перспективы и желательность для использования дрожжей в пищевых продуктах для человека и т.д., в то время как нерекомбинантные штаммы могли бы быть использованы преимущественно в пищевых продуктах для человека. Возможность использования нерекомбинантных дрожжей одновременно для получения этанола и пищевых продуктов для человека создает благоприятные условия для повышения экономической эффективности способов, основанных на дрожжах. Например, можно использовать нерекомбинантные дрожжи, чтобы превратить ксилозу в этанол и дрожжевую биомассу. Этанол можно использовать для топлива и других целей, тогда как получаемые дрожжи могут найти свое применение в других ценных приложениях, таких как производство экстрактов или других побочных продуктов.

Авторы изобретения обнаружили, что при инкубации нерекомбинантных штаммов Saccharomyces дикого типа на среде, содержащей ксилозу в качестве единственного источника углерода, наблюдается очень медленный рост на ксилозе. Это наблюдение не соответствует данным предыдущего уровня техники, которые четко указывают на то, что микроорганизм Saccharomyces не способен расти на ксилозе.

Изобретатели полагают, что рост Saccharomyces на ксилозе был настолько медленным, что он не мог быть определен. Как описано в тексте, изобретатели обнаружили, что когда твердую минимальную минеральную среду, содержащую ксилозу в качестве единственного источника углерода, засевали штаммами Saccharomyces cerevisiae дикого типа, рост определяли посредством микроскопических исследований колоний после инкубации в течение 2 месяцев при 30°C. Хотя обнаруживаемый рост клеток дрожжей позволяет применять нерекомбинантные стратегии для производства дрожжей с повышенными скоростями роста, наблюдаемая замедленная скорость роста не имеет промышленного приложения.

Изобретатели расширили полученные ими сведения о том, что клетки дрожжей Saccharomyces способны очень медленно расти на ксилозе как на единственном источнике углерода, с целью разработки штаммов Saccharomyces, которые могли бы расти на ксилозе как на единственном источнике углерода при скоростях, намного превышающих скорости роста штаммов Saccharomyces, к которым способ согласно настоящему изобретению не относится. До открытия, сделанного авторами изобретения, невозможно было представить, что инкубация клеток дрожжей Saccharomyces в среде или на среде, содержащей ксилозу в качестве единственного источника углерода, может привести к какому-либо отбору или обогащению дрожжевых клеток, способных к росту на ксилозе, поскольку полагали, что дрожжи не могут расти в среде из-за ксилозы, которую рассматривали как непригодный источник углерода для Saccharomyces. Однако, используя свои открытия и комбинацию стратегий отбора и способов, таких как спаривание популяций генетически различных штаммов Saccharomyces, соответственно штаммов Saccharomyces cerevisiae, изобретатели обнаружили, что могут быть получены штаммы Saccharomyces, которые проявляют способность к росту на твердой среде и/или в жидкой среде, содержащей ксилозу в качестве единственного источника углерода, при скоростях, превышающих скорости роста штаммов Saccharomyces, к которым способы согласно настоящему изобретению не были применены. Кроме того, авторы изобретения обнаружили, что при использовании стратегий отбора и способов, таких как спаривание генетически различных штаммов Saccharomyces, могут быть получены штаммы Saccharomyces, скорость роста которых при использовании ксилозы в качестве единственного источника углерода составляет по меньшей мере одну генерацию за 48 ч, и в некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения скорость роста может быть выше, чем одна генерация за 4 ч. Таким образом, используя нерекомбинантные способы, изобретатели смогли получить штаммы Saccharomyces, которые проявляли способность к росту в жидкой среде и на твердой среде, содержащей ксилозу как единственный источник углерода, при скоростях, применяемых в промышленных целях.

В четвертом аспекте изобретение относится к штамму Saccharomyces, полученному способом первого-третьего аспектов изобретения.

В пятом аспекте изобретение относится к выделенному штамму Saccharomyces, который проявляет способность к росту со скоростью, составляющей по меньшей мере одну генерацию за 48 ч, при использовании ксилозы в качестве единственного источника углерода для роста, где штамм производит:

(i) 5-кратное увеличение биомассы в условиях роста, установленных в тесте T1; и (ii) по меньшей мере 10 мг сухого веса биомассы в условиях роста, установленных в тесте Т2, и где штамм получен способом первого-третьего аспектов.

В шестом аспекте изобретение относится к выделенному штамму Saccharomyces, который проявляет способность к росту со скоростью, составляющей по меньшей мере одну генерацию за 48 ч, используя для роста ксилозу в качестве единственного источника углерода, где:

T1; и (ii) штамм производит по меньшей мере 50 мг сухого веса биомассы в условиях роста, установленных в тесте Т2; и (iii) по меньшей мере 0,1 г/л этанола определяется в условиях, заданных в тесте Т3; и (iv) по меньшей мере 1 наномоль NAD(P)H восстанавливается или окисляется в минуту на мг белкового экстракта при 30°C в условиях, заданных в тесте Т4; и (v) по меньшей мере 1 наномоль NAD(P)H восстанавливается или окисляется в минуту на мг белкового экстракта при 30°C в условиях, заданных в тесте Т5; и где штамм получен способом первоготретьего аспектов.

В седьмом аспекте изобретение относится к выделенному штамму Saccharomyces, который проявляет способность к росту со скоростью, составляющей по меньшей мере одну генерацию за 48 ч, используя для роста ксилозу в качестве единственного источника углерода, где (i) штамм производит по меньшей мере 5-кратное увеличение биомассы в условиях роста, установленных в тесте Tl; и (ii) штамм производит по меньшей мере 40 мг сухого веса биомассы в условиях роста, установленных в тесте Т2; и (iii) по меньшей мере 1 наномоль NAD(P)H восстанавливается или окисляется в минуту на мг белкового экстракта при 30°C в условиях, заданных в тесте Т4; и (iv) по меньшей мере 1 наномоль NAD(P)H восстанавливается или окисляется в минуту на мг белкового экстракта при 30°C в условиях, заданных в тесте Т5; и (v) штамм производит по меньшей мере 5-кратное увеличение биомассы в условиях, заданных в тесте Т7;

(vi) концентрация по меньшей мере 0,04 г/л этанола определяется в условиях, заданных в тесте Т8;

и где штамм получен способом первого-третьего аспектов.

В одном варианте четвертого-седьмого аспектов штамм продуцирует по меньшей мере 0,2 г этанола на литр в течение 4 месяцев в условиях, установленных в тесте Т9.

В восьмом аспекте изобретение относится к выделенному штамму Saccharomyces, который проявляет способность к росту со скоростью, составляющей по меньшей мере одну генерацию за 48 ч, используя для роста ксилозу в качестве единственного источника углерода, где способность штамма утилизировать ксилозу как единственный источник углерода приобретается с помощью нерекомбинантных методов.

Скорость роста штамма может быть любой скоростью, которая составляет по меньшей мере одну генерацию за 48 ч. Скорость роста может составлять по меньшей мере одну генерацию за 36 ч. Скорость роста может быть выше, чем одна генерация за 24 ч. Скорость роста может быть выше, чем одна генерация за 12 ч. Скорость роста может быть выше, чем одна генерация за 10 ч. Скорость роста может быть выше, чем одна генерация за 8 ч. Скорость роста может быть выше, чем одна генерация за 6 ч. Скорость роста может быть выше, чем одна генерация за 4 ч. Скорость роста может быть выше, чем одна генерация за 2 часа. Скорость роста может быть выше, чем одна генерация за 80 мин.

В одном воплощении изобретения штамм проявляет способность к росту, используя ксилозу в качестве единственного источника углерода, со скоростью, которая, в основном, такая же, как скорость роста штамма, использующего глюкозу в качестве единственного источника углерода для роста.

В одном воплощении изобретения скорость роста штамма составляет по меньшей мере одну генерацию за 48 ч на минимальной минеральной среде, содержащей ксилозу.

В одном воплощении изобретения штамм производит 2-кратное увеличение биомассы в условиях роста, установленных в тесте T1. Обычно штамм производит по меньшей мере 5-кратное увеличение биомассы в условиях роста, установленных в тесте T1. Подходяще, штамм производит по меньшей мере 10-кратное увеличение биомассы в условиях роста, установленных в тесте T1.

В одном воплощении изобретения штамм производит по меньшей мере 0,01 сухого веса биомассы на 50 мл культуры в условиях роста, установленных в тесте Т2.

В различных воплощениях изобретения:

(i) штамм экспрессирует нерекомбинантный фермент, проявляющий по меньшей мере 1 единицу активности ксилозаредуктазы в условиях, установленных в тесте Т4;

(ii) штамм экспрессирует нерекомбинантный фермент, проявляющий по меньшей мере 1 единицу активности ксилитдегидрогеназы в условиях, установленных в тесте Т5;

iii) штамм экспрессирует нерекомбинантный фермент, проявляющий по меньшей мере 1 единицу активности ксилозаредуктазы в условиях, установленных в тесте Т4, нерекомбинантный фермент, проявляющий по меньшей мере 1 единицу активности ксилитдегидрогеназы в условиях, установленных в тесте Т5.

В девятом аспекте изобретение относится к выделенному штамму Saccharomyces, который проявляет способность к росту со скоростью, составляющей по меньшей мере одну генерацию за 48 ч, используя для роста ксилозу в качестве единственного источника углерода, и который способен экспрессировать нерекомбинантный фермент, обладающий активностью, выбранной из группы, состоящей из ксилозаредуктазной активности и ксилитдегидрогеназной активности, где ксилозаредуктазная активность составляет по меньшей мере 1 единицу при определении по тесту Т4, и ксилитдегидрогеназная активность составляет по меньшей мере 1 единицу при определении в условиях, установленных в тесте Т5.

Штамм может проявлять способность к экспрессии нерекомбинантного фермента, имеющего ксилозаредуктазную активность, и нерекомбинантного фермента, имеющего ксилитдегидрогеназную активность. В одном варианте осуществления изобретения штамм проявляет способность к экспрессии нерекомбинантного фермента, имеющего ксилулозакиназную активность, в добавление к одному или более нерекомбинантных ферментов, имеющих активность, выбранную из группы, состоящей из ксилозаредуктазной активности и ксилитдегидрогеназной активности. Обычно ксилулозакиназная активность составляет по меньшей мере 5 единиц при определении тестом Т6.

Обычно штамм девятого аспекта имеет скорость роста, составляющую по меньшей мере одну генерацию за 48 ч, при использовании ксилозы в качестве единственного источника углерода.

В одном воплощении изобретения штамм производит по меньшей мере 2-кратное увеличение биомассы в условиях роста, установленных в тесте T1. Обычно штамм производит по меньшей мере 5кратное увеличение биомассы в условиях роста, установленных в тесте T1. Более характерно, штамм производит по меньшей мере 5-кратное увеличение биомассы в условиях роста, установленных в тесте T1.

Штамм может производить по меньшей мере 10 мг сухого веса биомассы в условиях, установленных в тесте Т2. Штамм может производить по меньшей мере 30 мг сухого веса биомассы в условиях, установленных в тесте Т2. Штамм может производить по меньшей мере 40 мг сухого веса биомассы в условиях, установленных в тесте Т2. Обычно штамм производит по меньшей мере 50 мг сухого веса биомассы в условиях, установленных в тесте Т2.

Штамм может производить по меньшей мере 0,01 г сухого веса биомассы на 50 мл культуры в условиях роста, установленных в тесте Т2.

Штамм Saccharomyces также может проявлять способность к утилизации ксилита в качестве единственного источника углерода для роста. Обычно способность штамма утилизировать ксилит как единственный источник углерода приобретается посредством нерекомбинантных методов.

В одном варианте осуществления изобретения штамм производит по меньшей мере 5-кратное увеличение биомассы в условиях роста, установленных в тесте Т7.

Штамм Saccharomyces может расти в аэробных или анаэробных условиях, используя ксилозу в качестве единственного источника углерода. Обычно рост является аэробным ростом. Однако штамм Saccharomyces также может расти в анаэробных условиях или микроаэрофильных условиях, используя ксилозу как единственный источник углерода.

Штамм Saccharomyces может расти на глюкозе в анаэробных условиях.

Штамм Saccharomyces также может утилизировать ксилозу для продуцирования одного или более соединений, основанных на углероде. Примеры соответствующих основанных на углероде соединений включают в себя спирты, ксилит, органические кислоты, такие как уксусная кислота, глицерин, двуокись углерода или другие компоненты дрожжей, метаболиты и побочные продукты, включающие дрожжевые экстракты, белки, пептиды, аминокислоты, РНК, нуклеотиды, глюканы и т.д. Обычно спиртом является этанол.

Штамм может продуцировать этанол при выращивании на ксилозе. Штамм может использовать ксилозу, чтобы продуцировать этанол без выращивания на ксилозе. Штамм может производить этанол из ксилозы. Обычно штамм подвергает ксилозу сбраживанию с образованием спирта.

Штамм может продуцировать этанол при концентрации по меньшей мере 0,1 г/л в условиях, заданных в тесте ТЗ.

Штамм может продуцировать этанол при концентрации по меньшей мере 0,4 г/л в условиях, заданных в тесте Т8.

Штамм может продуцировать по меньшей мере 0,2 г этанола на литр в течение 4 месяцев в условиях, заданных в тесте Т9.

Штамм может продуцировать по меньшей мере 0,5 г этанола на литр, когда осуществляют инокуляцию при плотности клеток по меньшей мере 5108 клеток на мл в минимальную минеральную среду, содержащую ксилозу. Минимальная минеральная среда, содержащая ксилозу, может содержать глюкозу.

Обычно штамм продуцирует 0,5 г/л этанола в течение 5 ч инокуляции среды.

В одном воплощении изобретения штамм вызывает брожение ксилозы с образованием по меньшей мере 0,05 г этанола на литр культуры в условиях, заданных в тесте Т3.

Штамм может утилизировать ксилозу как единственный источник углерода для роста на твердой среде и/или в жидкой среде. В одном воплощении изобретения штамм способен расти в жидкой среде, содержащей ксилозу в качестве единственного источника углерода. Жидкая среда может быть жидкой минеральной средой, содержащей ксилозу в качестве единственного источника углерода.

Штамм Saccharomyces может быть штаммом из любого вида рода Saccharomyces. Примеры соответствующих видов дрожжей включают в себя S. cerevisiae, S. paradoxus, S. mikatae, S. cariocanus, S.

kudriavzevii, S. pastorianus и S. bayanus. Обычно видом является Saccharomyces cerevisiae. Обычно штамм -7проявляет способность к спариванию с Saccharomyces такого же вида. Обычно штамм проявляет способность к спариванию с Saccharomyces cerevisiae. Обычно штаммом является Saccharomyces cerevisiae.

В одном варианте восьмого или девятого аспектов штамм Saccharomyces является рекомбинантным.

В десятом аспекте изобретение относится к выделенному нерекомбинантному штамму Saccharomyces, который производит увеличение биомассы по меньшей мере в 2 раза в условиях, заданных в тесте T1.

В одном воплощении изобретения увеличение биомассы составляет по меньшей мере 5 раз, обычно по меньшей мере 10 раз.

В одиннадцатом аспекте изобретение относится к выделенному нерекомбинантному штамму Saccharomyces, который обладает следующими характеристиками:

(a) биомасса штамма увеличивается по меньшей мере в 5 раз в условиях, заданных в тесте T1;

(b) по меньшей мере 10 мг сухого веса биомассы производится в условиях, заданных в тесте Т2. В двенадцатом аспекте изобретение относится к выделенному нерекомбинантному штамму Saccharomyces, который обладает следующими характеристиками:

(a) биомасса штамма увеличивается по меньшей мере в 10 раз в условиях, заданных в тесте T1;

(b) по меньшей мере 50 мг сухого веса биомассы производится в условиях, заданных в тесте Т2;

(c) концентрация по меньшей мере 0,1 г/л этанола определяется в условиях, заданных в тесте Т3;

(d) по меньшей мере 1 наномоль NAD(P)H восстанавливается или окисляется в минуту на мг белкового экстракта при 30°C в условиях, заданных в тесте Т4; и (e) по меньшей мере 1 наномоль NAD(P)H восстанавливается или окисляется в минуту на мг белкового экстракта при 30°C в условиях, заданных в тесте Т5.

В тринадцатом аспекте изобретение относится к выделенному нерекомбинантному штамму Saccharomyces, который обладает следующими характеристиками:

(a) биомасса штамма увеличивается по меньшей мере в 5 раз в условиях, заданных в тесте T1;

(b) по меньшей мере 40 мг сухого веса биомассы производится в условиях, заданных в тесте Т2;

(c) биомасса штамма увеличивается по меньшей мере в 5 раз в условиях, заданных в тесте Т7;

(d) концентрация по меньшей мере 0,04 г/л этанола определяется в условиях, заданных в тесте Т8;

(e) по меньшей мере 1 наномоль NAD(P)H восстанавливается или окисляется в минуту на мг белкового экстракта при 30°C в условиях, заданных в тесте Т4; и (f) по меньшей мере 1 наномоль NAD(P)H восстанавливается или окисляется в минуту на мг белкового экстракта при 30°C в условиях, заданных в тесте Т5.

Примерами подходящих штаммов Saccharomyces, которые проявляют способность к росту со скоростью, составляющей по меньшей мере одну генерацию за 48 ч, используя для роста ксилозу в качестве единственного источника углерода, являются такие штаммы, которые депонированы согласно Будапештскому соглашению по международному признанию депонирования микроорганизмов для процедуры выдачи патента при правительственных аналитических лабораториях Австралии, 1 Suakin Street, Pymble, NSW 2073, Australia, под депозитными инвентарными номерами NM04/41257, NM04/41258, NM05/ (ISO 10) и NM05/45178 (ISO 7). Штаммы под депозитными инвентарными номерами NM04/41257 и NM04/41258 были депонированы 12 мая 2004. Штаммы под депозитными инвентарными номерами NM05/4 5177 и NM05/45178 были депонированы 16 мая 2005.

Штамм Saccharomyces может быть получен любым способом, указанным в тексте, в котором способность утилизировать ксилозу в качестве единственного источника углерода достигают нерекомбинантными методами. Способы, которые могут быть использованы для получения штамма, включают в себя комбинации природного отбора, процедур спаривания, мутагенеза или другие так называемые классические генетические методы, известные специалистам в данной области и обсуждаемые, например, в публикации Attfield and Bell (2003) "Genetics and classical genetic manipulations of industrial yeasts" in, Topics in Current Genetics, Vol. 2. Functional Genetics of Industrial Yeasts (J.H. de Winde, ed.), Springer-Verlag Berlin Heidelberg, или способы могут быть комбинированными.

Способность к росту со скоростью, составляющей по меньшей мере одну генерацию за 48 ч, при использовании ксилозы в качестве единственного источника углерода достигается путем спаривания между штаммами Saccharomyces и проведения скринирования или селекции в пользу штаммов с повышенной скоростью роста, используя ксилозу как единственный источник углерода.

Например, штамм может быть получен путем проведения нечастых или направленных или множественных спариваний между совместимыми по половому признаку штаммами Saccharomyces с последующим отбором штаммов, способных утилизировать ксилозу как единственный источник углерода.

Штамм может быть произведен из одного или более природных изолятов Saccharomyces, изолятов, подвергшихся спонтанной мутации, или он может быть получен путем воздействия мутагена на один или большее количество штаммов Saccharomyces и потом использован в стратегиях спаривания и селекции для того, чтобы скринировать или отобрать мутантный штамм, который способен утилизировать ксилозу как единственный источник углерода. Полученный штамм может быть отобран любым из способов селекции, рассматриваемых в данном описании.

аспектов.

Способы получения производных дрожжевых штаммов хорошо известны в данной области и включают спаривания с другими дрожжевыми штаммами, слияния клеток, мутагенез и/или рекомбинантные методы.

В пятнадцатом аспекте изобретение относится к использованию штамма Saccharomyces четвертогопятнадцатого аспектов или производного четырнадцатого аспекта в производстве биомассы дрожжей.

Дрожжевая биомасса может быть использована, например, в хлебопекарной промышленности, для производства продуктов из биомассы.

В шестнадцатом аспекте изобретение относится к использованию штамма Saccharomyces четвертого-тринадцатого аспектов или производного четырнадцатого аспекта для производства этанола из ксилозы.

В семнадцатом аспекте изобретение относится к способу производства этанола, включающему инкубацию штамма Saccharomyces четвертого-тринадцатого аспектов или производного четырнадцатого аспекта со средой, содержащей ксилозу, в условиях, которые позволяют штамму подвергать брожению ксилозу с образованием этанола.

В восемнадцатом аспекте изобретение относится к способу превращения ксилозы в дрожжевую биомассу, включающему культивирование штамма Saccharomyces четвертого-тринадцатого аспектов или производного четырнадцатого аспекта со средой, содержащей ксилозу, в условиях, которые способствуют росту штамма при использовании ксилозы в качестве источника углерода для роста.

В девятнадцатом аспекте изобретение относится к способу получения биомассы дрожжей, включающему выращивание штамма Saccharomyces на среде или в среде, содержащей ксилозу, где по меньшей мере часть биомассы дрожжей получают при использовании ксилозы в качестве источника углерода для роста.

В двадцатом аспекте изобретение относится к способу получения соединения из штамма Saccharomyces, включающему культивирование штамма Saccharomyces на среде или в среде, содержащей ксилозу, в условиях, которые способствуют продуцированию соединения, где соединение продуцируется штаммом при использовании ксилозы как источника углерода.

В одном воплощении изобретения соединение продуцируется штаммом в течение роста при использовании ксилозы как источника углерода.

В одном воплощении изобретения способ включает дополнительную стадию извлечения соединения.

Соединение может быть любым соединением, которое может продуцироваться штаммом Saccharomyces. Примеры соответствующих соединений включают в себя этанол, CO2, ферменты, рекомбинантные ферменты, рекомбинантные белки, дрожжевые побочные продукты, витамины, нуклеотиды, рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды, липиды, дрожжевые белки, ксилит.

Специалисты в данной области должны признать, что рост клеток дрожжей приводит к образованию биомассы, и поэтому любой способ, который приводит к росту дрожжевых клеток, будет приводить к продукции биомассы. Таким образом, например, образование этанола в результате роста на среде, содержащей ксилозу, будет сопровождаться производством биомассы. В одном воплощении изобретения соединения содержатся в клетках дрожжей в биомассе, и соединения могут быть извлечены из дрожжевых клеток способами, хорошо известными в данной области для экстрагирования соединений из клеток дрожжей.

В двадцать первом аспекте изобретение относится к соединению, полученному способом восемнадцатого аспекта.

На фиг. 1 представлен график среднего времени удвоения популяции штаммов Saccharomyces cerevisiae во времени после применения способа согласно изобретению.

Для осуществления настоящего изобретения авторы используют, если не указано особо, методы традиционной микробиологии и классической генетики. Такие технологии известны специалистам в данной области и полностью раскрываются в печатном материале. См., например, публикацию Sherman et al. "Methods in Yeast Genetics" (1981) Cold Spring Harbor Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; европейский патент номер EP 0511108В.

Также следует признать, что используемая в тексте терминология приводится только для описания отдельных вариантов изобретения и не предназначена ограничить объем настоящего изобретения, который будет ограничен только приложенной формулой изобретения. Следует отметить, что используемые в тексте и приложенной формуле изобретения формы единственного числа включают в себя понятия во множественном числе, если в контексте ясно не указано иное. Таким образом, например, ссылка на определение "клетка" включает в себя множество таких клеток. Если не определено иное, все технические и научные термины, употребляемые в тексте, имеют такое же значение, которое подразумевают обычные специалисты в данной области, которым данное изобретение подходит. Хотя любые материалы и методы, подобные или эквивалентные материалам и методам, описанным в данном тексте, могут быть использованы для выполнения или проверки настоящего изобретения, предпочтительные материалы и методы здесь представлены.

Все публикации, упомянутые в тексте, цитированы для описания и раскрытия протоколов и реагентов, которые указаны в публикациях и которые могут быть использованы в связи с изобретением. Ничего из того, что представлено в описании, не должно быть истолковано, как признание того, что изобретение не имеет право противопоставлять такое раскрытие предыдущему изобретению.

Ксилоза представляет собой сахар, который является дешевым, может быть получен из возобновляемых ресурсов и доступен в больших количествах. Ксилоза может составлять значительную часть гемицеллюлозной растительной биомассы. Растительная биомасса включает в себя остатки сельского хозяйства, бумажные отходы, щепу и тому подобное, и является возобновляемой и доступной при низкой стоимости в больших количествах. Ксилоза находится, главным образом, в гемицеллюлозной растительной биомассе в виде полимеров, известных как ксилан и гемицеллюлоза. Полимеры ксилозы могут легко распадаться на мономерные сахара либо химическими способами, такими как кислотный гидролиз, либо ферментативным способом при использовании ферментов, таких как ксиланазы. В бумажной промышленности, например, ксилоза является одним из основных сахаров в потоке отходов, где она влияет на биологическую потребность в кислороде (BOD) и, тем самым, делает удаление сточных вод экологически трудным. На каждый килограмм бумаги, произведенной из твердой древесины, обычно приходится 100 г сахара, 35 г из которых представляет собой ксилоза. Из-за ее избыточного содержания ксилоза представляет собой главный потенциальный источник углерода для производства биомассы дрожжей и побочных продуктов метаболизма дрожжей, таких как этанол.

В одном аспекте представляется штамм Saccharomyces, способный расти со скоростью, составляющей, по меньшей мере, одну генерацию за 48 ч при использовании ксилозы в качестве единственного источника углерода. Авторы изобретения обнаружили, что можно получить штаммы Saccharomyces, способные к относительно быстрому росту при использовании ксилозы в качестве единственного источника углерода без необходимости использовать технологию рекомбинантных ДНК. Это был неожиданный результат, поскольку ранее полагали, что штаммы Saccharomyces не способны расти на ксилозе как на единственном источнике углерода. До настоящего изобретения штаммы Saccharomyces, способные к росту при скоростях, соответствующих по меньшей мере одной генерации за 48 ч при использовании ксилозы в качестве единственного источника углерода, были получены только путем внесения в штаммы Saccharomyces клонированных генов утилизации ксилозы из других организмов, которые могли расти на ксилозе. В качестве альтернативы, неприродные комбинации клонированных промоторов генов Saccharomyces и клонированных последовательностей ДНК Saccharomyces получали, используя рекомбинантные методы, и вносили их в штаммы Saccharomyces. Таким образом, до настоящего изобретения получение штаммов Saccharomyces, способных к утилизации ксилозы как источника углерода, не было возможным, пока гены утилизации ксилозы из других организмов, способных к росту на ксилозе, не были клонированы и внесены в штамм Saccharomyces, или сильные промоторы гена Saccharomyces не были связаны с другими последовательностями ДНК Saccharomyces и введены в штамм Saccharomyces, используя методы рекомбинантных ДНК.

До настоящего изобретения не существовало нерекомбинантных дрожжей из рода Saccharomyces, способных к росту со скоростью, составляющей по меньшей мере одну генерацию за 48 ч, при использовании ксилозы как единственного источника углерода. Патент США № 4511656 раскрывает штамм дрожжей ATCC № 20618, который является нерекомбинантным мутантом, способным производить этанол при инкубации в среде, содержащей ксилозу. Однако штамм ATCC 20618 не происходит из рода Saccharomyces. Морфология колоний, производимых штаммом ATCC № 20618, не совпадает с морфологией колоний, производимых Saccharomyces. Штамм ATCC № 20618 не образует споры, не спаривается со стандартными штаммами Saccharomyces cerevisiae, и упорядочение ITS областей и межгенной области гистонов Н3-Н4 штамма ATCC № 20618 показывает, что данный штамм не принадлежит к роду Saccharomyces, но тесно связан родством с Candida tropicalis. Так, ATCC 20618 филогенетически отличается от Saccharomyces, как определил Kurtzman (2003) FEMS Yeast Research, 4:233-245, и как описано в данном тексте. Хорошо известно, что организм Candida tropicalis утилизирует ксилозу. Кроме того, мутанты, описанные в патенте США № 4511656, только проявляли способность производить этанол, когда среду для роста снабжали такими питательными веществами, как дрожжевой экстракт, экстракт солода и пептон. Указанные питательные вещества для роста обеспечивают альтернативные ксилозе, способные к брожению источники углерода. Таким образом, патент США № 4511656 не описывает штаммы Saccharomyces, способные к росту на ксилозе или сбраживанию ксилозы в качестве единственного источника углерода.

Кроме того, патент США № 4511656 описывает, что подвергают отбору способные производить этанол дрожжи, которые образуют колонии на ксилозе, но не на ксилите. Не желая вдаваться в теоретические детали, авторы изобретения полагают, что в противоположность утверждениям, описанным в патенте США 4511656, метаболизм ксилита, который является промежуточным продуктом при утилизации ксилозы, может оказаться благоприятным для роста на ксилозе и продукции этанола из ксилозы.

не только штаммы Saccharomyces способны расти очень медленно на ксилозе как на единственном источнике углерода, но что скорость роста при использовании ксилозы в качестве единственного источника углерода штаммов Saccharomyces может быть увеличена без внесения клонированных генов утилизации ксилозы.

В одном аспекте имеется выделенный штамм Saccharomyces, который проявляет способность к росту со скоростью, составляющей по меньшей мере одну генерацию за 48 ч, при использовании ксилозы в качестве единственного источника углерода. В описании указывают, что штамм Saccharomyces является штаммом из рода Saccharomyces по определению, данному в публикации Kurtzman (2003) FEMS Yeast Research, vol. 4, pp. 233-245.

Употребляемое в тексте выражение "способный к росту со скоростью, составляющей по меньшей мере одну генерацию за 48 ч, при использовании ксилозы в качестве единственного источника углерода" означает, что штамм способен использовать ксилозу как единственный источник углерода для генерирования энергии и синтезировать молекулы, которые необходимы для роста штамма, чтобы достичь скорости роста, соответствующей по меньшей мере одной генерации за 48 ч. Термин "одна генерация" будет очевиден специалистам в данной области как означающий один цикл клеточного деления. Штамм предпочтительно будет способен к росту в твердой или жидкой среде, в которой ксилоза является единственным источником углерода. Специалисты в данной области должны принять во внимание, что штамм, который способен расти со скоростью, составляющей по меньшей мере одну генерацию за 48 ч, используя ксилозу как единственный источник углерода, будет способен расти на твердой и/или в жидкой минимальной минеральной среде, в которой ксилоза является единственным источником углерода. Примером соответствующей жидкой среды является коммерчески доступная среда DIFCO Laboratories Yeast Nitrogen Base без аминокислот, которая содержит все существенные неорганические соли и витамины, необходимые для культивирования дрожжей, кроме источника углевода или аминокислот, дополненная ксилозой между 0,01 и 50%, обычно между 1 и 10% ксилозы, как правило 5% ксилозы. Обычно твердая среда является жидкой средой, которая затвердевает при добавлении желатинирующего средства, такого как агар. Специалисты в данной области должны принять во внимание, что штамм, который способен расти, используя ксилозу в качестве единственного источника углерода, может также проявлять способность к росту на многих других сахарах.

Способности штамма утилизировать ксилозу как единственный источник углерода достигают нерекомбинантными способами. Употребляемое в тексте выражение "нерекомбинантные способы" относится к любым способам, которые не применяют технологии рекомбинантных ДНК для выработки способности у штамма Saccharomyces утилизировать ксилозу. Другими словами, гены, которые вырабатывают у штамма способность утилизировать ксилозу для роста, не были внесены в штамм рекомбинантными методами. Употребляемый в тексте термин "рекомбинантный метод" является методом, в котором один или более генов вносят в организм, используя технологию рекомбинантных ДНК. В описании указывают, что технологии рекомбинантных ДНК относятся к технологиям, с помощью которых генетическую информацию регулируют in vitro, например, когда гены выделяют и клонируют из организма. Таким образом, нерекомбинантные методы являются методами, которые не включают регулирование генетической информации in vitro. Нерекомбинантный штамм является штаммом, в который рекомбинантная нуклеиновая кислота не вносится.

Нерекомбинантные методы могут включать, например, мутагенез, классическое спаривание, цитодукцию, слияние клеток, такое как слияние протопластов, и их комбинации. Нерекомбинантный метод может включать культивирование популяции генетически различных клеток дрожжей Saccharomyces в условиях, которые позволяют комбинирование ДНК между клетками дрожжей in vivo, и проведение скрининга или селекции дрожжевых клеток в пользу клеток, имеющих повышенную скорость роста при использовании ксилозы в качестве единственного источника углерода, обычно путем инкубации генетически различной популяции клеток дрожжей в среде или на среде, содержащей ксилозу, в течение достаточного времени, чтобы отобрать клетки дрожжей, проявляющие повышенную скорость роста при использовании ксилозы как единственного источника углерода.

Специалистам в данной области станет очевидно, что генетическую информацию, которая придает штамму Saccharomyces способность к росту со скоростью, составляющей по меньшей мере одну генерацию за 48 ч, при утилизации ксилозы в качестве единственного источника углерода, получают от рода Saccharomyces. Другими словами, всю генетическую информацию, необходимую для роста со скоростью, составляющей по меньшей мере одну генерацию за 48 ч, получают из пула генов рода Saccharomyces. Обычно генетическую информацию, которая придает штамму Saccharomyces способность к росту со скоростью, составляющей по меньшей мере одну генерацию за 48 ч, при утилизации ксилозы в качестве единственного источника углерода для роста, получают из генетически различной популяции нерекомбинантных штаммов Saccharomyces. Как обсуждали выше, до настоящего изобретения полагали, что пул генов рода Saccharomyces не содержит генетической информации, придающей клеткам способность утилизировать ксилозу как единственный источник углерода для роста.

В другом аспекте имеются выделенные штаммы Saccharomyces, которые проявляют способность к - 11 росту на ксилозе, как на единственном источнике углерода, со скоростью роста, составляющей по меньшей мере одну генерацию за 48 ч, и которые способны экспрессировать нерекомбинантный фермент, обладающий активностью, выбранной из группы, состоящей из активности ксилозаредуктазы и ксилитдегидрогеназы. Фермент имеет активность, по меньшей мере, единицу, как определено с помощью теста Т4 для ксилозаредуктазы и теста Т5 для ксилитдегидрогеназы. Тесты Т4 и Т5 описаны в тексте. В одном воплощении изобретения активность ксилозаредуктазы составляет по меньшей мере 1,5 единицы, подходяще по меньшей мере 3 единицы. В одном воплощении изобретения активность ксилитдегидрогеназы составляет по меньшей мере 5 единиц, подходяще по меньшей мере 8 единиц.

Также изобретение предоставляет способ получения штамма Saccharomyces, который проявляет способность к росту с желательной скоростью роста, используя ксилозу в качестве единственного источника углерода. "Желательная скорость роста" может быть любой скоростью роста, которая является выше скорости роста клеток дрожжей Saccharomyces до применения способа согласно настоящему изобретению. Желательная скорость роста должна быть выше, чем скорость роста штамма NL67 Saccharomyces cerevisiae на ксилозе, как на единственном источнике углерода. Желательная скорость роста может составлять по меньшей мере одну генерацию за 48 ч, подходяще выше одной генерации за 24 ч, обычно выше одной генерации за 10 ч, более характерно выше одной генерации за 8 ч, и может доходить до скорости роста Saccharomyces на глюкозе, которая составляет приблизительно одну генерацию за 80 мин.

Способ включает в себя получение популяции генетически различных нерекомбинантных клеток дрожжей Saccharomyces.

Употребляемое в тексте выражение "генетически различные нерекомбинантные клетки дрожжей" относится по меньшей мере к двум нерекомбинантным клеткам дрожжей, которые имеют отличные генотипы. Генетически различные нерекомбинантные клетки дрожжей могут представлять собой смесь дрожжевых клеток различных штаммов Saccharomyces, полученных из штаммов дикого типа, применяемых для брожения виноградного сусла, из спиртовых дрожжей и применяемых для брожения пива, в хлебопечении или из любого другого источника Saccharomyces. Генетически различная популяция нерекомбинантных клеток дрожжей Saccharomyces может быть получена из одного штамма, который образует споры, чтобы произвести генетически различное потомство. Генетически различная популяция нерекомбинантных клеток дрожжей Saccharomyces может включать в себя одну или более дрожжевых клеток штаммов Saccharomyces, которые подвергали действию физического или химического мутагена, такого как, например, ультрафиолетовые лучи, рентгеновские лучи или гамма-лучи, или этилметансульфонат, нитрозогуанидин, митомицин С, блеомицин или любые другие средства, которые вызывают изменения в последовательностях оснований ДНК. Таким образом, генетически различные нерекомбинантные клетки дрожжей включают в свою сферу дрожжевые клетки штаммов, которые были получены посредством мутагенеза. Способы мутагенеза дрожжей и, в частности, мутагенеза Saccharomyces cerevisiae, хорошо известны специалистам в данной области и описаны, например, в публикации Sherman et al. "Methods in Yeast Genetics" (1981) Cold Spring Harbor Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York. Генетически различная популяция нерекомбинантных клеток дрожжей Saccharomyces также может включать в себя клетки дрожжей со спонтанными мутациями. Популяция генетически различных нерекомбинантных клеток дрожжей Saccharomyces может быть представлена одинаковыми видами или различными видами Saccharomyces. Обычно различные виды способны спариваться друг с другом. Например, популяция генетически различных нерекомбинантных клеток дрожжей может содержать различные штаммы Saccharomyces cerevisiae или любые другие виды Saccharomyces, полученные из любых источников, упомянутых выше. Примеры соответствующих видов Saccharomyces включают в себя S. cerevisiae, S.

paradoxus, S. mikatae, S. cariocanus, S. kudriavzevii, S. pastorianus и S. bayanus. Обычно популяция генетически различных клеток дрожжей Saccharomyces представлена одним и тем же видом. Обычно видом является Saccharomyces cerevisiae.

Примеры дрожжей, которые могли быть использованы для получения исходного посевного материала для популяций генетически различных нерекомбинантных клеток дрожжей, включают в себя штаммы Saccharomyces, доступные из хорошо известной коллекции культур, такой как Американская коллекция типовых культур (ATCC), например, ATCC 4111, ATCC 26603, ATCC 38559, Национальная коллекция дрожжевых культур (NCYC), например, S. Cerevisiae NCYC 995, NCYC 996, the Central Bureau voor Schimmel Cultures (CRBS), например, S. Cerevisiae CBS 745.95, CBS 755.95, или могут быть выделены из коммерчески доступных дрожжей, продаваемых рядом компаний для использования в традиционных областях пищевой промышленности, таких как хлебопечение, пивоварение, виноделие, винокурение и т.д.

Популяцию генетически различных нерекомбинантных клеток дрожжей Saccharomyces культивируют в условиях, которые допускают комбинирование ДНК между дрожжевыми клетками. Комбинирование ДНК между дрожжевыми клетками может осуществляться любым методом, подходящим для комбинирования ДНК по меньшей мере из двух дрожжевых клеток, при условии, что метод не является рекомбинантным методом. Примеры подходящих методов для комбинирования ДНК клеток дрожжей включают в себя спаривание и цитодукцию. Употребляемый в тексте термин "спаривание" относится к способу обмена и рекомбинации ДНК по меньшей мере между двумя дрожжевыми клетками, включающему методы классического генетического спаривания, направленного спаривания, множественного спаривания, редкого спаривания, слияния клеток и т.п. Например, классические генетические скрещивания или слияние клеток могут быть использованы для получения внутривидовых или межвидовых гибридов.

В одном аспекте клетки дрожжей культивируют в условиях, которые допускают спаривание между дрожжевыми клетками. Обычно дрожжевые клетки культивируют в условиях, которые допускают спаривание путем споруляции клеток дрожжей и после этого путем спаривания дрожжей, которые образовали споры. Например, клетки дрожжей могут быть спарены путем:

(a) образования спор дрожжевых клеток;

(b) проращивания образовавших споры клеток дрожжей;

(c) гибридизации совместимых для спаривания типов образовавших споры дрожжевых клеток.

Обычно клетки дрожжей спаривают путем (a) объединения популяции генетически различных нерекомбинантных дрожжевых клеток;

(b) споруляции объединенных клеток и проращивания спор с образованием гаплоидных клеток;

(c) гибридизации совместимых для спаривания типов гаплоидных клеток с образованием гибридных дрожжевых клеток.

Методы споруляции, получения гаплоидов и гибридизации гаплоидов с образованием гибридных дрожжевых клеток известны в данной области и описаны, например, в публикациях Chapter 7, "Sporulation and Hybridisation of Yeast" by R.R. Fowell, in "The Yeast" vol. 1 edited by A.H. Rose and J.S. Harrison, 1969, Academic Press; европейский патент EP 0511108В. Обычно спаривание является массовым спариванием. Массовое спаривание включает в себя культивирование по меньшей мере двух и обычно миллионов различных клеток дрожжей вместе способом, который допускает спаривание, происходящее между совместимыми для спаривания типами. Методы массового спаривания описаны, например, в публикациях Higgins et al. (2001), Applied and Environmental Microbiology, vol. 67, pp. 4346-4348; Lindegren (1943), Journal of Bacteriology, vol. 46, pp. 405-419.

В другом варианте осуществления изобретения дрожжи культивируют в условиях, которые позволяют клеткам сливаться. Методы генерации внутривидовых и межвидовых гибридов при использовании технологий слияния клеток описаны, например, в публикациях Morgan (1983) Experientia suppl. 46: 155Spencer et al. (1990) in, Yeast Technology, Spencer JFT and Spencer DM (eds.), Springer Verlag New York. Методы цитодукции описаны, например, в публикациях Inge-Vechtomov et al. (1986) Genetika 22:

2625-2636; Johnston (1990) in, Yeast Technology, Spencer JFT and Spencer DM (Eds.), Springer Verlag New York; Polaina et al. (1993) Current Genetics, 24: 369-372.

Клетки дрожжей подвергают скринингу или отбору в пользу дрожжевых клеток, которые имеют повышенную скорость роста при использовании ксилозы в качестве единственного источника углерода для роста. Дрожжевые клетки скринируют или отбирают для обогащения или идентификации дрожжевых клеток, которые имеют повышенную скорость роста при использовании ксилозы в качестве единственного источника углерода. Клетки дрожжей скринируют или отбирают обычно путем инкубации дрожжевых клеток на среде или в среде, содержащей ксилозу. Дрожжевые клетки скринируют или отбирают в пользу тех дрожжевых клеток, которые проявляют улучшенную способность к росту, используя ксилозу в качестве единственного источника углерода для роста. Улучшенная способность будет выражаться в повышении скорости роста при использовании ксилозы в качестве единственного источника углерода по отношению к желательной скорости роста. Увеличение скорости роста представляет собой увеличение скорости роста клеток дрожжей относительно скорости роста клеток до культивирования дрожжевых клеток в условиях, позволяющих комбинировать ДНК между клетками дрожжей. В одном воплощении изобретения клетки дрожжей подвергают отбору. Термины "производить отбор" или "селекция" относятся к способу, в котором дрожжевых клеток, проявляющих улучшенную способность к росту, используя ксилозу в качестве единственного источника углерода для роста, при желательной скорости роста, в популяции становится больше. Дрожжевые клетки могут быть отобраны путем инкубации клеток дрожжей на среде или в среде, содержащей ксилозу, в течение достаточного времени, чтобы клетки дрожжей смогли приобрести способность к росту на ксилозе как на единственном источнике углерода, чтобы расти, используя ксилозу в качестве источника углерода, и затем путем сбора выращенных дрожжевых клеток. Авторы изобретения обнаружили, что при инкубации дрожжевых клеток в течение времени, достаточного для того, чтобы позволить даже медленно растущим клеткам дрожжей расти, используя ксилозу в качестве источника углерода, и после сбора выращенных дрожжевых клеток, включающих медленно растущие дрожжевые клетки, клетки дрожжей, растущие с большей скоростью, будут составлять большую часть собранных дрожжевых клеток и поэтому собранные клетки дрожжей будут обогащены такими клетками, но генетическое разнообразие популяции клеток дрожжей в значительной степени сохраняется за счет включения также медленно растущих дрожжевых клеток. Например, при посеве спаренных дрожжевых клеток на твердую минимальную среду, содержащую ксилозу в качестве единственного источника углерода, клетки, способные к более быстрой утилизации ксилозы как единственного источника углерода, должны образовывать больше колоний и, в результате, эти клетки должны быть отобраны для желательного генотипа(ов), превалирующего в популяции. Однако при сборе меньших колоний генетическое разнообразие популяции в значительной степени должно сохраняться для следующего повторения стадий (b) и (с). Таким образом, с помощью инкубации клеток дрожжей на среде, содержащей ксилозу, в течение времени, достаточного для того, чтобы позволить дрожжевым клеткам расти, используя ксилозу в качестве источника углерода, представляется возможным не только отобрать эти дрожжевые клетки с повышенной скоростью роста на ксилозе, но также сохранить генетическое разнообразие популяции для повторных циклов стадий (b) и (с). Улучшенная селекция может быть осуществлена путем уменьшения времени, в течение которого дрожжевые клетки инкубируют на среде, содержащей ксилозу, так что отбирают только клетки дрожжей, растущие с использованием ксилозы в качестве источника углерода в период времени, предшествующий отбору. Дрожжевые клетки этого типа могут быть отобраны путем инкубации клеток дрожжей на среде или в среде, содержащей ксилозу, в течение времени, достаточного для того, чтобы клетки дрожжей имели повышенную скорость роста, используя ксилозу как единственный источник углерода, чтобы расти при использовании ксилозы в качестве источника углерода, и затем путем сбора выращенных дрожжевых клеток. Используя данный подход, большее избирательное давление оказывается на клетки дрожжей, чтобы росли при повышенной скорости, но поскольку, вероятно, этого времени недостаточно для роста части медленно растущих дрожжевых клеток, некоторое генетическое разнообразие может быть утрачено для дальнейших повторений стадий (b) и (с).

В другом воплощении изобретения клетки дрожжей подвергают скринированию. Употребляемые в тексте термины "производить скринирование" или "скринирование" относятся к способу, в котором дрожжевые клетки, которые обладают улучшенной способностью к росту, используя ксилозу в качестве единственного источника углерода для роста, при желательной скорости роста, вначале идентифицируют и затем выделяют. Дрожжевые клетки могут быть скринированы путем инкубации клеток дрожжей на среде или в среде, содержащей ксилозу, в течение времени, достаточного для того, чтобы клетки дрожжей смогли расти при повышенной скорости роста, используя ксилозу в качестве единственного источника углерода, чтобы расти при использовании ксилозы как источника углерода, и потом путем сбора дрожжевых клеток, которые росли с наибольшей скоростью, используя ксилозу как источник углерода.

Например, клетки дрожжей, которые обладают улучшенной способностью к росту, используя ксилозу в качестве единственного источника углерода, могут быть идентифицированы на богатой среде, содержащей ксилозу, как такие клетки, которые растут быстрее и поэтому образуют больше колоний, чем дрожжевые клетки, которые не обладают улучшенной способностью к росту, используя ксилозу в качестве единственного источника углерода. Большие колонии, появляющиеся на пластине, могут быть выделены в предпочтении к малым колониям, и выделенные таким образом дрожжевые клетки обладают улучшенной способностью к росту, используя ксилозу в качестве единственного источника углерода для роста, при желательной скорости роста.

Как описано выше, обычно дрожжевые клетки подвергают скринированию или отбору путем инкубации клеток дрожжей на среде или в среде, содержащей ксилозу. "Среда, содержащая ксилозу" может быть любой средой, которая содержит ксилозу и обеспечивает избирательное преимущество тех дрожжевых клеток, которые проявляют способность к росту, используя ксилозу в качестве единственного источника углерода, с большей эффективностью или с большей скоростью, чем другие штаммы. Употребляемый в тексте термин "избирательное преимущество" означает способность клетки или штамма претерпевать большее число клеточных делений, чем другие клетки или штаммы, из-за некоторого свойства, в данном случае способности к эффективному росту, используя ксилозу. Таким образом, среда, которая обеспечивает штамму избирательное преимущество, будет способствовать более быстрому росту штамма в такой среде по сравнению с другими штаммами, растущими в среде, не обеспечивающей избирательное преимущество. Специалисты в данной области должны признать, что дрожжи могут расти на широком ряде сред, которые включают в себя по меньшей мере один источник углерода, источник азота, источник фосфора, источник сульфата, незначительные количества элементов и витамины. Среда, содержащая ксилозу, может быть минимальной средой или сложной средой. В одном воплощении изобретения среда, содержащая ксилозу, является минимальной средой. Соответствующая минимальная среда может включать в себя, например, среду DIFCO Yeast Nitrogen Base Formulae (см. Difco manual "Dehydrated culture media and reagents for microbiology" 10th Edition, Difco Labs 1984), вместе с ксилозой при концентрации между 0,1 и 50%, обычно между 2 и 15%, более характерно 5%. В другом воплощении изобретения среда, содержащая ксилозу, может быть сложной средой. Концентрация ксилозы в сложной среде может составлять между 0,1 и 50%, обычно между 2 и 30%, более характерно между 2 и 15%. В одном воплощении изобретения сложная среда является полной обогащенной средой. Примером полной обогащенной среды является среда, которая содержит дрожжевой экстракт при концентрации между 0, и 2%, предпочтительно 0,5%, пептон при концентрации между 0,5 и 2%, предпочтительно 1%, и ксилозу при концентрации между 0,5 и 50%, обычно между 2 и 15%, более характерно 5%. В другом воплощении изобретения сложную среду выбирают из группы, состоящей из мелассы, крахмальных гидролизатов, гидролизата целлюлозной или гемицеллюлозной биомассы (такой как выжимки, грубые корма для скота, древесная масса, солома, макулатура и т.д.) и их комбинаций, возможно, снабженной ксилозой и/или питательными веществами. Специалисты в данной области должны признать, что твердая среда может более характерно между 1 и 5% агара, еще более характерно между 1 и 2% агара.

Дрожжевые клетки могут быть подвергнуты скринированию или отбору путем инкубации клеток на твердой и/или жидкой среде. В одном воплощении изобретения дрожжевые клетки скринируют или отбирают путем инкубации на твердой среде. В другом воплощении изобретения клетки дрожжей скринируют или отбирают путем инкубации дрожжевых клеток в жидкой среде. В предпочтительном воплощении изобретения дрожжевые клетки скринируют или отбирают путем инкубации клеток дрожжей вначале на твердой среде и затем на жидкой среде. Например, способ может включать:

(a) обеспечение популяции генетически различных клеток дрожжей Saccharomyces;

(b) культивирование клеток дрожжей в условиях, которые позволяют спаривать дрожжевые клетки;

(c) скринирование или селекцию клеток дрожжей путем инкубации дрожжевых клеток на твердой среде, содержащей ксилозу;

(d) повторение стадий (b) и (с) с прошедшими скрининг или отбор клетками, образующими популяцию генетически различных нерекомбинантных клеток дрожжей Saccharomyces, до тех пор, пока одна или более клеток дрожжей не приобретут способность к росту при желательной скорости роста, используя ксилозу в качестве единственного источника углерода для роста.

Обычно стадии (b) и (с) повторяют до тех пор, пока одна или более клеток дрожжей не достигнут скорости роста на ксилозе, которая является достаточной для того, чтобы клетки могли легко расти в жидкой среде, содержащей ксилозу в качестве единственного источника углерода. Например, скорость роста на твердой минимальной минеральной среде, содержащей от 2 до 5% мас./об. ксилозы, при которой штамм можно переносить для роста в жидкой минимальной минеральной среде, содержащей от 2 до 5% мас./об. ксилозы в качестве единственного источника углерода, будет достигнута после по меньшей мере 2 повторений стадий (b) и (с). Более характерно по меньшей мере 5 повторений стадий (b) и (с).

Даже более характерно по меньшей мере 10 повторений стадий (b) и (с). Специалисты в данной области должны признать, что время, в течение которого дрожжевые клетки могут быть скринированы или отобраны путем инкубации в жидкой среде, будет колебаться в зависимости от популяции, и может быть легко определено путем инкубации небольшой порции популяции в жидкой среде при каждом повторе стадий (b) и (с). Соответственно, способ может включать:

(a) обеспечение популяции генетически различных клеток дрожжей Saccharomyces;

(b) культивирование клеток дрожжей в условиях, которые позволяют спаривать дрожжевые клетки;

(c) скринирование или селекцию клеток дрожжей путем инкубации дрожжевых клеток в жидкой среде, содержащей ксилозу;

(d) повторение стадий (b) и (с) с прошедшими скрининг или отбор клетками, образующими популяцию генетически различных нерекомбинантных клеток дрожжей Saccharomyces, до тех пор, пока одна или более клеток дрожжей не приобретут способность к росту при желательной скорости роста, используя ксилозу в качестве единственного источника углерода для роста.

Обычно дрожжевые клетки инкубируют на среде или в среде, содержащей ксилозу, в течение времени, достаточного для того, чтобы клетки дрожжей приобрели способность к росту, используя ксилозу в качестве единственного источника углерода для роста. Как обсуждали выше, продолжительность времени будет, по меньшей мере, достаточной для того, чтобы клетки дрожжей, которые имеют повышенную скорость роста, используя ксилозу в качестве единственного источника углерода, могли расти.

Обычно продолжительность времени будет достаточной для того, чтобы позволить расти дрожжевым клеткам, которые не имеют повышенную скорость роста, используя ксилозу как единственный источник углерода. Другими словами, продолжительность времени будет достаточной, чтобы позволить, в основном, всем клеткам дрожжей расти на ксилозе. Продолжительность времени может изменяться в зависимости от популяции генетически различных нерекомбинантных клеток дрожжей и также может изменяться в зависимости от типов используемой среды и от того, как много циклов или повторений стадий (b) и (с) было проведено. Так как каждый цикл повторяется, предполагают, что продолжительность времени будет уменьшаться, поскольку способ скринирования или селекции для популяций, которые при использовании ксилозы растут быстрее с каждым повторением стадий (b) и (с), не зависит от того, твердую или жидкую среду используют. Специалисты в данной области будут признавать, что даже в сложной среде, содержащей отличные от ксилозы сахара, некоторые сахара или все из сахаров, отличных от ксилозы, в конце концов, будут истощаться в течение роста, и что присутствие ксилозы, в конечном счете, будет давать преимущество в выборе тех штаммов, которые растут быстрее на ксилозе, как единственном источнике углерода.

Клетки дрожжей могут быть инкубированы в жидкой среде, содержащей ксилозу, в течение достаточного времени, чтобы позволить клеткам дрожжей, которые являются самыми эффективными при росте на ксилозе как на единственном источнике углерода, опережать в росте те дрожжевые клетки, которые являются менее эффективными при росте на ксилозе.

Обычно продолжительность времени является достаточной, чтобы позволить расти даже таким дрожжевым клеткам, которые не обладают повышенной скоростью роста, используя ксилозу как единственный источник углерода. Как обсуждалось выше, быстрее растущих клеток будет больше по количеству, и поэтому они будут отобраны. Таким образом, использование жидкой среды, содержащей ксилозу, представляет собой подходящий способ селекции тех дрожжевых клеток, которые способны утилизировать ксилозу скорее, чем остальные клетки дрожжей в популяции. Обычно период роста в жидкой среде, содержащей ксилозу, уменьшается с каждым циклом, поскольку прошедшие скрининг или отбор дрожжевые клетки становятся более эффективными при утилизации ксилозы. После скринирования или отбора клеток дрожжей путем культивирования клеток в жидкой среде, содержащей ксилозу, клетки обычно собирают из жидкой среды и спаривают без дальнейшего разделения или выделения клеток. Таким образом, прошедшие скринирование или отбор клетки дрожжей обычно спаривают как пул. Способы спаривания являются такими же, как способы спаривания после скрининга и отбора клеток дрожжей, растущих на твердой среде, содержащей ксилозу.

Следует признать, что дрожжевые клетки могут быть инкубированы в среде или на среде, содержащей ксилозу, в любых условиях, которые способствуют селекции или скринированию дрожжевых клеток в популяции, утилизирующих ксилозу. В качестве примера, популяция может быть культивирована:

(a) в минимальной среде или на минимальной среде, содержащей ксилозу, в аэробных, микроаэрофильных, анаэробных условиях;

(b) в среде или на среде, обогащенной ксилозой, в аэробных условиях, микроаэрофильных, анаэробных условиях.

Указанная выше среда может содержать другие источники углерода (например, сахара, такие как глюкоза, галактоза, многоатомные спирты, такие как ксилит, глицерин, органические кислоты и их соли, такие как уксусная кислота и ацетаты и т.д.) кроме ксилозы. Например, дрожжевые клетки могут быть подвергнуты стрессам, таким как субоптимальный или супраоптимальный рН, гиперосмотическое или гипоосмотическое давление, ионные стрессы от солей, спиртовой стресс при добавлении этанола или других спиртов, стресс от других органических ингибиторов, таких как фурфураль и его производные, субоптимальные или супраоптимальные температуры, присутствие или отсутствие ксилозы, и затем клетки могут быть подвергнуты отбору или скринированию по их способности восстанавливаться после стрессов при утилизации ксилозы в качестве единственного источника углерода. Следовало ожидать, что комбинации различных избирательных условий могут быть применены к популяциям.

Следует отметить, что стадия (с) может быть повторена любое количество раз до выделения дрожжевых клеток или повторения стадии (b). Например, популяции, отобранные в жидкой среде, содержащей ксилозу, можно постоянно пересевать в свежую среду для дальнейшего скринирования или отбора дрожжевых клеток с желательной скоростью роста.

Специалисты в данной области оценят, что стадии (b) и (с) могут быть повторены любое количество раз для скринирования или отбора нерекомбинантных дрожжевых клеток, у которых скорость роста на ксилозе, как на единственном источнике углерода, постепенно увеличивается с каждым повторенным циклом. Таким образом, данный способ повторяется столько раз, сколько требуется для того, чтобы получить штамм, который проявляет желательную скорость роста при использовании ксилозы в качестве единственного источника углерода.

Соответственно, способ обычно включает в себя стадию выделения одной или более клеток дрожжей, имеющих желательную скорость роста. Специалисты в данной области должны признать, что способ обычно создает популяцию генетически различных нерекомбинантных дрожжевых клеток Saccharomyces, которые обладают желательной скоростью роста. Таким образом, в одном воплощении изобретения способ может быть использован для получения популяции штаммов Saccharomyces, которые проявляют способность к росту, утилизируя ксилозу в качестве единственного источника углерода, при желательной скорости роста. Популяцию можно выделить без разделения индивидуальных штаммов. Выделения популяции можно достичь, например, путем простого объединения популяции штаммов Saccharomyces, которые производятся данным способом.

В другом варианте осуществления изобретения индивидуальные штаммы Saccharomyces, которые проявляют способность к росту, утилизируя ксилозу как единственный источник углерода, могут быть выделены. Выделения индивидуальных штаммов можно достичь с помощью микробиологических методов, таких как получение соответствующих колоний, посев штрихом дрожжей на агаровых пластинках для получения изолятов отдельных колоний или любые другие методы выделения чистых культур. Такие методы описаны в публикации Cruickshank et al. (1975) "Medical Microbiology", 12th edition, volume two:

The practice of medical microbiology, published by Churchill Livingstone.

Также изобретение предоставляет способ получения производного штамма Saccharomyces с повышенной скоростью роста на ксилозе как на единственном источнике углерода для роста. Штамм Saccharomyces, из которого получено производное, обычно имеет желательное свойство. Способ включает в себя стадию (а) получения штамма как части популяции генетически различных нерекомбинантных клеток дрожжей Saccharomyces. Другими словами, дрожжевые клетки штамма составляют часть популяции.

Клетки дрожжей генетически отличной популяции могут быть получены из любых источников, упомянутых выше. На стадии (b) клетки дрожжей популяции генетически различных клеток дрожжей культивируют в любых из условий, описанных выше, которые допускают спаривание клеток дрожжей популяции. На стадии (с) дрожжевые клетки подвергают скринированию или отбору в пользу производных, - 16 которые обладают повышенной скоростью роста. Повышенная скорость роста представляет собой увеличение скорости роста производного относительно скорости роста штамма. Обычно дрожжевые клетки подвергают скринированию или отбору путем инкубации дрожжевой клетки в среде или на среде, содержащей ксилозу, как упомянуто выше. Среда, содержащая ксилозу, может, кроме того, содержать факторы, способствующие отбору или скринированию производного штамма. Например, штамм может включать в себя селектируемые маркеры, такие как устойчивые к антибиотикам маркеры или другие типы маркеров, которые делают возможным для производных штамма отличаться от других дрожжевых клеток популяции генетически различных клеток дрожжей. Это позволяет одновременно производить скрининг или селекцию клеток дрожжей, обладающих повышенным ростом при использовании ксилозы как единственного источника углерода, и нести селектируемый маркер. Такой эффект позволяет отличать производные от остальных клеток генетически различной популяции.

Соответствующие селектируемые маркеры включают в себя, например, ADE2, HIS3, LEU2, URA3, LYS2, МЕТ15, TRP1, URA4, сульфат-устойчивые или п-фтор-DL-фенилаланин-устойчивые (Cebollero and Gonzales (2004) Applied and Environmental Microbiology, Vol 70: 7018-7028). Способы скринирования и селекции в пользу роста при использовании ксилозы упомянуты выше. Стадии (b) и (с) могут быть повторены любое количество раз до тех пор, пока не будет получено производное с повышенной скоростью роста. Если скорость роста повысилась, производный штамм выделяют. Способы выделения упомянуты выше.

В объем настоящего изобретения также включены штаммы Saccharomyces, полученные способом согласно изобретению. Штамм Saccharomyces может быть любого вида Saccharomyces, как определено филогенетически автором Kurtzman (2003) FEMS Yeast Research 3: 417-432, и включает в себя S. cerevisiae, S. paradoxus, S. mikatae, S. cariocanus, S. kudriavzevii, S. pastorianus и S. bayanus. Методы спаривания между штаммами Saccharomyces cerevisiae и штаммами, отличными от cerevisiae, обсуждаются, например, в публикациях Johnston J.R. and Oberman H. (1979) Yeast Genetics in Industry, in Bull M.J. (ed.) Progress in Industrial Microbiology, Elsevier, Amsterdam, vol 15, pp. 151-205; Pretorius IS (2000) Tailoring wine yeast for the new millennium: novel approaches to the ancient art of wine making. Yeast 16: 675-729; P.V.

Attfield and P.J.L. Bell (2003) Genetics and classical genetic manipulations of industrial yeasts, in Topics in Current Genetics, Vol. 2, J.H. de Winde (ed) Functional Genetics of Industrial Yeasts, Springer-Verlag Berlin Heidelberg.

Специалисты в данной области должны признать, что раз уж штамм Saccharomyces получен, который проявляет способность утилизировать ксилозу в качестве единственного источника углерода для роста с желательной скоростью роста, то другие штаммы могут быть произведены из данного штамма способами, известными в данной области способами получения штаммов, включающими, например классические генетические методы скрещивания, методы мутагенеза, рекомбинантные методы или любые другие методы получения штаммов Saccharomyces.

Штамм, проявляющий способность к росту со скоростью роста, составляющей по меньшей мере одну генерацию за 48 ч, утилизируя при этом ксилозу в качестве единственного источника углерода, можно спаривать с другими штаммами Saccharomyces, предпочтительно с другими штаммами Saccharomyces cerevisiae. Например, предполагают, что с помощью указанных выше методов можно получать разнообразные штаммы Saccharomyces, которые способны расти со скоростью, составляющей по меньшей мере одну генерацию за 48 ч, утилизируя ксилозу как единственный источник углерода для роста.



Pages:   || 2 |


Похожие работы:

«1 Годовой обзор экономики Нидерландов за 2013 год ОГЛАВЛЕНИЕ 1. Введение....5 1.1. Общая информация о Нидерландах..5 1.1.1. Факторы, оказавшие влияние на экономическую ситуацию в Нидерландах в 2013 году 1.1.2.Общая характеристика экономики (динамика ВВП; приоритетные отрасли; основные товарные рынки; динамика товарооборота с основными странами торговыми партнерами). 1.1.3. Роль и место экономики Нидерландов в мировой экономике, перспективные области внешнеэкономического сотрудничества с...»

«Национальный правовой Интернет-портал Республики Беларусь, 24.07.2012, 2/1967 ЗАКОН РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ 13 июля 2012 г. № 415-З Об экономической несостоятельности (банкротстве) Принят Палатой представителей 14 июня 2012 года Одобрен Советом Республики 22 июня 2012 года РАЗДЕЛ I ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ ГЛАВА 1 ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ Статья 1. Основные термины, используемые в настоящем Законе Для целей настоящего Закона используемые в нем основные термины имеют следующие значения: банкротство –...»

«Нар дный пыт №1-2, 2008 Издание роД с КоБ Специальный выпуск Дорогие друзья! В номере: Единомышленники и сродники! Обращаюсь к Вам с программным заявлением, требующим оценки каждого члена нашего НефорКонцептуальные мального сообщества Народный Опыт. знания Много лет назад, в начале перестрой- сообщество народных опытников. ки, наше сообщество первым в стране В числе инициаторов и активных подняло волну насущной необходи- участников были ныне известные Как быть здоровым мости возврата...»

«АКАДЕМИЯ УПРАВЛЕНИЯ ПРИ ПРЕЗИДЕНТЕ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ УДК 332.74 (476) (043.3) РЯБОВА СВЕТЛАНА СЕРГЕЕВНА Организация и методическое обеспечение групповой оценки недвижимости в Республике Беларусь Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата экономических наук по специальности 08.00.05 – экономика и управление народным хозяйством (специализация – экономика, организация и управление предприятиями, отраслями, комплексами) Минск, 2013 Работа выполнена в Академии управления при...»

«6/2007 Официальное издание Федеральной таможенной службы Таможенные ведомости бюллетень таможенной информации В НОМЕРЕ: О создании зон таможенного контроля О применении Федерального закона вдоль таможенной границы от 22 июля 2005 г. № 116-ФЗ Российской Федерации Об особых экономических зонах с Украиной и Республикой Казахстан в Российской Федерации Инструкция об особенностях О порядке заполнения графы 31 ГТД таможенного оформления товаров, в части описания товарных знаков вывозимых в...»

«Т. В. Теплова ИНВЕСТИЦИИ Учебник для бакалавров 2-е издание, переработанное и дополненное Рекомендовано УМО в области экономики и менеджмента в качестве учебника для студентов высших учебных заведений, обучающихся по направлению 080100 Экономика а остпа в лектроой лотеой сстее biblio-online.ru Москва Юрайт 2014 УДК 33 ББК 65.26я73 Т34 Автор: Теплова Тамара Викторовна — доктор экономических наук, профессор кафедры фондового рынка и рынка инвестиций факультета экономики департамента финансов...»

«Munich Personal RePEc Archive Modern Condition of the Theory of Economic Reforms Victor Polterovich CEMI RAS 2008 Online at http://mpra.ub.uni-muenchen.de/22032/ MPRA Paper No. 22032, posted 12. April 2010 05:20 UTC Экономическая наука современной России, 2008, № 1(40) СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ТЕОРИИ ЭКОНОМИЧЕСКИХ РЕФОРМ1 В. М. Полтерович Теория реформ — сравнительно новый раздел экономической теории, изучающий процессы целенаправленного изменения экономических институтов. В статье очерчивается...»

«Аннотации рабочих программ учебных дисциплин и практик по направлению подготовки 080100.68 Экономика магистерская программа: Экономика фирмы ОН Современные проблемы экономической науки учебная дисциплина, которая выступает необходимым элементом формирования знаний, умений, навыков проведения исследовательских проектов в части постановки задачи, сбора, анализа экономических данных и принятия на основе анализа полученных данных эффективных управленческих решений. Цель дисциплины: формирование у...»

«Всемирная организация здравоохранения ИСПОЛНИТЕЛЬНЫЙ КОМИТЕТ Сто двадцать восьмая сессия EB128/4 Пункт 4.1 предварительной повестки дня 12 января 2011 г. Обеспечение готовности к пандемическому гриппу: обмен вирусами гриппа и доступ к вакцинам и другим преимуществам Доклад Секретариата Генеральный директор имеет честь препроводить Исполнительному комитету доклад Рабочей группы открытого состава государств-членов по обеспечению готовности к пандемическому гриппу: обмен вирусами гриппа и доступ к...»

«Ежемесячный бюллетень. Август 2013 Блок экономической информации. Общие положения. Кратко Суть Ссылки В середине лета премьер Дмитрий Медведев поручил правительству подумать над идеей Поручение рассмотреть http://izvestia.ru/news/555974 двухлетних налоговых каникул для предпринимателей, впервые прошедших регистрацию. возможность http://www.klerk.ru/buh/news/332297/ Это была экстренная мера в ответ на катастрофическое сокращение предпринимательского предоставления класса, объясняли чиновники...»

«ББК 65.49 Х 15 Хайкин М.М. Управление сферой услуг в развитии человеческого капитала. – СПб.: Изд-во СПбГУЭФ, 2010. – 159 с. В монографии исследованы общие предпосылки и закономерности формирования сферы услуг как научного направления и области практической деятельности, проведен анализ развития теории и методологии сферы услуг; ретроспективный анализ развития теории человеческого капитала с момента ее становления по настоящее время, рассмотрены особенности составляющих человеческого капитала в...»

«Djn Государственное унитарное предприятие Республики Татарстан Головная территориальная проектно-изыскательская, научно-производственная фирма ТАТИНВЕСТГРАЖДАНПРОЕКТ Заказ 5441 Проект Схема территориального планирования Алексеевского муниципального района Обосновывающие материалы ТОМ 2. КНИГА 2 ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА Генеральный директор Хуснутдинов А.А. Первый заместитель генерального Морозов А.А. директора, главный инженер Главный архитектор фирмы Асадуллин И.Ш. Начальник АПМ-5 Романова И.Ю....»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ УТВЕРЖДАЮ Декан экономического факультета профессор В.И. Гайдук _ 2010 г. РАБОЧАЯ ПРОГРАММА дисциплины Организация производства на предприятии АПК для специальности 080502.65 Экономика и управление на предприятии АПК экономического факультета Ведущая кафедра – кафедра организации производства и...»

«Приложение 2. Титульный лист УМКД Г ОУ ВПО РО С С ИЙ С К О-А РМЯ Н С К ИЙ (С Л А В Я Н С К И Й ) У Н И В Е Р С И Т Е Т Составлен в соответствии с УТВЕРЖДАЮ: государственными требованиями к ми н и му му Ректор А.Р. содержания и уровню Дарбинян подготовки выпускников по указанным направлениям и “_”_ Положением Об УМКД РАУ. 20 г. Ф а к у л ьт е т : Э к о н о м и ч е с к и й ф а к у л ьт е т Название факультета К а ф е д р а: Э к о н о м и к и и ф и н а нс о в Название кафедры Автор(ы): Багратян...»

«Г.П. Бессокиpная, А.Л Темницкий Социальная адаптация рабочих в трансформирующемся обществе: основные положения программы и некоторые pезультаты исследования (Мир России. – 2000. – №4. – С. 103-124.) Пpоблема адаптации и опыт ее изучения Адаптационное взаимодействие больших социальных групп и социальной среды — важнейшая составляющая трансформационных процессов в российском обществе. В трансформирующемся российском обществе процесс социальной адаптации составляет основное содержание всех видов...»

«Проект Команда Губернатора: Ваша оценка Публичный доклад о результатах деятельности главы города Устюжна Устюженского муниципального района Вологодской области за 2013 год 2014 год 1. Аннотация к публичному докладу о результатах деятельности главы города Устюжна Устюженского муниципального района за 2013 год Публичный доклад позволяет проанализировать социально-экономическую ситуацию в муниципальном образовании, проблемы и перспективы развития города, основные результаты и тенденции...»

«НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ВЫСШАЯ ШКОЛА ЭКОНОМИКИ ИТОГОВЫЙ ОТЧЕТ о результатах деятельности экспертных групп Национального исследовательского университета Высшая школа экономики по проведению оценки эффективности расходов федерального бюджета и представлению предложений по их оптимизации Москва, 2013 Оглавление ВВЕДЕНИЕ 4 1 ЭКСПЕРТНАЯ ГРУППА № 1 СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ПРОЦЕДУР И ИНСТРУМЕНТОВ УПРАВЛЕНИЯ БЮДЖЕТНЫМИ РАСХОДАМИ, ГОСУДАРСТВЕННЫМИ И МУНИЦИПАЛЬНЫМИ УЧРЕЖДЕНИЯМИ 1.1...»

«Пояснительная записка Рабочая программа для 10 класса составлена на основе авторской программы Л.Н. Боголюбов, Н.И. Городецкая, Л.Ф. Иванова, А.И. Матвеев (базовый уровень) из сборника Программы общеобразовательных учреждений. Обществознание. 6 – 11 классы. – М.: Просвещение, 2010., и Примерной программы основного общего образования по обществознанию. Сборник нормативных документов. Обществознание / сост. Э.Д. Днепров, А.Г. Аркадьев. – М.: Дрофа, 2008., Содержание среднего (полного) общего...»

«Организация Объединенных Наций ECE/CES/GE.20/2010/14 Экономический Distr.: General 15 February 2010 и Социальный Совет Russian Original: English Европейская экономическая комиссия Конференция европейских статистиков Группа экспертов по национальным счетам Десятая сессия Женева, 2629 апреля 2010 года Пункт 6 предварительной повестки дня Рассмотрение первого проекта публикации Влияние глобализации на национальные счета: практическое руководство Учет специальных юридических лиц: опыт стран Записка...»

«в следующем номере Программируемые измерительные преобразователи ПСТ-a-Pro, ПНТ-a-Pro Программный выбор типа НСХ и диапазона измерения пользователем Программирование (выбор типа НСХ и диапазона преобразования) наладчик может осуществлять на месте монтажа термопреобразователя в течение нескольких секунд. Кнопочный интерфейс задания типа термопреобразователя и диапазона преобразования не требует дополнительного оборудования. Большой выбор типов НСХ и диапазонов преобразования ПНТ-a-Pro – 12 типов...»














 
© 2014 www.kniga.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Книги, пособия, учебники, издания, публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.