WWW.KNIGA.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Книги, пособия, учебники, издания, публикации

 

WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ 2006

Исследование дисперсий фосфолипидов. 1. Меченый NBD-PE и Rh-PE

пальмитоилолеоилфосфатидилхолин

В.П. Топалы, Э.Е. Топалы

Институт Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН,

Содержание

Аннотация

Введение

1. Материалы и методы

2. Результаты и обсуждение

2.1. Первые сомнения

2.2. Флюоресценция меченой дисперсии POPC как функция её возраста 2.3. Влияние ультразвука на флюоресценцию 2.4. Влияние детергентов на флюоресценцию 2.5. Флюоресценция донора и акцептора при возбуждении донора Основные выводы Литература Abstract Принятые сокращения: POPC = пальмитоилолеоилфосфатидилхолин;

DHPC = дигептилфосфатидилхолин; NBD-PE = N-(7-нитробенз-2-oксa-1,3диазол-4-ил)диолеоилфосфатидилэтаноламин; Rh-PE = (N-(лиссамин родамин В сульфонил)диолеоилфосфатидилэтаноламин; ТХ = Тритон Х-100;

RТХ = восстановленный Тритон Х-100; SDS = додецилсульфат натрия;

CTAB = цетилтриметиламмоний бромид; РПЭ = метод резонансного переноса энергии. Дисперсии в бидистиллированной воде Д1 = POPC 1 мМ, NBD-PE 1 мкМ, Rh-PE 1 мкМ; Д2 = POPC 100 мкМ, NBD-PE 1 мкМ, Rh-PE мкМ; Д3 = POPC 10 мкМ, NBD-PE 1 мкМ, Rh-PE 1 мкМ; Д4 = NBD-PE мкМ, Rh-PE 1 мкМ; Д5 = POPC 10 мМ, NBD-PE 10 мкМ, Rh-PE 10 мкМ; Д6 = POPC 1 мМ, NBD-PE 10 мкМ, Rh-PE 10 мкМ; Д7 = POPC 100 мкМ, NBD-PE 10 мкМ, Rh-PE 10 мкМ и Д8 = NBD-PE 10 мкМ, Rh-PE 10 мкМ; F(ДХ) = флюоресценция кюветы с дисперсией ДХ, разбавленной до 30 нМ NBD-PE и 30 нМ Rh-PE, где Х – цифра в обозначении дисперсии; F(ДX-Y) = флюоресценция кюветы, содержащей большой избыток (по сравнению с липидом) детергента Y (один из перечисленных выше, включая DHPC) с дисперсией ДХ, разбавленной до 30 нМ NBD-PE и 30 нМ Rh-PE; ККМ = критическая концентрация мицеллобразования; КВФ = квантовый выход флюоресценции; Fmax = максимальная флюоресценция меченой липидной дисперсии.

WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ Аннотация Исследованы полученные методом упаривания обращённой фазы экструдированные водные дисперсии меченого NBD-PE и Rh-PE в молярном отношении 1:1 пальмитоилолеоилфосфатидилхолина (POPC). С ростом концентрации POPC флюоресценция дисперсии как при 530 нм (максимум эмиссии NBD-PE), так и при 577 нм (максимум эмиссии Rh-PE) при облучении фотонами 470 нм (максимум поглощения NBD-PE), монотонно возрастает. Это указывает на то, что перенос энергии от донора к акцептору осуществляется не по Фёрстеру и метод резонансного переноса энергии (РПЭ) неприменим для исследования дисперсий амфифилов. Флюоресценция дисперсий флуктуирует и уменьшается во времени. При длительном хранении (до 4 месяцев) маточной дисперсии в темноте при 25 °С флюоресценция также достоверно уменьшается. Эти факты не удаётся понять в рамках представления, будто исследованные дисперсии состоят из одноламеллярных липосом. В присутствии высоких концентраций детергента (выше ККМ – критической концентрации мицеллообразования) флюоресценция (F(Д)) резко возрастает с содержанием POPC в дисперсии.

Значения F(Д) дисперсий с одинаковыми концентрациями красителей, но разными концентрациями POPC не удаётся сколько-нибудь сблизить даже при длительном (до 7 суток) непрерывном перемешивании при температуре 25 °С или при продолжительном (до 1 часа) облучении ультразвуком. Эта картина наблюдается с любым из использованных прежде для определения максимальной флюоресценции дисперсии (Fmax) детергентом (додецилсульфатом натрия, цетилтриметиламмоний бромидом, Тритоном Хвосстановленным Тритоном Х-100), а также с дигептилфосфатидилхолином. Эти факты демонстрируют, что необходимый для анализа результатов исследования липидных дисперсий методом резонансного переноса энергии (РПЭ) параметр Fmax невозможно определить с помощью детергентов. Кроме того, они показывают, что современные модели дисперсий детергентов неверны. Ошибочно представление, будто существует некоторая номинальная концентрация (ККМ), ниже которой детергент диспергирован до молекул, а выше до мицелл. Неверно также и представление будто при внесении в липидную дисперсию детергента до концентраций выше ККМ образуются смешанные детергентно-липидные мицеллы. Метод РПЭ для исследования слияния липосом и детергенты (цетилтриметиламмоний бромид и Тритон Х-100) для измерения Fmax рекомендуются Методами энзимологии (Hoekstra D., Dzgne N.. Lipid mixing assays to determine fusion in liposome systems. Methods in Enzymology, v. 220, part A, p. 15-32, 1993), что является загадкой. Все приведённые в статье факты объясняются в рамках предлагаемой нами обобщённой модели дисперсий амфифилов. Модель и интерпретация описанных в статье фактов излагаются в следующих двух статьях этой серии.

WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ Ключевые слова: липидная дисперсия; флюоресцентные метки;

резонансный перенос энергии; детергенты; мицеллообразование; смешанные детергентно-липидные мицеллы.

После пионерских работ Бангхэма с коллегами (Bangham et al., 1965) дисперсии липидов в воде были предметом нескончаемого числа исследований. Электронная микроскопия и особенно снимок среза одноламеллярной липосомы (Miyamoto, Stoeckenius, 1971), к началу 1970-х годов привели к выводу, что разбавленные липидные дисперсии состоят исключительно из липосом. Одно за другим появлялись сообщения о новых методах получения одноламеллярных липосом с разными размерами: малых (Huang, 1969), крупных (Batzri, Korn, 1973; Deamer, Bangham, 1976; Enoch, Strittmatter, 1979; Szoka et al., 1980), гигантских (Riquelme et al., 1990). В г. Ласич (Lasic, 1988) опубликовал обзор методов получения разнообразных одноламеллярных липосом, в котором предложил гипотезу о механизме их формирования с участием дискоидных мицелл (бицелл). Ласич высказал надежду, что эта его гипотеза поможет внести некоторую ясность в представления о дисперсиях липидов, относительно которых известно очень много деталей, которые, однако, очень мало понятны. К сожалению, Ласич не затронул в своей работе одну из главных проблем. За исключением малых липосом (Larrabee, 1979; Lichtenberg, 1981; Lentz, Carpenter, Alford, 1987), липидные дисперсии до сих пор считаются равновесными системами. Более того, Хуанг (Huang, 1969), выполнивший одно из самых интересных исследований малых липосом, из облучённой ультразвуком дисперсии выделил две фракции. Одна из них содержала малые липосомы с размером 250, а вторая значительно более крупные агрегаты. Последние он не исследовал, но показал гель-хроматографией, что обе фракции являются равновесными. Проблема, таким образом, заключается в том, что при разных способах диспергирования липидов и даже при одном способе в одной пробирке (Huang, 1969) получаются различные равновесные дисперсии, что коренным образом противоречит термодинамике.

Наряду с электронной микроскопией укоренению нынешних представлений о природе разбавленных липидных дисперсий способствовали в немалой мере исследования с применением метода резонансного переноса энергии (РПЭ). В 1978 году Фунг и Страйер (Fung, Stryer, 1978) опубликовали исследование крупных одноламелярных липосом, которые метили различными парами донор-акцептор (всего 4 пары). Каждый донор и акцептор представлял собой ковалентно связанный с аминогруппой фосфатидилэтаноламина соответствующий флюорофор. Необходимую для анализа экспериментальных фактов в рамках теории Фёрстера величину максимальной флюоресценции донора в кювете (Fmax), соответствующую полному отсутствию переноса энергии от донора к акцептору, определяли путём добавления в кювету избытка (по сравнению с липидом) WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ додецилсульфата натрия (SDS). Считается, что SDS, как и любой другой детергент, при любых концентрациях выше ККМ (критической концентрации мицеллобразования) образует в дисперсии относительно мелкие агрегаты (мицеллы), которые включают и все липиды дисперсии, в том числе, очевидно, и флюоресцентно меченые. Мицелла может содержать не более одной молекулы флюорофора, вследствие чего расстояние между любой парой соседних молекул донора и акцептора в системе многократно превышает радиус Фёрстера (Ro, расстояние между донором и акцептором, при котором перенос от первого ко второму составляет 50 %Fmax), что и является условием отсутствия переноса. Авторы показали, что поведение каждой из исследованных пар донор-акцептор в точности следует теории Фёрстера и определили радиусы Фёрстера для всех пар. Тем самым они доказали адекватность теории Фёрстера, косвенно продемонстрировали, что липиды дисперсии действительно локализованы только в однослойных липосомах, и метод РПЭ можно успешно использовать для исследования липидных дисперсий.

В 1981 году Страк и соавт. (Struck, Hoekstra, Pagano, 1981) использовали для исследования липидных дисперсий методом РПЭ в качестве донора NBD-PE, а в качестве акцептора Rh-PE. Следуя версии теории РПЭ, предложенной Фунгом и Страйером (1978), они исследовали методом РПЭ малые одноламеллярные липосомы, а для определения Fmax они использовали детергент Тритон Х-100 (TX), учитывая при этом его влияние на квантовый выход флюоресценции (КВФ) донора. Исследование этих дисперсий привело авторов к выводу, что пара NBD-PE/Rh-PE может быть использована для изучения смешивания липидов при слиянии липосом. Это было сделано в дальнейшем в сотнях исследований для определения степени индуцированного слияния липосом, а также липосом с клетками.

Для определения Fmax чаще всего применяют Тритон Х-100 (TX) и при этом отмечается, что вносится поправка на тушащий эффект TX. Некоторые исследователи (Struck, Hoekstra, Pagano, 1981; Uster, Deamer, 1981) предлагают принимать в качестве Fmax флюоресценцию липидной дисперсии, меченой только донором. Хекстра и Дюзгюнеш (Hoekstra, Dzgne, 1993) без всякого обоснования предлагают способ определять необходимую поправку на тушащий эффект ТХ. Для этого следует измерять флюоресценцию дисперсии без акцептора с низкой концентрацией донора NBD-PE, когда отсутствует самотушение, до и после внесения ТХ. Таким образом, в литературе имеется определённая неясность в отношении измерения Fmax. Кроме того, возникают определённые сомнения в применимости теории Фёрстера, которая постулирует только взаимодействие донор-акцептор при любых концентрациях, т.е. несовместима с самотушением донора или акцептора.

Литература по амфифилам обширна. Однако нам так и не удалось найти ни одного общетеоретического исследования по комплексообразованию амфифилов. Имеются лишь модели мицеллообразования (Reynolds, 1979), которые касаются сравнительно узкого круга амфифилов, относимых WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ главным образом к детергентам. Между тем, изучая так называемое слияние одноламеллярных липосом методом РПЭ, мы обнаружили ряд фактов, не укладывающихся в современные представления о разбавленных дисперсиях фосфолипидов.

В настоящей работе мы исследовали предельно простые дисперсии меченого одновременно NBD-PE и Rh-PE лецитина в воде и обнаружили ряд свойств, которые несовместимы с липосомальной идеей. Мы показали экспериментально, что дисперсии смесей липидов и детергента с концентрацией выше ККМ не состоят из смешанных детергентно-липидных мицелл, как принято считать. Максимальную флюоресценцию меченой одинаковыми концентрациями NBD-PE и Rh-PE липидной дисперсии нельзя измерить с помощью детергентов, а теория Фёрстера непригодна для описания свойств такой дисперсии. Мы предлагаем обобщённую модель дисперсии амфифилов. Все приведённые в работе факты вполне удовлетворительно объясняются в рамках предлагаемой модели. Модель и интерпретация описанных в статье фактов излагаются в следующих двух статьях этой серии.

Пальмитоилолеоилфосфатидилхолин (POPC), дигептилфосфатидилхолин (DHPC), N-(7-нитробенз-2-oксa-1,3-диазол-4-ил)фосфатидилэтаноламин (NBD-PE), (N-(лиссамин родамин В сульфонил)фосфатидилэтаноламин (RhPE) приобретены у фирмы Avanti, Тритон Х-100 (ТХ), восстановленный Тритон Х-100 (RТХ), додецилсульфат натрия (SDS) и цетилтриметиламмоний бромид (CTAB) у фирмы Sigma. Этиловый эфир российского производства. Перед использованием он был перегнан.

Так называемые крупные однослойные липосомы получали методом упаривания обратной фазы (Szoka et al., 1980; Hoekstra, Dzgne, 1993) в бидистиллированной воде либо из одного немеченого POPC, либо из смесей POPC + NBD-PE + Rh-PE с различными суммарными концентрациями липидов и соотношениями POPC/немеченые липиды при одинаковых концентрациях NBD-PE и Rh-PE. Обычно готовили 1 мл дисперсии.

Отклонения процедуры от условий, описанных в вышеуказанных статьях, незначительны. Если готовили дисперсию с концентрацией POPC 10 мМ, то массы липидов и требуемой воды контролировались гравиметрически с точностью 0.05 мг и ~1 мг, соответственно. Концентрации NBD-PE и Rh-PE в маточных растворах определяли спектрофотометрически и требуемые объёмы этих растворов вносили с помощью гамильтоновских шприцов.

Когда готовили дисперсии, содержащие 1 мМ POPC, немеченый липид вносили в виде водной дисперсии. Эфирно-водно-липидную смесь встряхивали на вибрационном смесителе с частотой 30 гц в течение 30 мин.

На стадии удаления эфира для предотвращения выброса после образования геля сосуд (круглодонную колбу на 10 мл) встряхивали и переносили бльшую часть его содержимого в другой сосуд. Упаривание продолжали WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ при глубоком вакууме, возвращая периодически отобранную смесь примерно по 200 мкл обратно в сосуд. Упаривание завершали, когда в сосуде оставалось 20-30 % воды от первоначально взятого количества. После внесения требуемого количества воды получается слабо опалесцирующая без каких-либо неоднородностей дисперсия. Все опыты проводили с дисперсиями, экструдироваными через поликарбонатные мембраны с диаметром пор 0.2 мкм. Готовились две разновидности дисперсий: меченые флюорофорами и немеченые. Маточные дисперсии хранили в пробирках Эппендорфа при комнатной температуре либо при 5 °С. Перед отбором пробы для внесения в кювету сосуд с маточной дисперсией тщательно взбалтывается. Погрешность в концентрации немеченого липида составляет 2-3 %, меченого липида меньше 1 %.

Флюоресценцию и рассеяние липидных дисперсий в стандартных кварцевых кюветах измеряли на флюориметре Perkin-Elmer 44В под углом 90° к направлению возбуждающего пучка света. Все измерения проводили при температуре 25 °С и постоянном перемешивании содержимого кюветы магнитной мешалкой. Длины волн возбуждения и излучения были соответственно 470 и 530 нм (максимумы возбуждения и излучения, соответственно, NBD-PE, который является донором в использованной паре красителей), либо 470 и 577 нм (максимум флуоресценции Rh-PE). В обоих случаях ширина обеих щелей составляла 5 нм. Перед началом измерения флюоресценции измеряли нулевую линию и сигнал от среды в течение достаточно продолжительного времени. За кинетикой флюоресценции или рассеяния следили на экране монитора и регистрируемую информацию записывали на диск компьютера. В ряде опытов кинетику наблюдали в течение продолжительного периода времени (до 2 суток и более). В этих случаях использовали кюветы с притёртыми тефлоновыми пробками.

Измерения нулевой линии и суммарного сигнала от одной и той же кюветы выполняли с определённой периодичностью. В промежутках между измерениями кюветы находились в термостате с температурой 25 °С и их содержимое перемешивалось. При обработке результатов измерения флюоресценции из суммарного сигнала вычитали паразитное рассеяние средой и липидами, которое измеряли в параллельных опытах при указанных условиях, используя те же концентрации немеченых липидов, а также вносили поправки на разведение флюорофоров из-за различных добавок в кювету. Все приводимые в статье значения флюоресценции даны в отн. ед., которые одинаковы во всех опытах. Несмотря на приборный шум, погрешность в измерении флюоресценции может быть снижена до любого желаемого уровня за счёт увеличения продолжительности измерения нулевой линии и суммарного сигнала. В наших измерениях погрешность составляла менее 0.1 отн. ед. Концентрация липидов в кювете во всех опытах не превышала 30 мкМ. В этих условиях дисперсия совершенно прозрачна как для возбуждающих (470 нм или 560 нм), так и для излучаемых фотонов ( нм или 577 нм). Ни поглощения, ни рассеяния этих фотонов не происходит, о чём говорит нулевая экстинкция дисперсии немеченых липидов. Для WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ вычислений и графических построений использовали программу Microsoft Excel, а также программу Summa, написанную Зильберштейном А.Я.

2.1. Первые сомнения. Размер агрегатов в дисперсии оценивали на приборе Nano-Sizer (Counter Electronics LTD, GB). В неэкструдированных дисперсиях из РОРС размер агрегатов составляет 254 ± 13 нм, сразу после экструзии через поликарбонатный фильтр с размером пор 500 – 132 ± нм, а через фильтр с диаметром пор 2000 – 174 ± 9 нм. Обращает на себя внимание, что размеры агрегатов в двух экструдированных дисперсиях отличаются незначительно, причём у экструдированных через поры размер агрегатов почти втрое больше, чем диаметр пор в использованном фильтре, а у экструдированных через поры 2000, напротив, средний размер заметно меньше, чем диаметр пор.

При измерении флюоресценции измеряемый сигнал всегда содержит паразитную составляющую, природа которой не вполне ясна. Если измеряемая флюоресценция мала, то вычитание этой компоненты обязательно, иначе погрешность становится недопустимо высокой. Для устранения этой компоненты применяют различные типы светофильтров. К сожалению, авторы не пишут, насколько эффективны применяемые ими фильтры. Доступные нам светофильтры не позволили нам сколько-нибудь существенно уменьшить паразитную составляющую. Но нам удалось резко уменьшить связанную с ней погрешность путём постановки параллельных холостых опытов, в которых флюоресцентно меченые дисперсии заменяли на немеченые, полученные в идентичных условиях. Этот приём применяли ранее и другие исследователи (Uster, Deamer, 1981).

На рис. 1 показаны результаты двух опытов, в которых использована одна и та же маточная дисперсия липида (10 мМ POPC, 10 мкМ POPC и 10 мкМ POPC), но два разных детергента. В обоих опытах в кювете содержится мкМ POPC и по 20 нМ каждого из меченых липидов. Разница в концентрациях определяется лишь погрешностями, с которыми измеряются объёмы среды и вносимой пробы маточной дисперсии, составляющими в сумме менее 2 %. Между тем хорошо видно, что разница в значениях флюоресценции дисперсии (без детергента) в кювете составляет более 10 %.

Эту разницу нельзя объяснить техническими причинами. Погрешность за счёт прибора в условиях показанных опытов составляет сотые доли отн. ед. и может быть значительно снижена за счёт увеличения продолжительности измерений (количества точек). Однако необходимости в очень высокой точности нет. Дело в том, что флюоресценция меняется во времени. На рис. достаточно ясно видно, что флюоресценция дисперсии без детергента явно уменьшается. За 12 мин записи на рис. 1Б, например, это уменьшение составляет примерно 10 %. Это явление в более или менее выраженном виде наблюдается всегда. Его нельзя объяснить в допущении, что исследуемая дисперсия состоит из одноламеллярных липосом, как принято считать.

WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ Единственный процесс, который может происходить в кювете (спонтанное слияние липосом) не влияет на концентрации донора и акцептора.

Следовательно, в рамках липосомальной идеи флюоресценция не должна меняться во времени.

Рис. 1. Флюоресценция (стандартная кварцевая кювета 1 см 1 см, объём среды 1. мл, ex = 470 нм, em = 530 нм, ширина обеих щелей 5 нм) липидной дисперсии. В А (пояснение записей с момента времени 0 слева направо) сигналы: от среды (100 мМ NaCl, 10 мМ Hepes, pH 7.4, 0.1 мМ ЭДТА, 1 мМ азида натрия); после внесения в кювету (первая стрелка) полученной методом упаривания обратной фазы дисперсии POPC (10 мМ), меченого NBD-PE и Rh-PE (по 0.1 мол% или 10 мкМ каждый), до конечной концентрации 20 мкМ; после внесения TX до конечной концентрации 4.3 мМ (вторая стрелка) и далее до концентраций; 8.5 мМ (третья стрелка); и 16.6 мМ (4-я стрелка). Б: все записи как в А за исключением того, что вместо детергента ТХ вносится RТХ до концентраций 4.3, 8.4 и 16.4 мМ, соответственно. В оригинальные записи внесены поправки на паразитное рассеяние и разбавление. Поэтому сигнал от среды отсутствует, а флюоресценция в случае остальных 4-х записей относится к дисперсии, содержащей 20 мкМ POPC и по 20 нМ NBD-PE и Rh-PE, хотя истинные концентрации этих соединений несколько ниже.

Единицы измерения (отн.ед.) флюоресценции на обоих рисунках одинаковы.

На рис. 1А и Б чётко видно, что амплитуда “шума” явно возрастает когда в среде появляется меченый липид. Это превышение, оцененное по стандартному отклонению от среднего значения сигнала, составляет 1% WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ флюоресценции меченой дисперсии. По-видимому, это означает, что в освещаемой зоне кюветы с объёмом 20-40 мкл число частиц, дающих основной вклад в суммарную флюоресценцию, не постоянно. Для этого необходимо, чтобы количество этих частиц в освещаемой зоне было невелико, по грубым оценкам не более 1000. Тогда это число может меняться в пределах 1 % либо за счёт перемешивания, либо как следствие происходящих в дисперсии реакций образования и деградации. Повидимому, эти флуктуации нельзя приписать колебанию концентраций мономерных форм флюорофоров в кювете. В условиях показанных на рис. опытов в освещаемой зоне содержится 1012 молекул NBD-PE. Вполне возможно, что в мономерном виде их всего 1000. Следовательно, флуктуации концентрации мономеров возможны, однако невозможно допустить, что измеряемая флюоресценция определяется в основном мономерами NBD-PE. Невозможно связать флуктуации и с одноламеллярными липосомами, которые согласно нынешним представлениям являются единственными липидными агрегатами в обсуждаемой дисперсии. На самом деле, такая липосома содержит около тысяч липидных молекул, из них примерно по 100 молекул каждого флюорофора. Нетрудно подсчитать, что в освещаемом объёме кюветы содержится около 10 миллиардов таких агрегатов. Это число слишком велико, чтобы исключить и колебания количества липосом в освещаемой зоне в качестве причины наблюдаемой флуктуации флюоресценции.

В настоящее время принято думать, что при концентрациях детергентов выше ККМ их растворы равновесны, а их молекулы агрегированы в мицеллы. Если в раствор таких мицелл внести относительно немного липида (липосомы) или, наоборот, в дисперсию липида внести избыток детергента (до концентрации выше ККМ), то быстро (рис. 1) образуются смешанные детергентно-липидные мицеллы, которые обычно предполагаются глобулярными. Эти комплексы могут состоять из относительно небольшого числа молекул амфифилов (менее 30). Следовательно, в каждой подобной мицелле может содержаться не более одной молекулы липида. Например, в опытах, показанных на рис. 1, на одну молекулу липида приходится более 200 молекул детергента уже при минимальной концентрации последнего.

Таким образом, липиды, включая, очевидно, и флюоресцентно меченые, оказываются предельно диспергированными, так как никаких агрегатов, состоящих из одних молекул липидов не может быть. Несложно, однако, понять, что эта гипотеза не согласуется со свойствами детергентно-липидной дисперсии, представленными на рис. 1. Если бы флюорофоры были предельно диспергированы (истинный раствор флюорофоров) уже при минимальной из использованных концентраций детергента, то дальнейшего изменения флюоресценции при последующих добавлениях детергента не должно наблюдаться, причём значение флюоресценции было бы одинаковым с любым детергентом. В опыте же мы видим, что показанные детергенты различным образом влияют на флюоресценцию липидной дисперсии.

Последний факт давно известен. Своеобразное влияние ТХ Хекстра и WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ Дюзгюнеш (Hoekstra, Dzgne, 1993) объясняют, не приводя при этом никаких доказательств, тем, что этот детергент снижает квантовый выход флюоресценции (КВФ) NBD-PE. Заметим, однако, что с этим трудно согласовать тот факт, что первая из показанных концентраций ТХ снижает флюоресценцию, а при увеличении содержания ТХ происходит уже рост флюоресценции (рис. 1А).

На рис. 1 видно, что амплитуда “шума” на записях после внесения детергентов больше, чем у среды. Это, как уже выше указано при анализе флюоресценции дисперсии липида без детергента, можно объяснить только тем, что помимо приборного “шума” есть также флуктуации флюоресценции.

Это однозначно свидетельствует, что флюорофоры в дисперсии липида и детергента не диспергированы до истинного раствора. Если бы липиды в присутствии избытка детергента распределялись однородно с образованием смешанных мицелл, то флуктуации флюоресценции отсутствовали бы из-за того, что концентрация этих агрегатов в дисперсии на много порядков величины выше, чем гипотетических одноламеллярных липосом до добавления детергента (см. выше).

Все вышесформулированные выводы верны и в предположении, что детергент при концентрациях выше ККМ образует не глобулярные мицеллы, а цилиндричиеские или дискоидные мицеллы (бицеллы), а с липидами соответственно такие же, но смешанные мицеллы. Действительно, уже при первой концентрации детергента в кювете на одну молекулу красителя приходится более 200 тысяч молекул последнего. Среднее расстояние между соседними молекулами донора и акцептора в предположении их гомогенного распределения многократно превышает радиус Фёрстера и какой-либо перенос энергии от первого ко второму полностью исключается.

Следовательно, изменение флюоресценции с увеличением концентрации детергента происходить не может. Невозможны и флуктуации флюоресценции, поскольку число молекул амфифила в цилиндричиеских или дискоидных мицеллах существенно меньше, чем молекул липида в одноламеллярных липосомах и, следовательно, концентрация любых мицелл больше концентрации липосом до внесения детергента.

Посде внесения меченой липидной дисперсии в метанол (рис. 2) флюоресценция в течение нескольких минут возрастает (рис. 2А).

Устанавливающееся постоянное значение существенно выше, чем в водной среде даже в присутствии детергента (рис. 1). Это явление давно известно и объясняют его зависимостью КВФ от среды (Stryer, 1978; Hoekstra, Dzgne, 1993). Заметим, однако, что и в метаноле амплитуда “шума” на записи флюоресценции больше, чем на записи сигнала от метанола. Флуктуации флюоресценции, являющиеся причиной этого, нельзя объяснить, предполагая, что липиды диспергированы в метаноле либо также как в воде, либо до мицелл, либо до отдельных молекул.

WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ Рис. 2. Флюоресценция той же меченой дисперсии POPC при тех же настройках флюориметра, что и на рис. 1, в метаноле. Концентрации POPC и меток, а также отн. ед. те же, что и на рис. 1. В А показан сигнал от среды и флюоресценция после внесения дисперсии в кювету (стрелка). В Б флюоресценция показана в увеличенном виде.

2.2. Флюоресценция меченой дисперсии POPC как функция её возраста.

Анализ результатов простых опытов, представленных на рис. 1, привели нас к выводам, противоречащим общепринятым взглядам на природу липидной дисперсии, с которой эти опыты выполнены, и на природу дисперсии смеси липидов и детергента. Проверка этих выводов представляется более, чем уместной, и далее мы описываем результаты выполненных с этой целью экспериментов. Для этого мы упростили до предела состав дисперсий и стали использовать вместо указанной в подписи к рис. 1 среды бидистиллированную воду. Это вполне допустимо, поскольку основной липид системы (POPC) не влияет на рН среды ни при каких концентрациях, а концентрации NBD-PE и Rh-PE очень низки даже в маточных дисперсиях и поэтому также не влияют на рН. Мы исследовали следующие 8 липидных дисперсий в воде: 1) POPC 1 мМ, NBD-PE 1 мкМ, Rh-PE 1 мкМ (Д1); 2) POPC 100 мкМ, NBD-PE 1 мкМ, Rh-PE 1 мкМ (Д2); 3) POPC 10 мкМ, NBDPE 1 мкМ, Rh-PE 1 мкМ (Д3); 4) NBD-PE 1 мкМ, Rh-PE 1 мкМ (Д4); 5) POPC 10 мМ, NBD-PE 10 мкМ, Rh-PE 10 мкМ (Д5); 6) POPC 1 мМ, NBD-PE мкМ, Rh-PE 10 мкМ (Д6); 7) POPC 100 мкМ, NBD-PE 10 мкМ, Rh-PE 10 мкМ (Д7) и 8) NBD-PE 10 мкМ, Rh-PE 10 мкМ (Д8). В качестве детергентов испытаны DHPC, а также все соединения, которые были использованы прежде для определения максимальной флюоресценции (Fmax) в WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ исследованиях слияния одноламеллярных липосом методом РПЭ, а именно, додецилсульфат натрия (SDS), цетилтриметиламмоний бромид (CTAB), Тритон Х-100 (ТХ) и восстановленный ТХ (RТХ). Заметим, что в сотнях исследований по слиянию одноламеллярных липосом использовали меченые дисперсии, в которых соотношение немеченых и меченых липидов такое же, как в дисперсиях Д2 и Д6 (примерно по 1 мол% NBD-PE и Rh-PE), но концентрации немеченых и меченых липидов в маточных дисперсиях были в 100 и соответственно в 10 раз выше. Все дисперсии получали одинаково (см.

Методы). Во всех описываемых в этом разделе опытах в кювету вносили одни и те же количества меченых липидов, а именно, до концентрации нМ. Для краткости значение флюоресценции в этих условиях в отсутствии детергента и с детергентом мы будем называть F(ДХ) и F(ДX-Y), где ДХ – соответствующая дисперсия, а Y – детергент. Напоминаем, что концентрации красителей в любых двух опытах могут отличаться не более, чем на 2 %.

В таблице 1 приведены значения флюоресценции некоторых исследованных дисперсий в разное время после их изготовления. Дисперсии хранились на протяжении всего указанного периода в термостате при 25 °С.

Никаких признаков микроорганизмов за это время не замечено. Значения флюоресценции всех дисперсий хорошо воспроизводимы и в первые 30 дней практически постоянны. С дальнейшим увеличением возраста дисперсий флюоресценция постепенно уменьшается и через 90 дней для ряда дисперсий она значительно меньше, чем у свежеприготовленных.

Таблица 1. Флюоресценция дисперсий Д1-Д5* 1-30 31.6±1.1 (11) 5.2±0.1 (5) 2.2±0.2 (6) 2.3±0.1 (12) 40.9±2.5 (5) *Приведены значения флюоресценции (условия измерения указаны в подписи к рис. 1).

Концентрация NBD-PE и Rh-PE во всех случаях 30 нМ, а концентрация POPC в мкМ указана в скобках рядом с названием дисперсии. В первой колонке указан возраст дисперсий в днях. Во второй строчке приведены средние значения и стандартные отклонения от среднего (в скобках число измерений).

Поскольку по существующим представлениям при хранении дисперсий в них может происходить лишь спонтанное слияние липосом, не влияющее на концентрации красителей, данные Таблицы 1 в рамках липосомальной идеи интерпретации не поддаются.

2.3. Влияние ультразвука на флюоресценцию. На рис. 3 показаны записи флюоресценции дисперсий Д1 и Д4 до и после ультразвукового облучения содержимого кюветы. Видно, что F(Д1) сама по себе уменьшается во времени. Облучение резко (более чем вдвое) уменьшает F(Д1), причём она продолжает уменьшаться во времени. F(Д4), напротив, увеличивается под влиянием облучения, но после этого наблюдается заметное уменьшение во времени. Согласно существующим представлениям (Huang, 1969), ультразвук диспергирует липиды до малых одноламеллярных липосом.

WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ Поскольку превращение крупных одноламеллярных липосом в малые не меняет концентрации NBD-PE и Rh-PE в меченых липидах, изменение флюоресценции в рамках липосомальной идеи объяснить невозможно.

Противоположное по знаку изменение флюоресценции на рис. 3А и 3Б позволяет исключить деградацию красителей под влиянием ультразвука как причину этого явления.

Рис. 3. Флюоресценция липидных дисперсий Д1 (А) и Д4 (Б) до (записи после первой стрелки) и после облучения содержимого кюветы ультразвуком (22 кгц, 30 мин, 25 °С) (записи после второй стрелки). Содержание NBD-PE и Rh-PE в кюветах по 30 нМ в обоих случаях, а концентрация POPC 30 мкМ (А) и 0 мкМ (Б). Настройки флюориметра как на рис. 1.

2.4. Влияние детергентов на флюоресценцию. На рис. 4 показана флюоресценция дисперсий Д1, Д2 и Д4 до и после внесения RТХ в кювету.

Хотя концентрации красителей в кювете во всех опытах одинаковы, средние за время записи значения флюоресценции составляют F(Д1) = 32.2 отн. ед.

(рис. 4А), F(Д2) = 5.4 отн. ед. (рис. 4Б) и F(Д4) = 2.2 отн. ед. (4В), соответственно. Это, как известно, объясняется в рамках теории Фёрстера.

Перенос энергии от донора (NBD-PE) к акцептору (Rh-PE) возрастает по мере уменьшения среднего расстояния между ближайшими друг к другу WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ флюорофорами, которое, очевидно, происходит при уменьшении концентрации немеченого липида (POPC) в дисперсии. Интересно отметить, что воспроизводимость значений F(ДХ) в разных опытах для всех дисперсий вполне удовлетворительная, но иногда (редко) бывают значительные отклонения от среднего значения.

Рис. 4 содержит много другой информации, которая уже непонятна в рамках существующих представлений. На рис 4А хорошо видно, что F(Д1) уменьшается во времени. За 15 мин регистрации уменьшение составляет примерно 4.5 %. Если дисперсия содержит одни одноламеллярные липосомы, как принято считать, то это совершенно непонятно. На самом деле, изменение флюоресценции свидетельствует, очевидно, о каких-то процессах, протекающих в дисперсии. Но, согласно современным представлениям, единственной реакцией, которая может происходить между одноламеллярными липосомами, является их спонтанное слияние. Ясно, однако, что спонтанное слияние не может влиять на расстояние между молекулами донора и акцептора, особенно, если учесть размеры агрегатов (около 2000 ). Снижение флюоресценции во времени хорошо видно и на рис. 1. Но его нет на рис. 4Б и 4В, зато на последнем хорошо видно, что растёт во времени F(Д1-RTX). Невозможно объяснить, отчего образование смешанных детергентно-липидных липосом происходит в две фазы, резко различных по скорости процесса, причём в условиях, когда концентрация детергента превышает концентрацию липида примерно в 100 тысяч раз.

WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ Рис. 4. Флюоресценция липидных дисперсий Д1 (А), Д2 (Б) и Д4 (В) до (записи после первой стрелки) и после внесения в кювету RТХ до концентрации 4.2 мМ (записи после второй стрелки). Содержание NBD-PE и Rh-PE в кюветах по 30 нМ во всех случаях, а концентрация POPC 30 мкМ (А), 3 мкМ (Б) и 0 мкМ (В). Настройки флюориметра как на рис. 1.

Не менее интересно, что амплитуда “шума” на записи F(Д1) явно больше, чем у сигнала от среды (рис. 4А), но нет видимой разницы в этих амплитудах для дисперсий Д2 и Д4 (рис. 4Б и 4В). Это значит, что в кювете с дисперсией Д1 флуктуации флюоресценции больше, чем в кюветах с Д2 и Д4.

Не более понятна и разница в значениях флюоресценции дисперсий, содержащих RТХ (рис. 3). Через 15 мин перемешивания липидов с детергентом F(Д1-RТХ) = 37.6 отн. ед., F(Д2-RТХ) = 30.5 отн. ед. и F(Д4RТХ) = 13.1 отн. ед. При этом амплитуда “шума” на записи F(Д1-RТХ) примерно на 30 % превышает амплитуду “шума” сигнала от среды. Это говорит о том, что и в присутствии детергента флюоресценция явно флуктуирует.

На рис. 5 и 6 показана флюоресценция дисперсий Д1 и Д4 до и после внесения соответственно ТХ и SDS в кювету. Все отмеченные выше особенности видны и на этих рисунках. Флюоресценции дисперсий Д1 и Д после 15 мин перемешивания с детергентом составляют F(Д1-ТХ) = 25.3 отн.

ед., F(Д4-ТХ) = 8.1 отн. ед., F(Д1-SDS) = 27.5 отн. ед. и F(Д4-SDS) = 4.2 отн.

ед. Соответствующие значения флюоресценции в присутствии RТХ F(Д1RТХ) = 32.2 отн. ед. (рис. 4А) и F(Д4-RТХ) = 12.3 отн. ед. (рис. 4В) больше.

Отношения флюоресценций дисперсий Д1 и Д4 с обсуждаемыми детергентами равны F(Д1-RТХ)/F(Д4-RТХ) = 3.2, F(Д1-ТХ)/F(Д4-ТХ) = 3.1, F(Д1-SDS)/F(Д4-SDS) = 6.5.

WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ Рис. 5. Флюоресценция липидных дисперсий Д1 (А) и Д4 (Б) до (записи после первой стрелки) и после внесения в кювету ТХ до концентрации 4.2 мМ (записи после второй стрелки). Содержание NBD-PE и Rh-PE в кюветах по 30 нМ в обоих случаях, а концентрация POPC 30 мкМ (А) и 0 мкМ (Б). Настройки флюориметра как на рис. 1.

WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ Рис. 6 Флюоресценция липидных дисперсий Д1 (А) и Д4 (Б) до (записи после первой стрелки) и после внесения в кювету SDS до концентрации 6.9 мМ (записи после второй стрелки). Содержание NBD-PE и Rh-PE в кюветах по 30 нМ в обоих случаях, а концентрация POPC 30 мкМ (А) и 0 мкМ (Б). Настройки флюориметра как на рис. 1.

Такая же качественная картина наблюдается и с дисперсиями Д5-Д8, у которых отношение концентраций немеченых и флюоресцентно меченых липидов такое же, как и в дисперсиях Д1-Д4. Все без исключения перечисленные выше моменты для дисперсий Д1-Д4 имеют место и с этими дисперсиями. Что касается количественного аспекта, то у дисперсий Д5-Д есть весьма интересные особенности. У дисперсий Д6-Д8 флюоресценция в отсутствии детергента в среднем достоверно ниже, чем у соответствующих дисперсий из ряда Д2-Д4. Лишь F(Д5) во всех опытах выше F(Д1). В показанных опытах F(Д5) равна 45.2 отн. ед. (рис. 7А) и 40.3 отн. ед. (рис.

8А), в то время как F(Д1) равна в среднем 32.2 отн. ед. (рис. 4А), 32.8 отн. ед.

(рис. 5А) и 32.3 (рис. 6А). При этом F(Д1) во всех случаях заметно уменьшается во времени, что хорошо видно на рисунках, в то время как F(Д5) за время регистрации практически не меняется.

WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ Рис. 7. Флюоресценция липидных дисперсий Д5 (А) и Д8 (Б) до (записи после первой стрелки) и после внесения в кювету RТХ до концентрации 4.3 мМ (записи после второй стрелки). Содержание NBD-PE и Rh-PE в кюветах по 30 нМ в обоих случаях, а концентрация POPC 30 мкМ (А) и 0 мкМ (Б). Настройки флюориметра как на рис. 1.

Рис.8. Флюоресценция липидных дисперсий Д5 (А) и Д8 (Б) до (записи после первой стрелки) и после внесения в кювету SDS до концентрации 7.1 мМ (записи после второй стрелки). Содержание NBD-PE и Rh-PE в кюветах по 30 нМ в обоих случаях, а концентрация POPC 30 мкМ (А) и 0 мкМ (Б). Настройки флюориметра как на рис. 1.

POPC влияет на флюоресценцию меченой дисперсии Д1 (рис. 9) точно также, как и любой из исследованных детергентов (ср. с рис. 3В, 4Б, 5Б, 6Б).

Не удаётся обнаружить никаких различий, позволяющих заключить, как принято думать, что в первом случае рост флюоресценции обусловлен WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ слиянием меченых и немеченых одноламеллярных липосом (Hoekstra, Dzgne, 1993), а в остальных образованием смешанных детергентнолипидных мицелл (Fung, Stryer, 1978; Struck, Hoekstra, Pagano, 1981).

Рис. 9. Флюоресценция меченой дисперсий Д1 (запись после первой стрелки) и после внесения в кювету POPC до концентрации 30 мкМ (запись после второй стрелки).

Содержание NBD-PE и Rh-PE в кюветах по 30 нМ. Настройки флюориметра как на рис. 1.

Эксперименты, показанные выше, были выполнены со всеми 8 мечеными дисперсиями и 5 детергентами, указанными ранее. Были предприняты также разнообразные попытки добиться одинаковых величин флюоресценции у дисперсий с детергентами или хотя бы с одним из детергентов. Все они оказались безрезультатными. Оказалось, что длительное перемешивание указанных дисперсий с детергентами (до 7 суток) при 25 °С слабо влияет на флюоресценцию (рис. 10). Ультразвуковое облучение содержимого кюветы (липида с детергентом) до 1 часа также не позволяет добиться одинаковых величин флюоресценции. Перемешивание содержимого кюветы при 70 °С в течение 1 часа также мало влияет на флюоресценцию.

WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ Рис. 10. Флюоресценция меченых дисперсий Д1 (А) и Д4 (Б), измеренная на протяжении примерно 50 часов после внесения в кювету ТХ до концентрации 4.2 мМ (см.

Материалы и методы). Содержание NBD-PE и Rh-PE в кюветах по 30 нМ. Настройки флюориметра как на рис. 1. На рисунке А приведена также прямая, указывающая среднюю скорость изменения флюоресценции F = a + bt, где a и b – коэффициенты, t – время, a = 26 отн.ед., b = -0.03 отн.ед./час.

В таблице 2 приведены все значения флюоресценции для всех исследованных дисперсий в присутствии детергентов, а также в диметилформамиде. Согласно идее смешанных детергентно-липидных мицелл, с любой из исследованных дисперсий и с любым детергентом значение F(ДХ-Y) должно быть одним и тем же. Из таблицы видно, что в зависимости от содержания немеченого липида и применяемого детергента флюоресценция имеет самые разнообразные значения, несмотря на одинаковое содержание красителей в кювете. Так, в зависимости от суммарной концентрации липидов и соотношения меченые/немеченые липиды при использовании RТХ в качестве детергента флюоресценция может иметь значение от 5.1 до 60.5 отн. ед., а с SDS от 1.4 до 27.5 отн. ед.

Самые высокие значения флюоресценция имеет в диметилформамиде, но она также зависит от содержания POPC в дисперсии. Это значит, очевидно, что максимальную флюоресценцию (Fmax) меченой дисперсии невозможно определить ни с помощью детергентов, ни с помощью амфифильных растворителей. Следовательно, проверить применимость теории Фёрстера к липидным дисперсиям тоже невозможно. Каким образом Фунгу и Страйеру (Fung, Stryer, 1978) удалось продемонстрировать идеальное описание своих результатов теорией Фёрстера, используя SDS для измерения Fmax, для нас является загадкой. Столь же непонятно, как Страк и соавт. (Struck, Hoekstra, Pagano, 1981) измеряли Fmax, используя ТХ, определяя при этом поправочный коэффициент на влияние ТХ на КВФ.

WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ Таблица 2. Флюоресценция дисперсий Д1-Д8 в присутствии избытка детергента и в диметилформамиде* *Измерения выполнены при настройках флюориметра, указанных в подписи к рис. 1, а значения флюоресценции после 15 мин перемешивания дисперсии с детергентом приведены в отн. ед., использованных повсюду в статье. В кювету каждая из дисперсий вносилась до концентраций 30 нМ NBD-PE и Rh-PE. Концентрации POPC в мкМ указаны в скобках около названий дисперсий, а концентрации детергентов около их названий.

DMF = диметилформамид.

Представление будто использованные в наших опытах липидные дисперсии состоят практически из одних одноламеллярных липосом и что при добавлении к любой из них детергента образуется равновесный раствор смешанных детергентно-липидных мицелл совместимы с данными таблицы только в одном случае. Такой равновесный раствор должен образовываться крайне медленно даже в условиях ультразвукового облучения (см. выше).

Это, конечно, крайне маловероятно. К тому же Тритон Х-100 широко применяется для выделения хроматина из клеточных ядер. Достаточно непродолжительной обработки ядер 0.3 % (4. 9 мМ) ТХ для того, чтобы хроматин быстро выходил из ядер (Viola-Magni et al.). Следовательно, ТХ быстро солюбилизирует липиды одноламеллярных мембран клеточных ядер.

Нет никаких оснований полагать, что с мембранами одноламеллярных липосом реакция на много порядков величины медленнее. Приведённые в этом разделе факты показывают, что реакция детергентов с липидами есть и она весьма быстрая (см., например, рис. 1 и 3). Но ничто не указывает на то, что эта реакция единственная. Напротив, медленный рост флюоресценции после начального скачкообразного увеличения в некоторых случаях (например, на рис. 4А) явно указывает на наличие по меньшей мере двух реакций. Многое на приведённых рисунках указывает, что быстрая реакция не приводит к установлению равновесия в системе. Незначительное, но достоверное увеличение флюоресценции после удвоения концентрации детергента в системе (рис. 1) также необъяснимо в допущении, что в присутствии детергента быстро образуется раствор смешанных детергентнолипидных глобулярных мицелл. Ведь уже после первого внесения в системе приходится по 140 молекул детергента на молекулу липида, а глобулярная мицелла вряд ли может содержать более 20 молекул. И совсем непонятно, почему флюоресценция значительно меньше, когда в системе приходится примерно по 100 тысяч молекул детергента на молекулу липида (ср. рис. 4В и 4А, 5Б и 5А, 6Б и 6А, 7Б и 7А). Данные рис. 9 и таблицы 2 не оставляют никаких сомнений в том, что в системе протекает не одна быстрая реакция, WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ которая во всех опытах регистрируется. Протекает по крайней мере ещё одна очень медленная реакция, из-за которой равновесие в системе детергент/липид не достигается за обозримое время. Отсутствие изменения флюоресценции во времени после внесения детергента (рис. 4В, 5Б, 6Б, 7Б) обусловлено именно этим и вовсе не указывает на равновесие в системе.

2.5. Флюоресценция донора и акцептора при возбуждении донора. Итак, мы выяснили, что рекомендация Методов энзимологии определять Fmax с помощью CTAB и ТХ (Hoekstra, Dzgne, 1993) является ошибочной. В той же статье при описании метода РПЭ утверждается, что смешивание липидов при слиянии меченых и немеченых одноламеллярных липосом можно измерять не только по возрастанию флюоресценции NBD-PE, которая при этом имеет место, но и по уменьшению флюоресценции Rh-PE. Это, однако, неудобно, поскольку флюоресценция акцептора до внесения немеченых липидов низка, а при смешивании она становится ещё меньше. Именно так должно происходить по Фёрстеру при разведении смеси донора и акцептора.

В таблице 3 приведены флюоресценции исследованных дисперсий, освещаемых фотонами 470 нм (максимум возбуждения донора) при em нм (максимум эмиссии донора) и при em 577 нм (максимум эмиссии акцептора). Видно, что при разбавлении смеси NBD-PE и Rh-PE немечеными липидами (номинальные концентрации красителей в кювете для любой из исследованных дисперсий одинаковы, отличаются их концентрации в липидной субфазе) возрастает и эмиссия донора, и эмиссия акцептора.

Одного этого факта достаточно, чтобы заключить, что теория Фёрстера не работает, ибо она предсказывает противоположное изменение флюоресценций донора и акцептора липидов при слиянии липосом друг с другом и клеток с липосомами.

Таблица 3. Флюоресценция NBD-PE и Rh-PE дисперсий Д1-Д8* *Измерения выполнены при настройках флюориметра, указанных в подписи к рис. 1 за исключением того, что эмиссия измерялась как при 530 нм, так и при 577 нм. В кювету каждая из дисперсий вносилась до концентраций 30 нМ NBD-PE и Rh-PE, а отн. ед. имеют значения, использованные повсюду в статье.

WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ Не менее интересно, что флюоресценция 577 нм дисперсии, освещаемой фотонами 470 нм, также флуктуирует и уменьшается во времени, как и флюоресценция 530 нм (рис. 11).

Рис. 11. Флюоресценция (стандартная кварцевая кювета 1 см 1 см, объём среды 1. мл, ex = 470 нм, em = 577 нм, ширина обеих щелей 5 нм) липидной дисперсии Д1 (вторая запись). Содержание NBD-PE и Rh-PE в кюветах по 30 нМ, а концентрация POPC 30 мкМ.

1 отн. ед. такая же, как и везде. Благодаря горизонтальным линиям сетки хорошо видно снижение флюоресценции во времени. Также хорошо видно, что амплитуда “шума” сигнала от среды (первая запись) значительно меньше, чем на второй записи.

Приведённые в этом параграфе факты имеют принципиальное значение для проблемы организации молекул липида в дисперсии. На самом деле, перенос энергии от NBD-PE к Rh-PE происходит не по Фёрстеру. Но он происходит, поскольку Rh-PE флюоресцирует, когда возбуждается NBD-PE.

Значит, неизбежен вопрос о механизме этого переноса. Единственной альтернативой фёрстеровскому механизму переноса является образование контактных комплексов NBD-PE/Rh-PE, у которых оптические свойства другие, чем у мономеров NBD-PE и Rh-PE. В теории Фёрстера подобные комплексы исключаются. Тем не менее взаимодействие между донором (Д) и акцептором (А) постулируется, что позволяет говорить об особых “фёрстеровских комплексах” Д-А. Поэтому уместно прояснить вопрос о разнице между этими и обычными в физико-химии (контактными) комплексами. Между компонентами контактных Д-А, очевидно, существует взаимодействие за счёт сил близкого действия. Эти же силы могут обеспечить и образование контактного комплекса, для чего требуется “столкновение” (сближение) Д и А. В теории Фёрстера предполагается, что между Д и А действуют только силы дальнего действия (резонанс). Поэтому Д и А не образуют ни при каком сближении собственно комплексов, т.е.

растворы Д и А являются истинными при любых концентрациях. Однако эффективность “резонансного” переноса энергии от Д к А описывается законом действия масс, в котором константа скорости переноса предполагается пропорциональной r–6 (Fung, Stryer, 1978), где r – среднее расстояние между соседними Д и А в растворе. Закон действия масс применим для описания скорости любой реакции. Скорость образования и WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ равновесная концентрация контактных комплексов Д-А в трёхмерном пространстве (объёме) пропорциональна r–6. В этом легко убедиться, выражая в уравнении закона действия масс для бимолекулярной реакции концентрации через адекватную функцию r.

Если липиды организованы в одноламеллярные липосомы, то концентрация контактных комплексов NBD-PE/Rh-PE пропорциональны r–4, т.е. при разведении немечеными липидами она меняется менее круто, чем перенос энергии по Фёрстеру. Важно, однако, что в условиях таблицы интенсивность излучения фотонов 530 нм в ряду дисперсий Д1-Д4 и Д5-Д должна уменьшаться, а фотонов 577 нм увеличиваться независимо от различий оптических свойств комплекса NBD-PE/Rh-PE и неассоциированных друг с другом молекул NBD-PE и Rh-PE. Качественно картина должна быть одинакова независимо от способа переноса энергии от донора к акцептору. Поэтому данные таблицы 3 принципиально значимы для организации молекул липида в дисперсии. Эти данные, как и флуктуации флюоресценции дисперсий Д1-Д8 (см. выше), и снижение флюоресценции меченых дисперсий во времени (рис. 1А, 4А, 5А, 6А и 8А) или по мере их старения (таблица 1), а также флюоресценция липидных дисперсий с избытком детергента одинаково несовместимы с представлением, что исследованные дисперсии состоят практически из одних одноламеллярных липосом.

Таким образом, представленная работа свидетельствует о том, что теория Фёрстера не описывает свойства дисперсий липидов, меченых донором и акцептором (п. 2.5), и позволяет как минимум подвергнуть сомнению выводы, сделанные из исследований липидных дисперсий методом резонансного переноса энергии (Fung, Stryer, 1978; Struck, Hoekstra, Pagano, 1981 и ещё более 500 публикаций).

Результаты измерения флюоресценции липидных дисперсий, содержащих избыток детергента (таблица 2), позволяют заключить, что по меньшей мере детергенты типа исследованных в данной работе непригодны для получения одноламеллярных липосом (King, Marchbanks, 1982). “Детергентный” метод получения липосом основан на двух постулатах (Lasic, 1988): 1) в присутствии избытка детергента дисперсия состоит из детергентнолипидных мицелл; 2) бицеллы (липидные дискоидные мицеллы), спонтанно образующиеся после удаления детергента, самопроизвольно превращаются в одноламеллярные липосомы. Таблица 2 показывает, что постулат 1 неверен.

Непригоден для получения липосом и так называемый метод иньекции в водную среду концентрированного раствора липидов в амфифильном растворителе (Batzri, Korn, 1973). Этот метод основан на предположении, что липид в амфифильном растворителе диспергирован до молекул, которые после внесения пробы раствора в большой объём воды спонтанно WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ превращаются в одноламеллярные липосомы через посредство бицелл (Lasic, 1988). Таблица 2 показывает, что указанное предположение также неверно.

Детергент с липидом в воде может превратиться в смешанные детергентно-липидные мицеллы только при условии, что сам детергент при концентрации выше ККМ диспергирован до мицелл. Поскольку детергентнолипидных мицелл нет (таблица 2), неверно и утверждение, что при концентрации детергента ниже ККМ он диспергирован до молекул, а при концентрациях выше ККМ до мицелл.

В следующих двух статьях (Топалы, 2006; Топалы, Топалы, 2006) мы описываем предлагаемую обобщённую модель дисперсии амфифилов и её приложение к интерпретации всех приведённых в этой работе фактов. Здесь же мы сформулировали ряд выводов на основании представленного материала. Эти выводы не зависят от структуры липидных и детергентнолипидных комплексов и механизма их образования.

Авторы глубоко благодарны:

1. Южнокалифорнийскому университету в Лос-Анжелесе, привлекшему нас к исследованию слияния липосом в 1998 году и предоставившему для этого в течение одного года материальную поддержку;

2. Зильберштейну А. Я., написавшему для нас программу Summa и стимулирующему своими критическими замечаниями нашу работу;

3. Киму Ю. А., предоставившему нам возможность пользоваться флюориметром;

4. Векшину Н. Л. за консультации по оптическим методам;

5. Топалы Ю. В. за постоянную материальную поддержку наших исследований.

Топалы В.П., Исследование дисперсий фосфолипидов. 2. Модель дисперсии амфифилов. Medline.Ru, 2006, (следующая статья 2), том 7, стр. 135- Топалы В.П., Топалы Э.Е. Исследование дисперсий фосфолипидов. 3.

Экспериментальная проверка модели дисперсии липидов. Medline.Ru, 2006, (следующая статья 3) том 7, стр. 157- Bangham A.D., Standish M.M.,Watkins J.C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen Phospholipids. J.Mol. Biol., 1965, august, v. 13, n. 1, p. 238- Batzri S., Korn E.D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochim.

Biophys. Acta, 1973, v. 298, n. 4, p. 1015- Deamer D., Bangham A.D. Large Volume Liposomes by an Ether Vaporization Method.

Biochim. Biophys. Acta, 1976, v. 443, n. 3, p. 629- Enoch G., Strittmatter P. Formation and properties of 1000--diameter, single bilayer phospholipid vesicles. PNAS USA,1979, v. 76, n. 1, p. 145- Fung K.-K., Stryer L. Surface density determination in membranes by fluorescence energy transfer. Biochemistry, 1978, v. 17, n. 24, p. 5241- Hoekstra D., Dzgne N. Lipid mixing assays to determine fusion in liposome systems.

Methods in Enzymology, v. 220, part A, p. 15-32, WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ Huang C. Studies on Phosphatidylcholine Vesicles. Formation and Physical Characteristics.

Biochemistry, 1969, v. 8, n. 1, january, p. 344- King R. G., Marchbanks R M. The incorporation of solubilized choline-transport activity into liposomes. Biochem J., 1982, v. 204, n.2, p. 565–576.

Lasic D.D. The mechanism of vesicle formation. Biochem. J. (1988) v. 256, n. 1, p. 1- Larrabee A. L. Time-dependent changes in the size distribution of distearoylphosphatidylcholine vesicles. Biochemitry, 1979, v. 18, n. 15, p. 3321- Lentz B.R., Carpenter T.J., Alford D.R. Spontaneous Fusion of Phosphatidylcholine Small Unilamellar Vesicles in the Fluid Phase. Biochemistry, 1987, v. 26, n. 17, p. 5389- Lichtenberg D., Freire E., Schmidt C.F., Barenholz Y., Felgner P.L., Thompson T.E. Effect of surface curvature on stability, thermodynamic behavior, and osmotic activity of dipalmitoylphosphatidylcholine single lamellar vesicles. Biochemistry, 1981, v. 20, n.12, p. 3462- Miyamoto V.K., Stoeckenius W. Preparation and Characteristics of Lipid Vesicles. J.

Membrane Biol. 4, 252-269 (1971) Reynolds J.A. The role of micelles in protein-detergent interactions. Methods in Enzymology, v. 61, part H, p. 58-62, Riquelme G., Lopez E., Garcia-Segura L.M., Ferragut J.A., Gonzalez-Ros J.M. Giant liposomes: a model system in which to obtain patch-clamp recordings of ionic channels.

Biochemistry, 1990, v. 29, n. 51, p. 11215 – Struck D. K., Hoekstra D., Pagano R. E. Use of resonance energy transfer to monitor membrane fusion. Biochemistry, 1981, v. 20, n. 7, p. 4093-9.

Stryer L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Ann.Rev.Biochem., 1978, v.

47, p. 819- Szoka F., Jacobson K., Derzko Z., Papahadjopoulos D. Fluorescence studies on the mechanism of liposome-cell interactions in vitro. BBA, 1980, july, v. 600, n. 1, p. 1- Uster P.S., Deamer D.W. Fusion competence of phosphatidylserine-containing liposomes quantitatively measured by a fluorescence resonance energy transfer assay. Arch.Bioch.Bioph., 1981, july, v.209, n.2, p.385- M. P. Viola-Magni, P. B. Gahan, E. Albi, R. Iapoce, P. F. Gentilucci. Phospholipids in chromatin: incorporation of [32P]O42– in different subsellular fractions of hepatocytes. Cell Biochemistry and Function, v. 4, p. 283-288, 1986.

Abstract

Extruded aqoueos dispersions of fluorescently labeled with NBD-PE and RhPE in molar relation 1:1 palmitoyloleoylphosphatidylcholine (POPC) prepared by inverse phase evaporation method were studied. Both 530 nm (maximum of NBDPE emission) and 577 nm (maximum of Rh-PE emission) fluorescences of the dispersion irradiated with 470 nm fotons (maximum of NBD-PE excitation) monotonically increase with POPC concentration. This fact indicates that energy transfer from donor to acceptor is not accounted for by Frster’s theory and the resonance energy transfer (RET) method is not suitable for studying dispersions of amphiphyles. The fluorescence of dispersions fluctuates and decreases in time. The recurring measurements of mother dispertions maintained in the dark at 25 °С over a long period of time (up to 4 months) also revealed the reliable decrease of fluorescence. These facts cannot be explained in the framework of hypothesis that the dispersions studied consist of unilamellar liposomes. In the presence of high concentrations (higher than CMC, critical micellar concentration) of an detergent WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ the fluorescence (F(D)) sharply increases with POPC content of dispersion. F(D) values of dispersions with equal concentrations of dyes and detergent but different POPC concentrations cannot be in any measure drown together even if dispersions are stirred at 25 °С over a long period of time (up to 7 days) or ultrasonicated up to 60 min. This picture is observed with any of detergents (sodium dodecylsulfate, cetyltrimethylammonium bromide, Triton X-100, reduced Triton X-100) used earlier for determination of maximal dispertion fluorescence (Fmax) and with diheptylphosphatidylcholine also. These facts sdemonstrate that Fmax indispensable for analysis of the results obtained by RET method cannot be measured with the aid of detergents. Moreover they show that models of detergent dispersion are false. The assertion there is a nominal concentration (СМС) below which the detergent is dispersed to molecules and above which to micelles is incorrect. The statement the introduction into а lipid dispersion of detergent to а concentration above CMC results in formation of mixed detergent-lipid micelles is incorrect also.

Methods in Enzymology recommend the RET method for studying the fusion of liposomes and detergents (cetyltrimethylammonium bromide and Triton X-100) for measuring Fmax (Hoekstra D., Dzgne N., Lipid mixing assays to determine fusion in liposome systems. Methods in Enzymology, v. 220, part A, p. 15-32, 1993), and this is an enigma. All data of this paper are accounted for in the framework of generalized model of amphiphile dispersion proposed. The model and the interpretation of data are presented in the following two papers of this series.





Похожие работы:

«Сэл Рейчел Изменение Земли и 2012 год Послания Основателей (вторая редакция) Перевод: Любовь Подлипская Март, 2008 Содержание Глава 9 – Изменения Земли, объясненные с разных Предисловие Благодарности преимущественных позиций Антропологические данные Введение Философия изменений Психология изменений Земли Часть 1 – Необходимая основная информация Метафизика изменений Земли Религия Глава 1 - Природа Вселенной Духовность Глава 2 – Божественные Разрешения Биология Глава 3 – Краткая история Земли В...»

«Емкости для воды б у в г Красноярске Европейская клиника в г Воронеже Доступ к файлам windows 7 через mac Е 160 кaтaлог зaпчaстей Доставка груза г Озерск Е Беркова картинки Есть ли яйца попугаи без г Е польнa мирaжи Есн с пособия к отпуску Доступ к андроиду с win Дударева елена ивановна гАбакан Жеплод для соуса к жареным куропаткам Евротрансмиссия г Москва Е болячки шар-пеев Драйвер к принтеру s 200 ЕТашков умер Документы при открытии счета юр лицу в втб по гМоскве Жалобы и предложения на...»

«1 1. Цели освоения дисциплины Целью дисциплины - является овладение слушателями магистратуры дисциплины, а также умения и навыка анализа и проектирования системы севооборотов для хозяйств различных форм собственности. 2. Место дисциплины в структуре магистерской программе Данная дисциплина является вариативной частью профессионального цикла дисциплин, включенных в учебный цикл согласно ФГОС ВПО направления 110400.68 Агрономия. Для успешного освоения дисциплины необходимы знания по следующим...»

«К исх. № от.04.2006г. К вх. № от.04.2006г. НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЯДЕРНОЙ ФИЗИКИ Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова УДК 524.354 Номер государственной регистрации: Экз.№ 1 инв. № УТВЕРЖДАЮ Директор научно-исследовательского института ядерной физики имени Д.В.Скобельцына МГУ имени М.В.Ломоносова. _М.И.Панасюк 2009 г. НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ОТЧЕТ Методика регистрации и определение конструкции научной аппаратуры для изучения транзиентных атмосферных явлений на...»

«НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЯДЕРНОЙ ФИЗИКИ ИМЕНИ Д.В.СКОБЕЛЬЦЫНА МОСКОВСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА УДК 537.591 № госрегистрации 01.9.80004286 Инв. № 01/08-02 УТВЕРЖДАЮ Директор НИИЯФ МГУ профессор М.И. Панасюк октября 2008 г. ОТЧЕТ О НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЕ ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ В ОБЛАСТИ РАЦИОНАЛЬНОГО ПРИРОДОПОЛЬЗОВАНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УНИКАЛЬНЫХ УСТАНОВОК ПОИСК ПРЕДЕЛА УСКОРЕНИЯ КОСМИЧЕСКИХ ЛУЧЕЙ В ГАЛАКТИКЕ И МОНИТОРИНГ СОСТОЯНИЯ АТМОСФЕРЫ И...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Отделение общественных наук РАН Уральское отделение Российской академии наук Институт экономики УрО РАН АНО Большой Евразийский университетский комплекс Ассоциация Евразийский экономический клуб ученых Уральский государственный экономический университет МОЛОДЕЖЬ В ОБРАЗОВАНИИ, НАУКЕ, БИЗНЕСЕ И ВЛАСТИ Материалы XIV Всероссийского экономического форума научно-исследовательских работ молодых ученых и студентов Конкурентоспособность территорий с...»

«Марк Твен. Собр. соч. в 8 томах. Том 2. //Правда, Москва, 1980 FB2: “MCat78 ” MCat78@mail.ru, 2007-01-10, version 1.2 UUID: 4A8FF85F-8B87-4F3F-8882-DDE349D36406 PDF: fb2pdf-j.20111230, 13.01.2012 Марк Твен Налегке Роман Налегке — книга воспоминаний Марка Твена о годах бродяжничества по Дальнему Западу во времена серебряной лихорадки. Марк Твен Налегке Кэлвину X. Хигби, честному человеку, веселому товарищу и верному другу, посвящает эту книгу автор в память о том удивительном времени, когда мы...»

«БИБЛИОТЕКА Северской государственной технологической академии и Северского промышленного колледжа Информационный бюллетень новых поступлений ( июнь 2008 г. ) Северск 2008 1 Содержание Наука Энциклопедии Социология Психология Этика Религия Статистика Политология Экономические науки Государство и право Социальное обеспечение Культура Филология Математика Физика Геология. Геологические и геофизические науки Инженерное дело. Техника в целом. Черчение Основы теории регулирования и управления...»

«Вестник Томского государственного университета. Биология. 2013. № 4 (24). С. 20–35 УДК 631.4 С.В. Лойко1, М.В. Бобровский2, Т.А. Новокрещенных1 Томский государственный университет (г. Томск) 1 Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН (г. Пущино) 2 ПРИЗНАКИ ВЕТРОВАЛЬНОГО МОРФОГЕНЕЗА В ФОНОВЫх ПОЧВАх ЧЕРНЕВОЙ ТАЙГИ (НА ПРИМЕРЕ ТОМЬ-яЙСКОГО МЕжДУРЕЧЬя) Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проекты № 12-04-31514-мол_а, №11-04-90780-моб_ст). Почвы и почвенный...»

«АЗА СТАН РЕСПУБЛИКАСЫ БIЛIМ Ж НЕ ЫЛЫМ МИНИСТРЛIГI МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ХАБАРШЫ 1995 жылды а тарынан жылына 6 рет шы ады (87) · 2012 №2 ВЕСТНИК выходит 6 раз в год с января 1995г. Астана Жаратылыстану жне техникалы ылымдар сериясы Серия естественнотехнических наук Жылына 3 рет шы ады Выходит 3 раза в год Бас редактор: Е.Б. Сыды ов тарих ылымдарыны докторы,профессор Бас редакторды орынбасары : Оразбаев Ж.З. техника ылымдарыны докторы Редакция ал асы: Р.I....»

«Обзор новостей образования 26-30 августа Новости образования В Москве в этом году создадут десятки внутривузовских лицеев В 2020 году власти ожидают демографический провал в первых классах Нужна новая философия образования Десять основных положений нового закона об образовании Финский язык как основной иностранный скоро станет реальностью в России Школа будущего: ТОП-10 инновационных технологий для учебы Совет по стандартам утвердил федеральный государственный стандарт дошкольного образования...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МОСКОВСКИЙ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ (ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ) РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ Московского физико-технического института (государственного университета) в 2010 году МОСКВА МФТИ 2011 Под редакцией Н.Н. Кудрявцева, Т.В. Кондранина, Е.В. Глуховой, Л.В. Ковалевой Результаты работы Московского физико-технического института (государственного университета) в 2010 году. – М.: МФТИ, 2011. – 232 с. © ГОУ ВПО Московский физико-технический...»

«Федеральное агентство по образованию Российской Федерации НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЯДЕРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ МИФИ С. Н. Борисов Пособие по физике В помощь учащимся 8-го класса Москва 2009 УДК 53(075) ББК 22.3я7 Б82 Борисов С.Н. Пособие по физике. В помощь учащимся 8-го класса. – М.: НИЯУ МИФИ, 2009. – 84 с. В настоящем пособии представлено пять тем, которые изучаются в курсе физики 8-го класса. По каждой теме представлен необходимый теоретический материал, рассмотрены примеры решения задач....»

«Федеральное агентство по образованию АССОЦИАЦИЯ КАФЕДР ФИЗИКИ ТЕХНИЧЕСКИХ ВУЗов РОССИИ Л.А. Лаушкина, Г.Э. Солохина, М.В. Черкасова Практический курс физики МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЗИКА И ТЕРМОДИНАМИКА Под редакцией проф. Г.Г. Спирина Допущено Министерством образования Российской Федерации в качестве учебного пособия для студентов высших учебных заведений, обучающихся по направлениям и специальностям в области техники и технологии Москва 2 ББК 16.4.1 Л69 Рецензенты: Кафедра физики МГТУ ГА, зав....»

«Колосова Ирина Владимировна КОГЕРЕНТНОЕ РЕНТГЕНОВСКОЕ ИЗЛУЧЕНИЕ РЕЛЯТИВИСТСКОГО ЭЛЕКТРОНА В ИСКУССТВЕННОЙ ПЕРИОДИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЕ 01.04.07 – физика конденсированного состояния Диссертации на соискания ученой степени кандидата физико – математических наук Научный руководитель : доктор физико – математических наук Носков А.В. Белгород СОДЕРЖАНИЕ...»

«Казанский (Приволжский) федеральный университет Научная библиотека им. Н.И. Лобачевского Новые поступления книг в фонд НБ с 27 апреля по 3 мая 2012 года Казань 2012 1 Записи сделаны в формате RUSMARC с использованием программы Руслан. Материал расположен в систематическом порядке по отраслям знания, внутри разделов – в алфавите авторов и заглавий. С обложкой, аннотацией и содержанием издания можно ознакомиться в электронном каталоге http://www.ksu.ru/lib/index1.php?id=6&idm=0&num=2 2 Содержание...»

«Федеральное агентство по образованию РФ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЯДЕРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ МИФИ ПОСОБИЕ ПО ГЕОМЕТРИИ Часть II. Стереометрия В помощь учащимся 10–11-х классов Москва 2009 УДК 512(076) ББК 22.143я7 Пособие по геометрии. Часть II. Стереометрия. В помощь учащимся 10–11-х классов./ О.В. Нагорнов, А.В. Баскаков, О.Б. Баскакова, Н.В. Серебрякова. – М.: НИЯУ МИФИ, 2009. – 108 с. Пособие составлено в соответствии со школьной программой углубленного изучения математики в 10–11-х классах....»

«ОТКРЫТОЕ АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО ГАЗПРОМ ОТКРЫТОЕ АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО ГАЗПРОМГЕОФИЗИКА ОТЧЕТ о производственно-хозяйственной деятельности ОАО Газпромгеофизика за 2006 год Утверждён Годовым общим собранием акционеров ОАО Газпромгеофизика протокол № 13/2007 от 1 июня 2007 г. Предварительно утвержден Советом директоров ОАО Газпромгеофизика протокол № 73 от 19 апреля 2007 г. Генеральный директор _(В.В. Илюшин) Главный бухгалтер _ (В.И. Сачук) Москва 2007 г. ОГЛАВЛЕНИЕ Глава 1. Характеристика общества...»

«Некоммерческая организация Ассоциация московских вузов Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский Государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Научно-информационный материал Серия Медико-биологический факультет РГМУ УРОВЕНЬ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО ОБРАЗОВАНИЯ В РГМУ. МЕСТО И РОЛЬ ВРАЧА-БИОФИЗИКА В СИСТЕМЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И НА РЫНКЕ ТРУДА В СОВРЕМЕННЫХ УСЛОВИЯХ Руководитель...»

«женщины мужчины FRONTESPIZIO XFORMER O D Y O P T I Sonic руководство по эксплуатации ® / EXE M I Z E R PERSONAL B 8-800-200-383-2 kudesnik54.ru - только полезные товары 3 index Введение Информация о мануальной терапии Добро пожаловать в мир XFormer/EXE Sonic.стр. 9 Противопоказания к использованию XFormer/EXE Sonic Электростимуляция История электростимуляции Об электростимуляции: основные принципы Биологическое описание мышечной системы Типы мышечных волокон Иннервация мышц Элементы...»




 
© 2014 www.kniga.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Книги, пособия, учебники, издания, публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.