WWW.KNIGA.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Книги, пособия, учебники, издания, публикации

 

WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ 2006

Исследование дисперсий фосфолипидов. 3. Экспериментальная

проверка модели дисперсии амфифилов

В.П. Топалы, Э.Е. Топалы

Институт Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН

Содержание

Аннотация

Введение

Проверка модели дисперсии амфифилов

1. Критическая концентрация мицеллообразования

2. Постулат об оптических свойствах комплексов NBD-PE/Rh-PE 3. Флуктуации флюоресценции меченой липидной дисперсии 4. Уменьшение флюоресценции 530 нм во времени 5. Уменьшение флюоресценции 577 нм во времени 6. Взаимодействие фосфолипидов с ТХ и RТХ 7. Взаимодействие фосфолипидов с DHPC 8. Смешанные липидно-детергентные и детергентнолипидные сфероид 9. Влияние ультразвука и детергента на флюоресценцию 10. Взаимодействие меченых и немеченых липидов 11. Взаимодействие меченого липида с амфифильным растворителем 12. О гомогенности липидной дисперсии 13. Квантовый выход флюоресценции донора Основные выводы Литература Abstract Принятые сокращения: POPC = пальмитоилолеоилфосфатидилхолин;

DHPC = дигептилфосфатидилхолин; NBD-PE = N-(7-нитробенз-2-oксa-1,3диазол-4-ил)диолеоилфосфатидилэтаноламин; Rh-PE = (N-(лиссамин родамин В сульфонил)диолеоилфосфатидилэтаноламин; ТХ = Тритон Х-100;

RТХ = восстановленный Тритон Х-100; SDS = додецилсульфат натрия;

CTAB = цетилтриметиламмоний бромид; ККМ = критическая концентрация мицеллообразования; РПЭ = метод резонансного переноса энергии.

Дисперсии в бидистиллированной воде Д1 = POPC 1 мМ, NBD-PE 1 мкМ, Rh-PE 1 мкМ; Д2 = POPC 100 мкМ, NBD-PE 1 мкМ, Rh-PE 1 мкМ; Д3 = POPC 10 мкМ, NBD-PE 1 мкМ, Rh-PE 1 мкМ; Д4 = NBD-PE 1 мкМ, Rh-PE мкМ; Д5 = POPC 10 мМ, NBD-PE 10 мкМ, Rh-PE 10 мкМ; Д6 = POPC 1 мМ, NBD-PE 10 мкМ, Rh-PE 10 мкМ; Д7 = POPC 100 мкМ, NBD-PE 10 мкМ, RhPE 10 мкМ и Д8 = NBD-PE 10 мкМ, Rh-PE 10 мкМ; F(ДХ) = флюоресценция WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ кюветы с дисперсией ДХ, разбавленной до 30 нМ NBD-PE и 30 нМ Rh-PE, где Х – цифра в обозначении дисперсии; F(ДX-Y) = флюоресценция кюветы, содержащей большой избыток (по сравнению с липидом) детергента Y (один из перечисленных выше, включая DHPC) с дисперсией ДХ, разбавленной до 30 нМ NBD-PE и 30 нМ Rh-PE; КВФ = квантовый выход флюоресценции;

Fmax = максимальная флюоресценция меченой липидной дисперсии.

Аннотация Изложенная ранее (Топалы, 2006) модель дисперсии амфифилов использована для интерпретации описанных в статье Топалы и Топалы (2006) свойств липидных и детергентно-липидных дисперсий. Свойства флюоресцентно меченых липидных дисперсий (уменьшение флюоресценции (F) с возрастом маточной дисперсии и во времени после внесения пробы из неё в кювету, флуктуации F, зависимость F от содержания немеченого липида в дисперсии и другие) вполне удовлетворительно объясняются в рамках предлагаемой модели и постулата, согласно которому существует два типа комплексов NBD/Rh – параллельный и антипараллельный, – первый из которых при возбуждении фотонами 470 нм излучает фотоны 577 нм, а второй не излучает. Также удовлетворительно объясняются и свойства детергентно-липидных дисперсий (зависимость F от содержания немеченого липида, изменение F с возрастом дисперсий и другие). Это позволяет заключить, что предлагаемая модель вполне пригодна для объяснения фактов и в качестве рабочей модели для планирования экспериментов с дисперсиями амфифилов. Из этой работы также следует, что в нормальных условиях основными агрегатами липидной дисперсии в воде являются липосфероиды.

Использумые в опыте дисперсии липидов являются более или менее устойчивыми неравновесными дисперсиями, отличающимися друг от друга зависящей от метода диспергирования степенью отклонения от равновесия.

Этот вывод устраняет противоречие между существующими представлениями о равновесных дисперсиях крупных и гигантских, однослойных и многослойных липосом и термодинамикой, допускающей только одну равновесную дисперсию. Сфероиды являются составной частью дисперсии детергента. Так называемая критическая концентрация мицеллообразования является концентрацией, выше которой в дисперсии образуются сфероиды.

Ключевые слова: флюоресцентные метки; липидная дисперсия;

детергенты; липосфероиды; детергентные сфероиды; смешанные детергентно-липидные сфероиды.

Введение В статье (Топалы, Топалы, 2006) мы продемонстрировали экспериментально ряд свойств водных дисперсий POPC, меченых WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ одновременно NBD-PE и Rh-PE, которые несовместимы с липосомальной идеей. В данной работе мы показываем, что эти удивительные свойства вполне естественно объясняются в рамках обобщённой модели дисперсии амфифила, описанной в статье (Топалы, 2006).

Проверка модели дисперсии амфифилов 1. Критическая концентрация мицеллобразования (ККМ). Сохраняющаяся до сих пор, но сложившаяся уже к 1980-м годам сложная ситуация в области исследования водных дисперсий фосфолипидов, в которой, как писал Д.

Ласич (Lasic, 1988), накоплено много непонятных фактов, является следствием ряда ошибок, не замеченных до сих пор. Одна из них была допущена при интерпретации результатов исследований дисперсий амфифилов, известных под общим названием детергенты. До сих пор считается, что самым крупным агрегатом, который образует в воде любое из этих соединений, является мицелла. Для каждого детергента существует некоторая концентрация (ККМ), ниже которой дисперсия якобы представляет собой истинный раствор, а при более высоких концентрациях она состоит практически из одних мицелл. Это понятие пришло из гипотезы мицеллобразования, согласно которой в дисперсии детергента протекает только реакция mА Аm. m представляет собой число молекул детергента, участвующих в одном элементарном акте реакции и одновременно число молекул детергента в мицелле. Судя по тому, что эта идея в 1979 году была опубликована в Методах энзимологии (Reynolds, 1979), она к этому времени была общепризнанной. И это удивительно, поскольку m 3 (в цитируемой статье считается, что m = 100) противоречит как теории, так и практике физической химии, доказавшей на протяжении первой половины прошлого века, что в природе не существует реакций выше 3-его порядка. Фунг и Страйер (Fung, Stryer, 1978), обнаружившие, что детергент додецилсульфат натрия (SDS) увеличивает флюоресценцию меченой липидной дисперсии, объяснили этот факт, исходя из существовавших представлений о дисперсиях детергентов, образованием смешанных детергентно-липидных мицелл. Таблица 2 из работы (Топалы, Топалы, 2006) не оставляет никаких сомнений в том, что это объяснение неверно, хотя для доказательства этого новые эксперименты не требовались (см. выше). Ставшее тем не менее общепризнанным, это ошибочное объяснение имело серьёзные последствия для дальнейшего развития представлений о липидных дисперсиях. Очень жаль, что Фунг и Страйер (Fung, Stryer, 1978) не проверили своё объяснение.





Они могли легко это сделать, поскольку работали с флюоресцентно мечеными липидами.

Предлагаемая модель (Топалы, 2006) применима к дисперсиям любых детергентов, молекулы которых имеют постулируемое строение (например, к додецилсульфату натрия или цетилтриметиламмоний бромиду). Параметр ККМ для детергентов определяют из экспериментально измеряемых кривых свойство-концентрация. На этих кривых имеется перегиб и концентрацию, WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ при которой он наблюдается, принимают за величину ККМ. Мы полагаем, что в действительности это концентрация, при которой в дисперсии начинается формирование сфероидов. Далее (п. 6, 7 и 8) мы покажем, что все наблюдаемые свойства дисперсий смесей детергентов и липидов вполне естественно объясняются в рамках этой модели.

Искусственные и природные ионные каналы широко изучаются биофизиками. Хотя теории образования ионных каналов, насколько нам известно, не существует, ясно, что эти структуры формируются молекулами амфифилов. За единственным исключением (грамицидин), ионные каналы состоят из относительно большого количества таких молекул (больше 3).

Например, амфотерициновая полупора якобы состоит из 8 молекул амфотерицина В и 8 молекул холестерола (De Kruijff, Demel, 1974). При этом подразумевается, что помимо полупор и пор в мембране существуют лишь мономерные молекулы полиена и стерола. Очевидно, это представление идентично постулату, что в мембране протекает только бимолекулярная реакция образования пор из полупор и 16-молекулярная реакция образования полупор из амфотерицина В и холестерола. Поскольку реакций выше 3-его порядка не существует, ошибочность этого постулата также очевидна, как и предположение о реакциях 100-го порядка (Reynolds, 1979). В условиях регистрации только единичных каналов в мембране существуют разнообразные комплексы амфотерицин-холестерол меньше полупор, связанные между собой реакциями типа указанных в уравнении (1) из статьи (Топалы, 2006). Очень возможно, что регистрируемые при этом флуктуации тока связаны вовсе не с постулируемыми порами, а с комплексами амфотерицин-холестерол значительно меньшего размера. При высоких концентрациях полиена, когда в мембране имеется много каналов, среди комплексов амфотерицин-холестерол могут быть значительно более крупные, чем постулируемые полупоры и поры.

Приведённые примеры показывают, насколько примитивны наши представления о природе дисперсий амфифилов или, как написал Д. Ласич (Lasic, 1988), как плохо мы понимаем механизмы явлений, наблюдаемых в опытах с амфифилами.

2. Постулат об оптических свойствах комплексов NBD-PE/Rh-PE. Для интерпретации непонятных пока фактов (Топалы, Топалы, 2006) одной модели липидной дисперсии, приведённой в (Топалы, 2006), к сожалению, недостаточно. Необходимы также определённые предположения относительно оптических свойств комплексов NBD-PE/Rh-PE. Речь, конечно, о традиционных в физико-химии комплексах, а не о “фёрстеровских”, компоненты которых не контактируют между собой (п. 2.5 в (Топалы, Топалы, 2006)), поскольку перенос энергии между донором и акцептором имеет место не по Фёрстеру (Топалы, Топалы, 2006). Прежде всего, отметим, что у флюорофоров NBD и Rh в исследованной системе не могут быть те же свойства, включая комплексообразование, что в чистом растворителе.

Флюорофоры ковалентно связаны с полярной головкой липида, поэтому у NBD-PE и Rh-PE есть все свойства липидной молекулы. Молекулы зондов WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ присутствуют в любых агрегатах, которые способны формировать липиды.

Это очень важно, потому что позволяет сузить возможные структуры комплексов, ибо эксперимент пока не может помочь нам в этом вопросе. В связи с этим мы бы отметили огромную заслугу Фунга и Страйера (Fung, Stryer, 1978), которые, насколько мы можем судить, были первыми, которые использоваkb флюоресцентно меченые липиды в изучении липидных дисперсий.

Ориентация флюорофоров друг относительно друга определяется структурой липидного агрегата, в котором они локализованы. Например, в возможном, но маловероятном комплексе NBD-PE/Rh-PE вне немеченых липидов или в глобулярной мицелле, содержащей по одной молекуле NBDPE и Rh-PE (рис. 1 в (Топалы, 2006)) они располагаются далеко друг от друга и их ассоциация маловероятна. Другое дело “плоские” поверхности дискоидных мицелл (бицелл). Весьма возможно, что флюорофоры молекул NBD-PE и Rh-PE, оказавшихся рядом, образуют между собой определённый комплекс, оптические свойства которого другие, чем у NBD-PE или Rh-PE.

То же самое возможно и в бицеллах, содержащихся в сфероидах (липосфероидах) (рис. 2 в (Топалы, 2006)). Помимо этого молекула NBD-PE из одной бицеллы может оказаться напротив молекулы Rh-PE в прилегающей бицелле и весьма вероятно, что флюорофоры этих молекул также комплексуют друг с другом. Очевидно, в этом комплексе ориентация флюорофоров NBD и Rh прямо противоположная той, что в вышеописанном комплексе. Назовём первый и второй соответственно параллельным и антипараллельным комплексами NBD/Rh. Естественно думать, что оптические свойства у этих комплексов различные. Можно предположить, что параллельный комплекс NBD/Rh поглощает также, как NBD (т.е. лучше всего фотоны 470 нм), а излучает также, как Rh (т.е. больше всего фотонов 577 нм). В отношении антипараллельного комплекса мы предположим, что он совсем не излучает фотоны 577 нм, когда дисперсия освещается фотонами 470 нм. Это может происходить либо оттого, что он не поглощает фотоны 470 нм, либо поглощает, но на внутренние перестройки расходуется так много энергии, что он либо вовсе не излучает, либо излучает очень длинноволновый фотон (большой “красный” сдвиг максимума эмиссии).

Помимо указанных комплексов возможны также параллельные и антипараллельные комплексы NBD/NBD и Rh/Rh. Но для объяснения приведённых в работе (Топалы, Топалы, 2006) фактов достаточно допущения о существовании только параллельного и антипараллельного комплексов NBD/Rh с указанными выше свойствами.

В соответствии со сделанным допущением антипараллельные комплексы NBD/Rh, находящиеся по определению только внутри липосфероидов (см. п.

2.4 в (Топалы, 2006)) не дают никакого вклада в суммарную флюоресценцию дисперсии. Но помимо этих комплексов внутри сфероидов могут быть не входящие ни в какие комплексы молекулы NBD-PE и Rh-PE, а также параллельные комплексы NBD/Rh, которые флюоресцируют при освещении фотонами 470 нм, испуская фотоны 577 нм (см. выше). Есть, однако, WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ достаточно серьёзное основание полагать, что внутри сфероидов неассоциированных молекул NBD-PE и Rh-PE практически нет.

Оно состоит в том, что NBD-PE и Rh-PE отличаются от молекул POPC существенно бльшими размерами полярных головок. Из-за этого, несмотря на малое содержание молекул зондов, они могут сильно влиять на кинетические параметры системы и на размер сфероидов. Кроме этого в процессе присоединения бицелл к сфероиду и некоторое время после этого молекулы зондов из-за их полярных головок, выступающих над головками остальных молекул, группируются в кластеры (домены). Это происходит не за счёт теплового движения (латеральной диффузии), а в основном под давлением немеченых липидов, образующих основную поверхность контакта между прилегающими бицеллами. Особенно важно, что по этой причине кластеризация NBD-PE и Rh-PE в сфероидах не зависит от их концентрации.

Потенциальная энергия системы уменьшается, когда молекулы NBD-PE и Rh-PE собираются в кластеры. При этом кластеры в каждой бицелле могут располагаться напротив немеченых липидов в прилегающей бицелле и тогда практически все флюорофоры организованы в параллельные комплексы NBD/Rh. Но возможно также, что кластер в одной бицелле располагается напротив кластера в прилегающей бицелле. В такой структуре практически все флюорофоры могут быть организованы в антипараллельные комплексы NBD/Rh. Заметим, что это самая выгодная с точки зрения термодинамики структура, так как при этом потенциальная энергия системы минимальна.

Таким образом, флюоресценция 530 нм дисперсии, освещаемой фотонами 470 нм, складывается из суммарной эмиссии всех неассоциированных в комплексы молекул NBD-PE на поверхности всех сфероидов, в мономерных бицеллах и во всех недискоидных липидных агрегатах, содержащихся в дисперсии. Флюоресценция 577 нм такой дисперсии складывается из суммарной эмиссии всех параллельных комплексов NBD/Rh в мономерных бицеллах, на поверхности и внутри всех сфероидов.

Отметим, что сформулированный постулат не вполне самостоятельный, а существенным образом связан с моделью липидной дисперсии. В одноламеллярной липосоме, например, очень мало оснований предполагать существование каких-либо кластеров (очень низки концентрации NBD-PE и Rh-PE в лисперсии) и нет никаких оснований для существования антипараллельных комплексов, которые обсуждались ранее.

Далее мы показываем, что изложенная в (Топалы, 2006) модель дисперсии амфифилов в сочетании с этим постулатом позволяет качественно понять все интересные и непонятные пока факты, приведённые в работе (Топалы, Топалы, 2006). Попутно мы будем продолжать изучение свойств модели дисперсии.

3. Флуктуации флюоресценции меченой липидной дисперсии (рис. 1А, 2, 3А, 4А, 5А, 6А, 7А в (Топалы, Топалы, 2006)). Принимая, что при равновесии липиды дисперсии сосредоточены главным образом в сфероидах и мономерных бицеллах, заключаем, что флюоресценция 530 нм дисперсии определяется в основном суммарной поверхностью этих агрегатов. Число WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ липидных молекул в сфероиде с диаметром 2000 (примерно 20 слоёв бицелл или даже 30, учитывая большую вероятность того, что липиды в бицеллах интердигитированы) значительно больше, чем в одноламеллярной липосоме такого размера. Следовательно, сфероид может содержать в среднем 106 молекул, а в освещаемой зоне кюветы может быть сфероидов. Это число очень велико, поэтому колебание числа сфероидов в освещаемой зоне не может быть причиной флуктуаций флюоресценции (п.

2.1 в (Топалы, Топалы, 2006)).

Согласно предлагаемой модели, одной из самых быстрых реакций в дисперсии амфифилов, содержащей сфероиды (п. 3.5 в (Топалы, 2006)), является присоединение бицелл к сфероидам, а самой медленной диссоциация сфероидов. По этой причине концентрация мономерных бицелл в дисперсии крайне низка. В самых крупных липобицеллах могут содержаться сотни тысяч и даже миллионы липидных молекул. Молекул каждого из меченых липидов (NBD-PE и Rh-PE) в одной такой бицелле соответственно в 1000 раз меньше, т.е. сотни, или тысячи (см. составы дисперсий Д1-Д8 в (Топалы, Топалы, 2006)). Когда одна такая бицелла присоединяется к сфероиду, суммарная флюоресценция дисперсии уменьшается примерно на половину флюоресценции этой бицеллы. Если, напротив, бицелла отщепляется от сфероида, суммарный сигнал возрастает на эту величину. Число мономерных бицелл в освещаемой зоне кюветы может быть незначительным, вследствие чего оно может заметно колебаться.

Флюоресценция отдельной мономерной бицеллы в среднем вдвое выше, чем у сфероида, содержащего такую же бицеллу в качестве поверхностной. И поскольку суммарное число сфероидов и мономерных бицелл в освещаемой зоне кюветы составляет 109 (см. выше), колебания суммарного числа бицелл в дисперсии можно исключить в качестве причины флуктуации флюоресценции. Однако в равновесной модельной дисперсии концентрации самых крупных мономерных бицелл (Аm, Аm-1 и т.д.), а также сфероидов с этими бицеллами в качестве поверхностных могут быть на порядки величины меньше суммарных концентраций мономерных бицелл и соответственно сфероидов. Суммарное число таких бицелл и сфероидов в освещаемой зоне кюветы вполне может быть порядка 1000 или даже меньше.

Вместе с тем их вклад в суммарную флюоресценцию, также как и в общую массу липидов дисперсии, может быть значительным. Таким образом, флуктуации флюоресценции можно объяснить колебаниями суммарной концентрации самых крупных мономерных бицелл и сфероидов, содержащих такие бицеллы. Эти колебания могут быть связаны как с реакциями бицелла/сфероид в освещаемой зоне кюветы, так и с перемешиванием.

Альтернативным объяснением флуктуации флюоресценции может быть неравновесность дисперсий. По многим признакам (см. далее, а также таблицу 1 в Топалы, Топалы, 2006) дисперсия действительно неравновесна, так что флуктуации флюоресценции по этой причине не противоречат модели. Вполне возможно, что флуктуации обусловлены аномально крупными бицеллами. Такие бицеллы вполне могут образоваться при WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ получении дисперсии на стадии удаления эфира (см. Методы в (Топалы, Топалы, 2006)), когда разрушаются липидные монослои на границах капель воды в эфире. Ввиду их гибкости и способности скручиваться в “свитки” такие бицеллы при экструзии претерпевают незначительные изменения. Изза аномального размера они могут долгое время сохраняться в дисперсии, так как плохо связываются со сфероидами, средний размер которых многократно меньше. Вклад каждой такой бицеллы в суммарную флюоресценцию дисперсии может быть вполне заметен. Если сделать вполне естественное допущение, что таких бицелл мало, то их число в освещаемой зоне кюветы флуктуирует, что и может объяснить флуктуации флюоресценции. Иногда (очень редко) удаётся наблюдать и очень значительные относительно медленные колебания флюоресценции. Их можно приписать частичному присоединению особо крупных аномальных бицелл к сфероидам и последующему их отщеплению.

В рамках липосомальной идеи флуктуации флюоресценции можно объяснить существованием в дисперсии аномально крупных липосом.

Трудно, однако, представить, что подобные липосомы (их диаметр должен многократно превышать 2000, а их гибкость значительно меньше, чем у бицелл) могут сохраниться в дисперсии, пропускаемой через поры с диаметром 2000 (экструзии).

4. Уменьшение флюоресценции 530 нм во времени (рис. 1А, 3А, 4А, 5А, 6А в (Топалы, Топалы, 2006)). Таблица 1 в (Топалы, Топалы, 2006) однозначно свидетельствует, что получаемые маточные дисперсии в течение продолжительного периода времени остаются нестационарными, а происходящие в них реакции являются очень медленными. Мы полагаем, что это обусловлено очень малой скоростью диссоциации липосфероидов.

Именно по этой причине, на наш взгляд, получаемые разными способами липидные дисперсии отличаются друг от друга (“малые”, “крупные”, “гигантские” и т. п. “одноламеллярные липосомы”, “многослойные липосомы”), а не одинаковы, как предсказывает равновесная термодинамика.

Из-за очень малой скорости достижения равновесия каждая из этих дисперсий, за исключением “малых одноламеллярных липосом” (Larrabee, 1979; Lichtenberg, 1981; Lentz, 1987), ведёт себя в чём-то как равновесная. На самом деле равновесие в них, по-видимому, всегда отсутствует, во всяком случае при экспериментах с ними. Почти во всех опытах маточные дисперсии разбавляют, т.е. меняют концентрацию липидов. Иногда в экспериментах меняют другие существенные условия (например, температуру в микрокалориметрических исследованиях). Изменение любых условий либо непосредственно перед началом опыта, либо в процессе опыта неизбежно нарушает равновесие, которое, возможно, успело установиться в маточной дисперсии или, допустим, в кювете. Поскольку в дисперсии любого амфифила одновременно протекают многочисленные реакции с самыми разнообразными кинетиками (пп. 2 и 5 в (Топалы, 2006)), нет ничего удивительного в том, что эффекты некоторых из реакций обнаруживаются в процессе записи флюоресценции. Таким образом, вопрос лишь в том, чтобы WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ понять с какими именно реакциями связано наблюдаемое в опыте снижение флюоресценции во времени (рис. 1А, 3А, 4А, 5А, 6А в (Топалы, Топалы, 2006)).

Предположим сначала, что маточная дисперсия, из которой берётся проба для внесения в кювету, является стационарной. При её разбавлении (это происходит, когда вносится отобранная из неё проба в кювету) имеет место резкое уменьшение концентраций всех компонентов дисперсии (п. 5 в (Топалы, Топалы, 2006)). Например, во всех описанных опытах вносится 4. либо 45 мкл маточной дисперсии в 1.5 мл среды, т.е. имеет место её разбавление соответственно примерно в 300 и в 30 раз. В результате все реакции 1 и 12 (Топалы, 2006) в кювете сдвигаются влево, причём эта ситуация сохраняется вплоть до установления нового равновесия.

Попробуем понять, как это отразится на флюоресценции дисперсии, если она устроена в соответствии с предлагаемой моделью и выполняется постулат об оптических свойствах комплексов NBD/Rh (п. 2).

Важнейшим параметром дисперсии является номинальная концентрация амфифила [А]n. Чем выше [А]n, тем больше средний размер сфероидов в равновесной липидной дисперсии (п. 5 в (Топалы, 2006)). Для выбранных липида (или смеси липидов), среды и температуры средний размер липосфероидов однозначно определяется значением [А]n. Для фосфолипидов можно принять без опасения ошибиться, что во всём доступном для измерений диапазоне значений [А]n практически все липиды локализованы в сфероидах и мономерных бицеллах. Тогда в соответствии с принятым постулатом флюоресценция 530 нм дисперсии, освещаемой фотонами нм, определяется практически полностью суммарной площадью поверхности всех сфероидов и мономерных бицелл, содержащихся в освещаемой зоне дисперсии в кювете. При разведении маточной дисперсии в кювете неизбежно возрастает содержание мономерных бицелл из-за диссоциации сфероидов, а их средний размер, также как и размер сфероидов, уменьшается. Этот процесс начинается с диссоциации самых мелких поверхностных бицелл, которые слабее всего сцеплены со сфероидами.

Одновременно из всех поверхностных бицелл сфероидов, а также из всех мономерных бицелл освобождаются мономеры липида (А) по прямым реакциям 2 и 3 (Топалы, 2006). Постепенно поверхностные бицеллы отщепляются от всё более и более крупных сфероидов пока в дисперсии не устанавливается равновесие, характеристики которого соответствуют значению [А]n в кювете. Средний размер мономерных бицелл и сфероидов меньше, а доля липидов в мономерных бицеллах выше и в сфероидах ниже, чем в момент внесения пробы. Если доля липидов в мономерных бицеллах пренебрежима, то после установления равновесия суммарная площадь поверхности сфероидов больше, чем в момент внесения пробы, поскольку она возрастает с уменьшением размера сфероидов. Можно показать, что суммарная площадь поверхности сфероидов и мономерных бицелл всегда увеличивается после внесения липидов и в том случае, если долей липида в бицеллах нельзя пренебречь. Следовательно, в условиях возбуждения донора WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ его флюоресценция после установления равновесия в кювете выше, чем в момент внесения пробы. Если равновесие устанавливается быстро, то роста флюоресценции можно и не заметить, тем более, что для размешивания внесённой пробы требуется определённое время. Если же процесс установления равновесия медленный, то после размешивания должен наблюдаться рост флюоресценции во времени. Напоминаем, что так должно происходить согласно предлагаемой модели дисперсии амфифилов при условии, что в кювету вносится проба равновесной липидной дисперсии.

Если маточная дисперсия, из которой берётся проба для внесения в кювету, является неравновесной, ситуация несравненно сложнее. Отклонение от стационарности может быть как в одну, так и в другую сторону. Это значит, что средние размеры мономерных бицелл и сфероидов маточной дисперсии могут быть как больше, так и меньше равновесных значений.

Поскольку мы не знаем деталей механизма диспергирования липидов в использованных реальных условиях, выбор между этими возможностями весьма не прост. По этой причине мы рассмотрим оба варианта.

Предположим сначала, что в маточной дисперсии размеры агрегатов больше равновесных значений. Очевидно, после внесения пробы такой дисперсии в кювету отклонение от равновесия остаётся таким же по знаку, что и в маточной дисперсии. Количественно, однако, отклонение увеличивается, ибо для номинальной концентрации липида в кювете равновесные значения средних размеров бицелл и сфероидов меньше, чем для маточной дисперсии. Очевидно, при движении к равновесию в кювете происходят те же события, которые описаны выше для равновесной дисперсии липида. Это значит, что если равновесие достигается медленно, должно наблюдаться увеличение флюоресценции 530 нм во времени.

Пусть теперь в неравновесной маточной дисперсии средние размеры липидных агрегатов меньше равновесных значений. В кювете, куда мы вносим небольшой объём этой дисперсии, возможно два сценария событий.

Поскольку [А]n в кювете значительно меньше, чем в маточной дисперсии, средние размеры вносимых мономерных бицелл и сфероидов могут оказаться как больше, так и меньше соответствующих равновесных размеров при этой концентрации. Если размеры больше, то в кювете все реакции 1 и (Топалы, 2006) оказываются сдвинутыми влево до установления нового равновесия, как и в рассмотренных уже случаях. В процессе достижения равновесия бицеллы и сфероиды уменьшаются и мы должны наблюдать такое же изменение флюоресценции во времени, как и при внесении в кювету пробы из равновесной маточной дисперсии, т.е. рост (см. выше). Если же размеры вносимых липидных агрегатов меньше их равновесных размеров при [А]n в кювете, то все реакции 1 и 12 (Топалы, 2006) не могут быть сдвинуты влево с самого начала до установления равновесия. В противном случае равновесные размеры липидных агрегатов, которые больше, чем у внесённых в кювету, не могут быть достигнуты. Ясно, что поначалу все реакции 12 сдвинуты влево, поскольку концентрации мономерных бицелл и сфероидов уменьшаются в одинаковой степени при внесении пробы в WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ кювету. Поэтому скорость диссоциации сфероидов любого размера уменьшается, скажем, в 300 раз, а скорость их образования в (300)2 раз, т.е. в момент внесения пробы отношение скоростей образования и диссоциации сфероидов в кювете оказывается в 300 раз меньше, чем в маточной дисперсии. Это, конечно, не значит, что все сфероиды распадаются, поскольку реакции их диссоциации являются самыми медленными в системе (п. 5 в (Топалы, 2006)). Тем не менее суммарная концентрация мономерных бицелл в кювете из-за сдвига реакций 12 влево на первых порах увеличивается, причём в основном за счёт самых мелких бицелл, сцепление которых со сфероидами наиболее слабое. Происходит уменьшение средних размеров сфероидов. Суммарная поверхность мономерных бицелл и сфероидов растёт, так что эти процессы сопровождаются увеличением флюоресценции 530 нм. Одновременно с реакциями 12 сдвигаются влево и реакции 1, однако не обязательно все. Вспомним, что в маточной дисперсии равновесные размеры не достигнуты. В ней размеры мономерных бицелл и сфероидов увеличиваются. Это возможно только в результате того, что липид переходит из самых мелких бицелл и сфероидов в самые крупные.

Процессы, которые приводят к такому результату, подробно описаны в п. работы (Топалы, 2006). Вполне возможно, что и после разбавления дисперсии самые крупные мономерные бицеллы не теряют способность связывать мономеры А даже на короткое время. Это зависит от степени разбавления. При достаточно большом разведении маточной дисперсии и в рассматриваемом случае поначалу все реакции 1 также сдвинуты влево.

Однако это имеет место на непродолжительное время, поскольку прямые реакции 3 – самые быстрые в системе – быстро увеличивают концентрацию мономеров А. Из-за этих реакций наибольшие изменения претерпевают самые мелкие мономерные бицеллы и поверхностные бицеллы самых мелких сфероидов. С повышением [А] часть реакций 1 меняет своё направление.

Сначала это происходит для самой крупной мономерной бицеллы дисперсии, а затем постепенно для более и более мелких. Образующиеся бицеллы связываются со сфероидами, увеличивая уже их размеры. Этот процесс продолжается вплоть до установления равновесия и поскольку номинальная концентрация липидов в дисперсии не меняется, он сопровождается уменьшением суммарной поверхности мономерных бицелл и сфероидов.

Следовательно, флюоресценция 530 нм дисперсии уменьшается во времени.

Таким образом, в рассматриваемом варианте флюоресценция 530 нм после внесения пробы маточной дисперсии в кювету некоторое время возрастает, а затем уменьшается. Фаза возрастания флюоресценции может быть очень короткой и её можно не заметить. С другой стороны, уменьшение флюоресценции может быть настолько медленным или, напротив, быстрым, что его тоже можно не заметить. Это зависит от кинетических параметров дисперсии. В наших опытах (рис. 1А, 3А, 4А, 5А, 6А в (Топалы, Топалы, 2006)) уменьшение флюоресценции во времени хорошо видно. Интересно, однако, что по мере старения дисперсии скорость относительного уменьшения становится всё меньше и меньше. При этом начальное и среднее WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ за время записи значение флюоресценции также уменьшаются, что отражается в данных таблицы 1 (Топалы, Топалы, 2006). Всё это вполне объяснимо в рамках обсуждаемой модели дисперсии. По мере увеличения среднего размера мономерных бицелл и сфероидов увеличивается и размер самых мелких сфероидов. Скорость диссоциации этих агрегатов является лимитирующей стадией в динамике достижения равновесия. Поэтому относительные изменения в дисперсии становятся всё меньше и меньше по мере старения дисперсии и, соответственно, их труднее обнаружить в эксперименте. Равновесие не устанавливается, по-видимому, очень долго.

Это следует из того, что уменьшение флюоресценции наблюдается и через месяцы хранения дисперсии при температуре 25 °, т.е. за это время размеры агрегатов не достигают даже размеров, характерных для равновесия в кювете, которые значительно меньше, чем для маточной дисперсии. Очень важно, что рост агрегатов во времени регистрируется и другим совершенно независимым методом. Ведь после экструзии маточной дисперсии размер агрегатов может быть и больше равновесного. Эту возможность, однако, можно исключить на основании того, что при экструзии дисперсии через поры с размером 500 размер агрегатов почти такой же, как и при экструзии через поры с размером 2000 (п. 2.1 в (Топалы, Топалы, 2006)). Это можно объяснить тем, что агрегаты с размером около 500 быстро увеличиваются из-за того, что равновесный размер значительно больше, а получаемые при экструзии сфероиды относительно неустойчивы. Нет оснований думать, что в экструдированной через поры 2000 дисперсии размеры агрегатов больше равновесного значения, ибо в неэкструдированной дисперсии агрегаты крупнее. Поскольку согласно предлагаемой модели дисперсии амфифилов относительное увеличение среднего размера агрегатов тем больше, чем они мельче (см. выше), модель хорошо согласуется с результатами измерения размеров (п. 2.1 в (Топалы, Топалы, 2006)) агрегатов и флюоресценции дисперсии (таблица 1 и рис. 1А, 3А, 4А, 5А, 6А в (Топалы, Топалы, 2006)).

Уменьшение флюоресценции 530 нм достоверно регистрируется только в случае дисперсии Д1, причём и в этом случае оно становится всё менее выраженным по мере увеличения возраста маточной дисперсии. Мы полагаем, что это связано с влиянием NBD-PE и Rh-PE на устойчивость липосфероидов. Чем выше содержание красителей, тем они устойчивее из-за того, что связи, ответственные за образование антипараллельных комплексов NBD-PE/Rh-PE прочнее, чем ионные связи между молекулами РОРС.

5. Уменьшение флюоресценции 570 нм во времени (рис. 11 в (Топалы, Топалы, 2006)). Что касается флюоресценции 577 нм у обсуждаемой дисперсии, освещаемой фотонами 470 нм, то природа её уменьшения во времени несколько сложнее. Вспомним, каким образом происходит рост среднего размера сфероидов дисперсии в кювете после внесения туда пробы неравновесной маточной дисперсии.

Из изложенного выше следует, что у получаемой в кювете в результате этого дисперсии состояние оказывается также неравновесным, хотя и ближе от равновесия, чем у последней. Практически весь липид дисперсии WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ локализован в сфероидах. Самыми неустойчивыми являются сфероиды с самыми мелкими бицеллами в верхнем слое (Топалы, 2006). Именно эти бицеллы деградируют в первую очередь и отщепляются от сфероидов.

Освобождаемые из мономерных бицелл и поверхностных бицелл сфероидов по прямым реакциям 3 (Топалы, 2006) мономеры липида связываются самыми крупными мономерными бицеллами. Эти бицеллы частично присоединяются к сфероидам, а частично превращаются в более крупные. В результате этого процесса липиды из самых мелких наименее устойчивых сфероидов переходят в самые крупные более устойчивые. Средний размер сфероидов увеличивается. При связывании бицеллы со сфероидом происходит кластеризация NBD-PE и Rh-PE между контактирующими поверхностями присоединяемой бицеллы и сфероида. Большинство образующихся кластеров на каждой поверхности располагаются поначалу против немеченых липидов в прилегающей бицелле и состоят из одних параллельных комплексов NBD-PE/Rh-PE, которые, согласно постулату (см.

п. 2), испускают фотоны 577 нм при освещении дисперсии фотонами 470 нм.

В дальнейшем, однако, часть кластеров на прилегающих поверхностях под давлением немеченых липидов, образующих основную поверхность контакта между этими поверхностями, оказываются друг против друга (это более выгодное с точки зрения минимума потенциальной энергии системы структура). Образуются антипараллельные комплексы NBD-PE/Rh-PE, которые, согласно постулату, не флюоресцируют. Это происходит между поверхностными слоями бицелл во всех сфероидах дисперсии. Поэтому уменьшение флуоресценции 577 нм существенно и оно регистрируется в опыте (рис. 11 в (Топалы, Топалы, 2006)).

Флуктуации флюоресценции 577 нм у дисперсии, освещаемой фотонами 470 нм, объясняется точно также, как и флуктуации флюоресценции 530 нм.

Число самых крупных бицелл в дисперсии невелико, а их вклад как в ту, так и в другую флюоресценцию значителен. Поэтому число этих бицелл в освещаемой зоне кюветы, а следовательно, и флюоресценция, связанная с NBD-PE и параллельными комплексами NBD-PE/Rh-PE, колеблется.

Хотя причина уменьшения флюоресценции 530 нм и 577 нм во времени в условиях постоянного освещения дисперсии фотонами 470 нм одна (рост среднего размера сфероидов), конкретные механизмы у этих двух явлений различны. Поэтому нет ничего удивительного в том, что флюоресценции нм и 577 нм меняются непропорционально при изменении содержания немеченого липида в дисперсии (таблица 3 в (Топалы, Топалы, 2006)).

Любопытно сравнить флюоресценции 530 нм и 577 нм дисперсий, освещаемых фотонами 470 нм (таблица 3 в (Топалы, Топалы, 2006)). Можно отметить, что у дисперсий Д4 и Д8 флюоресценция 577 нм самая низкая, причём она существенно ниже флюоресценции 530 нм у этих дисперсий.

Поскольку в сфероидах дисперсий Д4 и Д8 вероятность антипараллельных комплексов NBD-PE/Rh-PE самая высокая, этот факт можно считать свидетельством в пользу реалистичности постулата об оптических свойствах комплексов NBD-PE/Rh-PЕ (п. 2). С другой стороны, этот факт показывает, WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ что липиды дисперсии при весьма низких номинальных концентрациях (в опытах с Д4 и Д8 в кювете по 60 нМ липидов) практически целиком сосредоточены в сфероидах, причём не только в водной среде, но и в метаноле (таблица 2 в (Топалы, Топалы, 2006)).

6. Взаимодействие фосфолипидов с ТХ и RТХ. Неравновесное состояние системы детергент/липид в течение продолжительного времени (п. 2.3, рис.

10, таблица 2 в (Топалы, Топалы, 2006)) можно объяснить и в рамках существующего представления о растворах детергентов, согласно которому ниже ККМ дисперсия детергента представляет собой истинный раствор, а при более высоких концентрациях раствор мицелл. Однако для этого необходимо допустить, что мицеллы очень медленно реагируют с липидом.

Для этого достаточно естественного предположения, что они могут включать в себя только отдельные молекулы липида, которых в дисперсии очень мало.

Если липидная дисперсия устроена в соответствии с предлагаемой моделью (Топалы, 2006), то такое взаимодействие мицелл с липидом лимитируется скоростью отщепления бицелл от липосфероидов, которая может быть очень низкой. Однако в таком варианте остаётся непонятным наблюдаемое сразу после внесения детергента в одних случаях быстрое (скачкообразное) увеличение флюоресценции (рис. 1Б, 4А, 4Б, 4В, 5Б, 6Б, 7А, 7Б в (Топалы, Топалы, 2006)), в других быстрое уменьшение (рис. 5А, 8А в (Топалы, Топалы, 2006)), в третьих медленное снижение (рис. 6А (Топалы, Топалы, 2006)). В рассматриваемом допущении с любым детергентом должно наблюдаться одинаковое медленное увеличение флюоресценции или постоянное значение без каких-либо скачков.

Все обсуждаемые факты можно на качественном уровне понять, если принять, что дисперсия детергента устроена также, как и липидная (Топалы, 2006). Поскольку структура молекул всех исследованных детергентов такая же, как и у молекул обычных фосфолипидов, мы полагаем, что предлагаемая модель в полной мере приложима и к дисперсиям этих детергентов. В любой из них, как и в случае липидной дисперсии, присутствуют мономеры молекул детергента и разнообразные комбинации этих мономеров от димеров до сфероидов. Разумеется, это относится к качественному составу дисперсий.

Что же касается количественного распределения амфифила между различными типами агрегатов, то оно индивидуально для каждого амфифила.

Для некоторого значения номинальной концентрации, среды и температуры средний размер бицелл и сфероидов у любого детергента меньше, чем у фосфолипидов. В растворах детергентов равновесное состояние достигается несравненно быстрее, чем в липидных дисперсиях.

Когда один набор таких агрегатов (липид) смешивается со вторым подобным набором (детергент), то количество реакций 1 и 12 (Топалы, 2006) резко возрастает, поскольку теперь в любой бимолекулярной реакции участвуют не только липидные либо детергентные комплексы, но и любое сочетание мономеров и комплексов липида и детергента. Тем не менее ясно, что главную роль в быстрых изменениях, происходящих после смешения липида и детергента играют реакции присоединения бицелл к сфероидам, WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ ибо эти реакции самые быстрые в системе, а в этих агрегатах содержится основная доля липида. Результатом этой реакции является образование сфероидов, содержащих как липидные, так и детергентные бицеллы. Ясно, однако, что смешивание при этом не может быть значительным, поскольку в реакциях участвуют мономерные липидные и детергентные бицеллы и лишь очень малая доля связанных в сфероиды бицелл. Реакция отщепления бицелл от сфероидов самая медленная в системе и за короткое время скачкообразного изменения флюоресценции из сфероидов поступает мало бицелл. Следует отметить, однако, что это количество может быть вполне сравнимо или даже превосходить число исходно мономерных. Детергентых мономерных бицелл в системе может быть больше, чем липидных, но поскольку NBD-PE и Rh-PE находятся только в последних, именно они и определяют изменение флюоресценции дисперсии, которое мы обсуждаем.

Присоединение детергентной бицеллы к липидному сфероиду, очевидно, не влияет на флюоресценцию. Ясно также, что основная масса NBD-PE и Rh-PE остаётся в исходных липидных сфероидах, но после реакции с детергентом самые верхние слои бицелл в них состоят из детергента. Исходные детергентные сфероиды также претерпевают сравнительно небольшие изменения из-за того, что мономерных и отщепляющихся от сфероидов липидных бицелл относительно мало даже, возможно, по сравнению с количеством детергентнтных бицелл. Лишь очень немного верхних слоёв в этих сфероидах может быть занято липидными бицеллами. Какую-то роль в реакциях детергента с липидом играет, по-видимому, и взаимодействие мономерных детергентных и липидных бицелл, но их роль значительно меньше по сравнению с реакциями бицелл со сфероидами из-за малой устойчивости стопок из бицелл (п. 3.4, рис. 2 в (Топалы, 2006)).

Если липидная дисперсия состоит только из NBD-PE и Rh-PE, то описанные выше события приводят к быстрому росту флюоресценции со всеми исследованными детергентами (рис. 4В, 5Б, 6Б, 7Б в (Топалы, Топалы, 2006)), за исключением одного. Лишь при внесении SDS в кювету с Д8 (рис.

8Б) скачкообразный рост не наблюдается. Чтобы понять, почему в случае дисперсий, содержащих POPC, с одними детергентами мы наблюдаем быстрый рост (рис. 1Б, 4А, 7А в (Топалы, Топалы, 2006)), с другими быстрое уменьшение (рис. 5А, 6А в (Топалы, Топалы, 2006)), а с третьими только медленное уменьшение (рис. 6А, 8А) флюоресценции, необходимо обратиться к формулам молекул детергентов. Удобнее всего для обсуждения ТХ и RТХ, в структуре молекул которых различия минимальны, а изменения флюоресценции липидной дисперсии при их добавлении имеют противоположный знак (ср. рис. 1А и 1Б, 5А и 5Б в (Топалы, Топалы, 2006)).

Молекула TX имеет структуру (H3C–C(CH3)2–C(CH3)2–C6H4–O–(CH2– CH2–O)n–CH2–CH2–OH, n = 8.5). Она состоит из изооктанового участка H3C– C(CH3)2–C(CH3)2– с присоединённым бензолом (–C6H4–), которые вместе составляют исключительно гидрофобную зону с длиной, эквивалентной примерно 7-углеродной линейной цепи, и относительно гидрофильного полиэтоксиэтанольного линейного участка –O–(CH2–CH2–O)n–CH2–CH2–OH WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ с длиной, эквивалентной примерно 30-углеродной линейной цепи. Эти молекулы в воде также образуют димеры, тримеры и т.д. до глобулярной мицеллы и, по-видимому, далее бицеллы и сфероиды. Необходимо заметить, однако, что гидрофильность полиэтоксиэтанольного участка молекулы TX относительно низка и эта зона бицеллы может растворить значительное количество гидрофобных остатков фосфолипидов. Достаточно вспомнить, что последние неплохо растворяются в этиловом эфире (см. методику приготовления липидных дисперсий в воде (Топалы, Топалы, 2006)).

Особенностью сфероидов из этих бицелл является, по-видимому, полное взаимное проникновение полярных участков прилегающих друг к другу поверхностей бицелл (интердигитация) вследствие того, что “толщина” у гидрофобной цепи примерно вдвое больше, чем у гидрофильной, и малое количество молекул воды в их гидрофильных слоях.

Молекула RTX содержит циклогексановое кольцо (–C6H10–) вместо бензольного (–C6H4–) в TX. Это единственное различие между молекулами существенным образом влияет на средние размеры агрегатов в растворах этих двух детергентов. У RTX этот размер меньше, чем у TX из-за того, что энергия взаимодействия (притяжения) между циклогексановыми остатками з меньше, чем между бензольными остатками. Нет никаких данных, чтобы определить эту разницу количественно. Можно утверждать лишь, что при одинаковых номинальных концентрациях средний размер у бицелл из ТХ больше, чем у бицелл из RТХ. Как те, так и другие могут формировать сфероиды, причём ТХ крупнее, чем RТХ. И тех и других молекул в обоих случаях в составе сфероидов может быть немного, но в случае ТХ больше, чем в случае RТХ. Можно предположить также, что ТХ образует сфероиды, а RТХ не образует. Это предположение, однако, можно исключить, ибо в отсутствие сфероидов становится необъяснимым быстрый (скачкообразный) рост флюоресценции при внесении RTX в дисперсию. Флюоресценция в таком варианте может лишь медленно возрастать во времени или оставаться неизменной (см. выше). Таким образом, круг возможных допущений сужается.

Прежде, чем продолжать, посмотрим, какая связь существует между присоединением липидной бицеллы к детергентному сфероиду и величиной флюоресценции. Очевидно, присоединение исходно мономерных липидных бицелл (т.е. не отщепившихся от липосфероидов после внесения детергента) не влияет на флюоресценцию дисперсии пока они размещаются в один слой на всей поверхности детергентных сфероидов. Если же этой поверхности не хватает, то начинается заполнение второго слоя липидных бицелл на детергентных сфероидах, что сопровождается, очевидно, уменьшением флюоресценции дисперсии. Из этого следует очень важный вывод о том, что в изменении флюоресценции при внесении детергента участвуют и отщепляющиеся от липидных сфероидов бицеллы, а не только находившиеся до этого в мономерном виде. Допущение об участии в этом процессе только исходно мономерных бицелл вполне законно, поскольку бицеллы отщепляются от сфероидов медленно, а изменение флюоресценции WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ происходит быстро. Поэтому можно было бы предположить, что поверхности сфероидов RТХ хватает для размещения исходно мономерных липидных бицелл в один слой, а поверхности сфероидов ТХ, которая меньше, не хватает. Поэтому на последних некоторая часть присоединённых бицелл попала во второй слой и флюоресценция уменьшилась. Вариант с участием только исходно мономерных липидных бицелл в наблюдаемых изменениях флюоресценции мы можем, однако, с уверенностью исключить, потому что в этом случае RТХ, вопреки опыту, не влиял бы на флюоресценцию. Вариант, что ни на сфероидах ТХ, ни на сфероидах RТХ не хватает поверхности для размещения исходно мономерных липобицелл мы тоже можем исключить, потому что в этом случае флюоресценция уменьшалась бы, хотя и в меньшей мере, и после внесения RТХ в кювету.

Итак, флюоресценция может меняться скачкообразно и в противоположных направлениях с ТХ и RТХ лишь за счёт реакции последних с мономерными липидными бицеллами, но не только исходных, а и тех, которые отщепились от липосфероидов после внесения детергента.

Поскольку как с ТХ, так и с RТХ изменение флюоресценции происходит скачкообразно, т.е. за одинаковый короткий отрезок времени, естественно предположить, что суммарное число реагирующих мономерных липидных бицелл в обоих случаях одинаково. Быстро эти бицеллы могут взаимодействовать с мономерными бицеллами и со сфероидами ТХ и RТХ.

Это позволяет сделать попытку оценить долю молекул этих детергентов в указанных агрегатах. Сразу можно исключить, что растворы ТХ и RТХ при концентрации 4.3 мМ совершенно не содержат сфероидов. Дисперсия детергента без сфероидов описана в п. 3 (Топалы, 2006). Из-за особенностей молекул ТХ и RТХ, описанных выше, средний размер бицелл, доля молекул дисперсии в них и суммарная поверхность бицелл в случае ТХ больше, чем в случае RТХ. Следовательно, если бы дисперсии ТХ и RТХ не содержали сфероидов, то при их внесении в дисперсию меченого липида флюоресценция менялась бы совсем не так, как наблюдается в опыте. Она либо возрастала бы в обоих случаях, причём одинаково, либо возрастала бы в случае внесения ТХ и уменьшалась бы в случае RТХ из-за недостаточной суммарной поверхности бицелл. Также можно исключить, что дисперсии ТХ и RТХ состоят практически из одних сфероидов. Действительно, сделаем естественное предположение, что средние размеры мономерных бицелл и сфероидов любого из детергентов не больше, чем у этих агрегатов, образуемых липидом. Нетрудно убедиться, что суммарная поверхность детергентных сфероидов настолько велика, что на ней может разместиться одним слоем на порядки величины больше липидных мономерных бицелл, чем их может быть в липидной дисперсии. Следовательно, если бы дисперсии ТХ и RТХ состояли бы практически из одних сфероидов, флюоресценция меченой липидной дисперсии возрастала бы при внесении любого из детергентов, причём одинаково.

Единственная возможность, на наш взгляд, понять, почему тем не менее флюоресценция уменьшается при реакции липидных бицелл с ТХ и WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ увеличивается при их взаимодействии с таким же молярным количеством RТХ состоит в том, что растворы каждого из детергентов содержат сфероиды, но в первом случае суммарная поверхность сфероидов меньше, чем во втором. Если доля каждого из детергентов в сфероидах мала (порядка 1 %), то средний размер сфероидов и доля молекул дисперсии в них в случае ТХ больше, чем в случае RТХ (см. выше). При этом, однако, суммарная поверхность сфероидов в случае RТХ заметно больше, чем для ТХ при условии, что средние размеры сфероидов отличаются примерно на 400.

Поэтому присоединяемые липидные бицеллы образуют больше поверхностных слоёв на сфероидах из ТХ, чем на сфероидах из RТХ. В результате суммарная поверхность флюоресцирующих агрегатов в дисперсии с ТХ оказывается меньше, а в дисперсии с RТХ больше, чем до внесения детергентов. Проще всего это понять, допустив что отщепляющихся от липидных сфероидов бицелл (пока на них образуется первый слой детергентных бицелл) и исходных мономерных липидных бицелл ровно столько, чтобы образовать один слой липидных бицелл на поверхности сфероидов RTX. Очевидно, что этот процесс приводит к увеличению флюоресценции дисперсии, поскольку отщепляющиеся от липосфероидов бицеллы удваивают свой вклад в флюоресценцию, а вклад липосфероидов, хоть и уменьшается, но меньше, чем на прежний вклад отщепляющихся бицелл. Если же отщепляющиеся от липосфероидов и исходно мономерные липидные бицеллы на поверхности сфероидов ТХ образуют несколько слоёв (не менее двух), то это приводит к уменьшению флюоресценции, поскольку суммарная площадь излучающей поверхности, как нетрудно оценить, становится меньше. Наблюдаемое в опыте соотношение F(Д4-RТХ) и F(Д4ТХ) возможно и при условии, что в обоих случаях заполняется менее двух слоёв, но в первом случае площадь второго слоя меньше, чем во втором.

Наблюдаемый медленный рост флюоресценции после внесения RТХ на рис.

4Б (Топалы, Топалы, 2006) означает, что продолжается заполнение первого слоя липидных бицелл на детергентных сфероидах, причём за счёт отщепляющихся от дипосфероидов бицелл. Если же детергент вносится в кювету второй и третий раз, как на рис. 1 (Топалы, Топалы, 2006), то флюоресценция возрастает независимо от типа детергента, ибо при этом возрастает суммарная площадь детергентных сфероидов и ранее связавшиеся со сфероидами липобицеллы перераспределяются на бльшую площадь.

7. Взаимодействие фосфолипидов с DHPC. Аналогичным образом происходит взаимодействие липидов и с остальными исследованными детергентами. Обсудим тем не менее DHPC, который ведёт себя качественно и даже количественно (таблица 2 в (Топалы, Топалы, 2006)) также, как и прочие детергенты. Интересен DHPC тем, что это фосфолипид, отличающийся от POPC, являющегося основным липидом исследованных в этой работе дисперсий, лишь значительно более короткими гидрофобными остатками. Из-за этого молекулы DHPC образуют бицеллы и сфероиды значительно менее крупные, несмотря даже на отсутствие в его молекуле двойных связей, вследствие чего он попал в разряд детергентов. Здесь WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ уместно затронуть вопрос о силах, обеспечивающих исключительную устойчивость липидного бислоя (бицеллы). Естественно, что речь идёт о гидрофобных силах. Сейчас считается, что интердигитация липидных молекул в бислое возникает только в определённых условиях. Между тем с точки зрения минимума энергии системы интердигитация в любых условиях выгоднее. Мы полагаем, что в любых бицеллах молекулы липида интердигитированы (рис. 1 в (Топалы, 2006)). Некоторые факты, изложенные в этой работе, можно привлечь в качестве свидетельства в пользу этого предположения. Действительно, данные указывают, что в дисперсии из одних NBD-PE и Rh-PE (рис. 3Б, например, в (Топалы, Топалы, 2006)) липиды образуют крупные бицеллы и сфероиды, причём даже в метаноле (таблица 3 в (Топалы, Топалы, 2006)) при концентрации 60 нМ. Меченые липиды представляют собой диолеоильные производные фосфатидилэтаноламина и образование бицелл из-за большого размера полярных головок возможно только при условии интердигитации молекул.

По этой же причине водородные связи не могут играть большой роли в стабилизации как монослоя, так и сфероидов. Поэтому ясно, что такого же размера бицеллы и сфероиды дипальмитоилфосфатидилхолин (DРPC) образует при концентрации на много порядков меньше ( 1 нМ). В то же время в дисперсии DHPC ~10 мМ, хотя бицеллы и сфероиды есть, но они значительно мельче (таблица 2). DHPC при концентрации более 0.5 М образует в воде раствор при простом встряхивании, а DРPC даже в чрезвычайно малых количествах можно диспергировать лишь предварительно “расплавив” его при температуре ~45 °С. При охлаждении дисперсия DРPC мгновенно мутнеет и липид выпадает в осадок. Это связано, на наш взгляд, с тем что DРPC образует очень крупные бицеллы и сфероиды (больше 5 мкм), которые невозможно размешать за счёт тепловой энергии броуновского движения. Столь большая разница между DРPC и DHPC в образовании сфероидов трудно объяснить, если сцепление между монослоями в бислое (бицелле) одинаковы для обоих липидов. Если же оба липида образуют интердигитированные бислои, то эти различия легко объясняются.

8. Смешанные липидно-детергентные и детергентно-липидные сфероиды. Итак, в результате взаимодействия липида с детергентом образуются смешанные сфероиды из детергента и липида (а не смешанные мицеллы). В одних из них глобулы и все последующие слои бицелл, кроме нескольких поверхностных, состоят из детергентов, их можно назвать детергентно-липидными. В других глобулы и все последующие слои бицелл, кроме нескольких поверхностных, состоят из липидов и их можно назвать липидно-детергентными. Устанавливающееся состояние не является стационарным, о чём позволяют судить данные рис. 10А в (Топалы, Топалы, 2006). Хотя и очень медленно, но смешивание липида с детергентом продолжается. От липидно-детергентных сфероидов продолжают отщепляться липидные бицеллы, которые перемещаются в детергентнолипидные сфероиды. Эти бицеллы наслаиваются на такие же поверхностные WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ бицеллы детергентно-липидных сфероидов. В противном случае было бы непонятно, почему флюоресценция продолжает уменьшаться. Это указывает, по-видимому, на то, что детергентные бицеллы слабо удерживаются как в детергентно-липидных, так и в липидно-детергентных сфероидах из-за того, что образует слабые и/или немногочисленные связи. Иначе детергентные и липидные бицеллы чередовались бы, что вело бы к росту флюоресценции дисперсии. Исходя из разницы в молекулярном строении ТХ и RТХ (см.

выше), в дисперсии последнего должно быть меньше мономерных бицелл, чем таких же бицелл ТХ в эквимолярной дисперсии ТХ. Это подтверждается в опыте. Снижение флюоресценции у дисперсии Д1 с RТХ (рис. 1А) происходит быстрее, чем у дисперсии Д1 с ТХ (рис.10А в (Топалы, Топалы, 2006)). Даже у дисперсии Д4 с RТХ начальный примерно 10-часовой период небольшого увеличения флюоресценции переходит в фазу её заметного уменьшения (рис. 1Б). Рост флюоресценции имеет место, по-видимому, до тех пор, пока на детергентно-липидных сфероидах заполняется первый поверхностный слой липидных бицелл. Заполнение следующего уже второго поверхностного слоя таких бицелл на этих сфероидах сопровождается снижением флюоресценции. Отсутствие фазы роста на рис. 1А мы связываем с влиянием меченых липидов на агрегатный состав дисперсии. Из-за этого в дисперсии Д4 сфероиды устойчивее, а содержание мономерных бицелл ниже, чем в Д1. В последней таких бицелл достаточно для быстрого заполнения одного поверхностного слоя и какой-то части второго на детергентнолипидных сфероидах. Отщепляющиеся далее от липидно-детергентных сфероидов липобицеллы при связывании с детергентно-липидными сфероидами продолжают заполнять второй слой, что сопровождается снижением флюоресценции. В случае Д4 имеющихся к началу записи мономерных липобицелл не хватает на заполнение первого поверхностного слоя на детергентно-липидных сфероидах. Пока продолжается его заполнение флюоресценция продолжает расти и лишь когда начинается заполнение второго слоя она начинает снижаться (рис. 1Б). Медленный рост, следующий за скачкообразным увеличением флюоресценции после внесения RТХ на рис. 4В в (Топалы, Топалы, 2006) объясняется также (п. 6).

WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ Рис. 1. Флюоресценция меченых дисперсий Д1 (А) и Д4 (Б), измеренная на протяжении примерно 50 часов после внесения в кювету RТХ до концентрации 4.2 мМ (см. Материалы и методы в (Топалы, Топалы, 2006)). Содержание NBD-PE и Rh-PE в кюветах по 30 нМ. Настройки флюориметра как на рис. 1 в (Топалы, Топалы, 2006). На рисунках приведены также прямы, указывающие средние скорости изменения флюоресценции F=a+bt, где a и b – коэффициенты, t – время. В А a= 42.5 отн.ед., b= -0. отн.ед./час, в В a= 12.5 отн.ед., b= -0.04 отн.ед./час.

Отметим, что различный характер кривых на рис. 1А и 1Б позволяет исключить деградацию (обесцвечивание) флюорофоров в качестве причины наблюдаемого снижения флюоресценции.

При внесении SDS в кювету с Д1 (рис. 6А в (Топалы, Топалы, 2006)) или Д5 (рис. 8А в (Топалы, Топалы, 2006)) скачкообразное изменение флюоресценции не регистрируется, а лишь относительно медленное снижение во времени. Это может означать, что имеющихся в кювете липидных сфероидов к моменту начала записи хватает только на заполнение одного поверхностного слоя на всех вносимых в кювету сфероидах SDS, а отщепляющиеся далее от липидно-детергентных сфероидов липобицеллы сразу начинают формировать уже второй слой подобных бицелл на детергентно-липидных сфероидах. Отличие кинетики от показанной на рис.

4А (Топалы, Топалы, 2006) связано с различиями в молекулярных структурах SDS и ТХ. Из-за этого как количество сфероидов и их суммарная поверхность, так и константы скоростей связывания липобицелл к сфероидам отличаются. По этой причине и скорости отщепления бицелл от липосфероидов также отличаются. Судя по рис. 2А, снижение флюоресценции после внесения SDS продолжается в течение очень продолжительного времени. Наблюдение смеси SDS с дисперсией Д4 (рис.

2Б) показывает, что взаимодействие детергентно-липидных сфероидов с липидно-детергентными может иметь и более сложный характер, но и в этом случае после начального (около 2 час) заметного смешивания детергента и липида следует фаза их разделения.

WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ Рис. 2. Флюоресценция меченых дисперсий Д1 (А) и Д4 (Б), измеренная на протяжении примерно 140 час (А) и 70 час (Б) после внесения в кювету SDS до концентрации 6.9 мМ (см. Материалы и методы в (Топалы, Топалы, 2006)). Содержание NBD-PE и Rh-PE в кюветах по 30 нМ, а РОРС 30 мкМ (А) и 0 мкМ (Б). Настройки флюориметра как на рис. 1 в (Топалы, Топалы, 2006). На рисунках приведены также прямые, указывающие средние скорости изменения флюоресценции F = a + bt, где a и b – коэффициенты, t – время. В А a = 16 отн.ед., b = -0.03 отн.ед./час, в В a = 3.6 отн.ед., b = отн.ед./час.

9. Влияние ультразвука и детергента на флюоресценцию. Увеличение F(Д4) за счёт облучения ультразвуком (рис. 3Б в (Топалы, Топалы, 2006) и 3Б) означает увеличение суммарной поверхности липобицелл и липосфероидов. Это происходит, очевидно, из-за уменьшения среднего размера этих агрегатов, что вполне соотвествует существующим взглядам на функцию ультразвука измельчать (разрушать) агрегаты. Однако уменьшение F(Д1) при облучении ультразвуком (рис. 3А в (Топалы, Топалы, 2006) и 3А), указывающее на увеличение среднего размера липобицелл и липосфероидов, противоречит этому взгляду. Мы полагаем, что укрупнение агрегатов происходит спонтанно, за счёт теплового движения. Вспомним, что все исследованные дисперсии неравновесны (п. 4), в них происходит рост размера агрегатов. Ультразвук играет в этом процессе вспомогательную роль. Разрушая самые мелкие липосфероиды (они самые неустойчивые, см.

WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ пп. 2 и 5 в (Топалы, 2006)), он ускоряет процесс достижения стационарного состояния, поставляя в систему мелкие агрегаты, которые быстро деградируют до молекул, которые включаются в самые крупные липобицеллы и липосфероиды. Разница в эффектах ультразвука на Д1 и Д связана с очень большим различием в номинальных концентрациях липида.

В Д1 липидов в 500 раз больше и липосфероиды значительно крупнее.

Рис. 3. Влияние облучения ультразвуком на флюоресценцию дисперсий Д1 (А) и Д (Б).После нулевой линии (записи до первой стрелки) флюоресценция до (вторая запись) и после (третья запись) озвучивания содержимого кюветы с дисперсией (22 кгц, 50 мин, °С), после внесения RTX до концентрации 4.2 мМ (четвёртая запись) и после повторного озвучивания в указанном режиме (последняя запись). Содержание NBD-PE и Rh-PE в кюветах по 30 нМ, а РОРС 30 мкМ (А) и 0 мкМ (Б). Настройки флюориметра как на рис. в (Топалы, Топалы, 2006).

На рис. 3 показано также влияние ультразвука на те же дисперсии, содержащие RТХ. Видно, что значения F(Д1-RТХ) и F(Д4-RТХ) после облучения ультразвуком хоть и сближаются, но всё ещё остаются очень разными. Сближение происходит в основном за счёт F(Д4-RТХ). В Д4 из-за более малых размеров липосфероидов происходит лучшее смешивание липида с детергентом, чем в Д1. Записи показывают, однако, что после озвучивания и F(Д1-RТХ), и F(Д4-RТХ) уменьшаются во времени. Это связано, по-видимому, с тем, что липосфероиды и липобицеллы намного крупнее сфероидов и бицелл RТХ. Это ведёт к кластеризации и липида, и WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ детергента. Отщепляющиеся от детергентно-липидных сфероидов липобицеллы чаще возвращаются в липидно-детергентные сфероиды с близкими размерами. С другой стороны, детергентные бицеллы из-за их малых размеров легко отщепляются от липидно-детергентных сфероидов, в результате чего часть из них превращается в липосфероиды, которые могут даже увеличиваться, присоединяя липобицеллы.

10. Взаимодействие меченых и немеченых липидов. Немеченые липиды взаимодействуют с мечеными (рис. 9 в (Топалы, Топалы, 2006)) по тому же сценарию, который описан выше для взаимодействия детергентов с липидами. Это взаимодействие всегда сопровождается более или менее выраженным ростом флюоресценции, который определяется кинетическими параметрами дисперсий. Полное смешивание меченых и немеченых липидов не может быть достигнуто за реальное время, ибо основная масса и тех и других практически не принимает участия в реакциях. Очевидно, это справедливо и в отношении смешивания дисперсий двух разных липидов.

При этом образуется дисперсия, состоящая из смеси двух типов сфероидов, у которых поверхностные слои состоят из бицелл, содержащих молекулы обоих липидов, но с преобладанием одного или второго, а внутренние слои состоят из бицелл индивидуальных липидов одного или второго типа.

11. Взаимодействие меченого липида с амфифильным растворителем (рис. 2 в (Топалы, Топалы, 2006)) ничем принципиально не отличается от описанного выше взаимодействия с детергентом или меченым липидом. Рис.

2А можно было бы представить для наглядности точно также, как и рис. 1А или 1Б в (Топалы, Топалы, 2006), а именно, второй записью дать флюоресценцию меченой дисперсии в водной среде. Тогда приведённая вторая запись на рис. 2А представляла бы собой флюоресценцию меченой дисперсии после замены водной среды на метанол. С точки зрения предлагаемой модели дисперсии (Топалы, 2006) разница между амфифилами не принципиальная, а только количественная. Несмотря на очевидные особенности молекулы, в чистом метаноле (т.е. при 100 %-ной концентрации) вполне возможно наличие глобулярных мицелл, причём как прямых, так и обратных, а также бицелл и даже сфероидов. Какие изменения происходят в дисперсии после описанной выше воображаемой замены водной среды на метанол? Эта “замена” резко меняет кинетические параметры дисперсии, т.е. все константы скоростей реакций 1–3, 12 в (Топалы, 2006). Концентрация мономеров липида после установления равновесия существенно выше. Достигается ли или нет равновесие в кювете на основании данных рис. 2 в (Топалы, Топалы, 2006) решить нельзя. Однако на основании данных таблицы 3 в (Топалы, Топалы, 2006) можно с уверенностью сказать, что липид при этом не диспергирован до молекул. В противном случае при освещении фотонами 470 нм флюоресценции 530 нм дисперсий Д5 и Д8 в метаноле были бы одинаковы, а флюоресценция 577 нм отсутствовала бы, поскольку в истинном растворе никаких комплексов нет и перенос энергии от донора к акцептору невозможен. Кроме того, флюоресценция истинного раствора не может флуктуировать, как на рис. WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ (Топалы, Топалы, 2006). Средние размеры мономерных бицелл и сфероидов в метанольной равновесной дисперсии липида меньше, чем в воде.

Следовательно, независимо от распределения липидов между различными типами агрегатов при одинаковых номинальных концентрациях красителей флюоресценция и донора, и акцептора в метаноле должна быть выше, чем в воде (п. 4).

Независимо от того, достигается ли равновесие в кювете после внесения водной дисперсии липида, кинетика изменения флюоресценции также позволяет судить о характере образующихся при этом липидных агрегатов и механизме их образования. На самом деле, рост флюоресценции после внесения пробы в кювету явно имеет место не менее, чем в две фазы, резко отличающихся по кинетике. В первой фазе происходит основной рост, причём скачкообразно (рис. 2А в (Топалы, Топалы, 2006)), а во второй имеет место незначительный, но достоверный рост (рис. 2Б в (Топалы, Топалы, 2006)). Не исключено, что стационарное значение за время записи не устанавливается. Такая же картина наблюдается и при внесении водных дисперсий липида в диметилформамид, что видно на рис. 4 на примере дисперсий Д1 и Д4. Видно также, что Тритон Х-100 практически не влияет на флюоресценцию, а у “шума” после внесения липида и детергента амплитуда больше, чем у “шума” нулевой линии.

Рис. 4. Нулевая линия (до первой стрелки) и флюоресценция после внесения в кювету (после первой стрелки) меченых дисперсий Д1 (А) и Д4 (Б) и после внесения ТХ (после WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ второй стрелки) до концентрации 4.2 мМ. Среда – диметилформамид, содержание NBDPE и Rh-PE в кюветах по 30 нМ, а РОРС 30 мкМ (А) и 0 мкМ (Б). ТХ вносится в виде маточного раствора в диметилформамиде. Настройки флюориметра как на рис. 1 в (Топалы, Топалы, 2006).

Из вышеизложенного следует, что в амфифильных растворителях липиды существуют в виде агрегатов, внутри которых имеются комплексы NBD/Rh, ответственные за перенос энергии между донором и акцептором, поскольку, согласно таблице 3 в (Топалы, Топалы, 2006), этот перенос осуществляется не по Фёрстеру (п. 5). Что же касается двухфазного роста флюоресценции при внесении водных дисперсий меченого липида (см. выше), то его однозначная интерпретация затруднительна. Скорее всего, вторая медленная фаза обусловлена самыми крупными из внесённых в кювету сфероидов и бицелл, возможно, даже аномально крупных (п. 3), скорость деградации которых мала. Интересно, однако, что представляют собой липидные агрегаты в амфифильном растворителе. Вряд ли это просто внесённые липосфероиды в уменьшенном виде. Бльшая часть липидов, освобождаемых в результате деградации внесённых агрегатов, по-видимому, включается в другие агрегаты, которые формируются заново. Не исключено, что при этом образуются и липосфероиды, в центре которых находятся глобулы и даже несколько слоёв бицелл вокруг них (т.е. сфероиды), состоящие из амфифильного растворителя. Липобицеллы могут включаться в сфероиды из растворителя, когда они достигают сходных с ними размеров.

12. О гомогенности липидной дисперсии. Уместно обсудить вопрос о возможности получения гомогенной дисперсии смеси липидов.

Этот вопрос имеет и практическое значение, поскольку смеси липидов чаще всего и исследуются. В литературе много публикаций о кластеризации тех или иных липидов в составе дисперсий. Обычно это свойство приписывают особенностям молекул соответствующего липида. При демонстрации кластеризации в эксперименте надо быть уверенным, однако, что на какой-то стадии процесса изготовления дисперсии многокомпонентная липидная смесь представляет собой гомогенную смесь. Обычно предполагается, что это достигается уже на первой стадии, когда смешиваются растворы разных липидов в амфифильном растворителе. Из п. 11 следует, что это предположение вряд ли оправдано, так как и в этих растворах липид агрегирован. Поэтому интересно, насколько гомогенными являются получаемые дисперсии смесей липидов. Даже при работе с практически двухкомпонентной системой, как в нашем исследовании, очень важно, чтобы метка, независимо от её концентрации в дисперсии, была гомогенно распределена между всеми возможными липидными агрегатами. Далее мы излагаем ряд фактов, позволяющих внести определённую ясность в этом вопросе.

Флюоресценции дисперсий Д1-Д8, которые держали в темноте при 25 °С, измеряли многократно на протяжении длительного периода времени. Анализ этих данных позволил выявить интересные факты. В условиях освещения WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ кюветы фотонами 470 нм в течение первых дней после приготовления дисперсий флюоресценция 530 нм у дисперсий Д2-Д4 была несколько выше, чем у дисперсий Д6-Д8. Это вполне объяснимо в рамках предлагаемой модели дисперсии (Топалы, 2006). Хотя дисперсии и не являются равновесными, естественно думать, что средние размеры агрегатов в них тем выше, чем выше номинальная концентрация липида, как и в случае равновесных дисперсий. Однако у дисперсии Д1 флюоресценция была заметно ниже, чем у дисперсии Д5, причём она оставалась ниже и через месяца (таблица 1 в (Топалы, Топалы, 2006)). Наиболее разумным объяснением этого факта является, на наш взгляд, менее гомогенное распределение меченых липидов в Д5, чем в Д1. Вспомним технологию изготовления дисперсий. На стадии смешения растворов меченых и немеченых липидов в хлороформе гомогенизация, по-видимому, не достигается оттого, главным образом, что концентрация немеченых липидов высока и значительная их доля находится в сфероидах. Тщательное удаление хлороформа на кластеризацию липидов не влияет. Далее липиды растворяются в эфире, и пробирка тщательно встряхивается. Затем добавляется определённый объём воды. Эти операции, по-видимому, не устраняют возможную кластеризацию липидов. Самые подходящие условия для гомогенизации липидов возникают во время интенсивного встряхивания пробирки на вибраторе. При этом в дисперсии образуется большое количество мельчайших капель воды в эфире и липиды распределяются между эфирной фазой, водной фазой и границей раздела между ними в виде монослоя. Наименьшей потенциальной энергией в этих условиях обладают молекулы липида, локализованные в монослое. Идеальная гомогенизация происходит, очевидно, при условии, что количество липидов в дисперсии таково, что практически все они при равновесии оказываются именно в монослое. Тот факт, что у дисперсии Д5 флюоресценция выше, чем у Д1, проще всего объяснить тем, что при получении Д5 полная гомогенизация не происходит или она хуже, чем для Д1 из-за того, что в случае Д5 немеченых липидов в 10 раз больше. Значительная доля этих липидов остаётся в эфире в виде сфероидов. В результате этого после удаления эфира метки оказываются в основном в поверхностных бицеллярных слоях сфероидов.

Естественно, что в этих слоях концентрация меток выше средней.

Соотношение метка/немеченый липид в реально участвующих в реакциях липидных агрегатах (поверхностные бицеллы сфероидов, мономерные бицеллы и недискоидные комплексы) в дисперсии Д5 выше, чем в Д1.

Размеры агрегатов в Д5 больше, чем в Д1. Поэтому при одинаковых номинальных концентрациях липида в кювете суммарная поверхность сфероидов в дисперсии Д5 меньше, чем в дисперсии Д1, но количество неассоциированных NBD-PE, которые флюоресцируют, больше из-за более высокой концентрации красителей в меченых бицеллах.

Из изложенного выше мы заключаем, что в получаемой методом упаривания обратной фазы дисперсии с номинальной концентрацией липидов 10 мМ некоторые её компоненты кластеризованы. Чем меньше WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ липидов диспергируется этим методом, тем гомогеннее дисперсия. К сожалению, вышеописанный факт показывает лишь, что дисперсия Д1 более гомогенна, чем Д5. Является ли дисперсия Д1 полностью однородной на фазе встряхивания эфирно-водной смеси пока неясно. Что же касается других способов диспергирования липидов, то при их использовании дисперсии, повидимому, всегда негомогенны. Описанные опыты с длительным перемешиванием детергентно-липидных смесей (рис. 10 в (Топалы, Топалы, 2006), 1, 2) или с облучением таких смесей ультразвуком (рис. 3 в (Топалы, Топалы, 2006), 3), показывают, что гомогенизация этими способами не достигается.

13. Квантовый выход флюоресценции донора. Все приведённые факты становятся качественно понятными в рамках предлагаемой модели дисперсии амфифилов (Топалы, 2006) и постулата о взаимодействии флюорофоров с образованием комплексов с различными оптическими свойствами (п. 2). Нет никакой необходимости допускать ту или иную зависимость КВФ от среды или других компонентов дисперсии. Такая необходимость возникает, когда свойства меченой флюорофорами дисперсии трактуются в рамках теории Фёрстера и какое-нибудь из этих свойств не описывается этой теорией, как, например, разные значения флюоресценции меченой дисперсии в воде и метаноле или в присутствии ТХ и CTAB (Топалы, Топалы, 2006). И это естественно, поскольку в теории Фёрстера постулируется отсутствие каких-либо комплексов флюорофоров в обычном физико-химическом понимании этого слова, т.е. флюорофоры предполагаются диспергированными до отдельных молекул (истинный раствор). Единственное, что допускается, это особые “фёрстеровские комплексы” (п. 5 в (Топалы, Топалы, 2006)) донора с акцептором, между двумя компонентами которого существует безызлучательное дальнодействие (резонансный перенос энергии).

Измерить КВФ в опыте можно только при условии, что флюорофор действительно диспергирован до молекул. В настоящее время нет методов, позволяющих достоверно определять степень диспергирования веществ в растворах. Поэтому возможность качественно понять результаты флюоресцентных исследований липидных дисперсий без необходимости измерять КВФ флюорофоров чрезвычайно важна.

Удовлетворительное объяснение свойств флюоресцентно меченых липидных и детергентно-липидных дисперсий в рамках предлагаемой модели дисперсий амфифилов (Топалы, 2006) позволяет заключить, что основными агрегатами липидной дисперсии являются липосфероиды.

Дисперсия детергента также содержит сфероиды. Так называемая критическая концентрация мицеллообразования является концентрацией, выше которой в дисперсии образуются сфероиды. Получаемые разными методами дисперсии липидов (крупные, гигантские одноламеллярные WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ липосомы, многослойные липосомы), которые принято считать равновесными, в действительности являются более или менее устойчивыми нестационарными системами, а не равновесными, как принято думать. Этот вывод устраняет одно из серьёзных противоречий между существующими представлениями о природе липидных дисперсий и термодинамикой, из которой следует, что равновесная дисперсия может быть только одна и её свойства не зависят от способа диспергирования. Предлагаемую модель дисперсии амфифилов можно использовать в качестве рабочей модели при планировании экспериментов с липидными дисперсиями вместо липосомальной идеи, которая давно перестала выполнять эту роль.

Топалы В.П., Топалы Э.Е. Исследование дисперсий фосфолипидов. 1. Меченый NBDPE и Rh-PE пальмитоилолеоилфосфатидилхолин. Medline.Ru, 2006, том 7, стр. 108- Топалы В.П., Топалы Э.Е. Исследование дисперсий фосфолипидов. 3.

Экспериментальная проверка модели дисперсии липидов. Medline.Ru, 2006, том 7, стр.

157- De Kruijff B., R.A.Demel. Polyene antibiotic-sterol interactions in membranes of Acholeplasma Laidlawii cells and lecithin liposomes. III. Molecular structure of the polyene antibiotic-sterol complexes. Biochim. Biophys. Acta, 339, n. 1, p. 57-70, 1974.

Larrabee A. L. Time-dependent changes in the size distribution of distearoylphosphatidylcholine vesicles. Biochemistry, 1979, v. 18, n. 15, p. 3321- Lentz B.R., Carpenter T.J., Alford D.R. Spontaneous Fusion of Phosphatidylcholine Small Unilamellar Vesicles in the Fluid Phase. Biochemistry, 1987, v. 26, n. 17, p. 5389- Lichtenberg D., Freire E., Schmidt C.F., Barenholz Y., Felgner P.L., Thompson T.E. Effect of surface curvature on stability, thermodynamic behavior, and osmotic activity of dipalmitoylphosphatidylcholine single lamellar vesicles. Biochemistry, 1981, v. 20, n.12, p. 3462- Reynolds J.A. The role of micelles in protein-detergent interactions. Methods in Enzymology, v. 61, part H, p. 58-62, 1979.

The model of amphiphile dispersion (Topale, 2006) is used for interpretation of properties of fluorescently labeled phospholipid and detergent-lipid dispersions earlier described (Topaly, Topaly, 2006). For this purpose the postulate about NBD/Rh complexes and their optical properties is proposed also. In combination with this postulate the model proposed quite satisfactorily accounts for the experimental results. This permits to conclude that a lipid dispertion consists mainly of lipospheroids. A detergent dispersion contains spheroids also. The socalled critical micellar concentration is the concentration above which spheroids form. All known methods of lipid disintegration produce more or less stable nonsteady-state dispersions differing by the extent of remoteness from steadystate. This permits to eliminate the collision of different steady-state lipid dispersions depending of disintegration method with thermodynamics.




Похожие работы:

«Полная исследовательская публикация Тематический раздел: Физико-химические исследования. Регистрационный код публикации: 2tp-b76 Подраздел: Теплофизические свойства веществ. УДК 536.33:536.421. Поступила в редакцию 10 ноября 2002 г. БЫСТРАЯ КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ ТУГОПЛАВКИХ ОКСИДОВ И ВОЗМОЖНОСТЬ ОБРАЗОВАНИЯ ДВУХФАЗНОЙ ЗОНЫ © Воробьёв А.Ю., Петров В.А., Титов В.Е. и Улыбин С.А. Институт теплофизики экстремальных состояний ОИВТ РАН. г. Москва. Ключевые слова: быстрая кристаллизация, свободное...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МОСКОВСКИЙ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ (ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ) РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ Московского физико-технического института (государственного университета) в 2010 году МОСКВА МФТИ 2011 Под редакцией Н.Н. Кудрявцева, Т.В. Кондранина, Е.В. Глуховой, Л.В. Ковалевой Результаты работы Московского физико-технического института (государственного университета) в 2010 году. – М.: МФТИ, 2011. – 232 с. © ГОУ ВПО Московский физико-технический...»

«Емкости для воды б у в г Красноярске Европейская клиника в г Воронеже Доступ к файлам windows 7 через mac Е 160 кaтaлог зaпчaстей Доставка груза г Озерск Е Беркова картинки Есть ли яйца попугаи без г Е польнa мирaжи Есн с пособия к отпуску Доступ к андроиду с win Дударева елена ивановна гАбакан Жеплод для соуса к жареным куропаткам Евротрансмиссия г Москва Е болячки шар-пеев Драйвер к принтеру s 200 ЕТашков умер Документы при открытии счета юр лицу в втб по гМоскве Жалобы и предложения на...»

«К исх. № от.11.2009г. К вх. № от.11.2009г. МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЯДЕРНОЙ ФИЗИКИ им. Д.В.СКОБЕЛЬЦЫНА УДК 613.693 Номер государственной регистрации Ф40836 Экз. № 1 Инв. № 2009/193 Директор Научно-исследовательского института ядерной физики им. Д.В. Скобельцына Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, профессор М.И. Панасюк 2009 г. НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ОТЧ ЕТ ПРОВЕДЕНИЕ УГЛУБЛЕННОГО АНАЛИЗА ИМЕЮЩ ИХСЯ...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МОСКОВСКИЙ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ (ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ) РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ Московского физико-технического института (государственного университета) в 2011 году МОСКВА МФТИ 2012 Под редакцией Н.Н. Кудрявцева, Т.В. Кондранина, Ю.Н. Волкова, Л.В. Ковалевой Результаты работы Московского физико-технического института (государственного университета) в 2011 году. – М.: МФТИ, 2012. – 286 с. © федеральное государственное автономное...»

«СОБИСЕВИЧ, СОБИСЕВИЧ: ДИЛАТАНСНЫЕ СТРУКТУРЫ И ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫЕ ВОЗМУЩЕНИЯ ВЕСТНИК ОНЗ РАН, ТОМ 2, NZ6027, doi:10.2205/2010NZ000045, 2010 Дилатансные структуры и электромагнитные возмущения УНЧ диапазона на этапах подготовки и развития крупного сейсмического события Л. Е. Собисевич, А. Л. Собисевич Институт физики Земли им. О. Ю.Шмидта РАН. Москва Получено 31 марта 2010; опубликовано 5 июня 2010. Рассмотрены вопросы формирования дилатансных структур вблизи поверхности земли на этапе подготовки...»

«Федеральное агентство по образованию Национальный исследовательский ядерный университет МИФИ А.Н. Долгов Пособие по физике МЕХАНИКА Часть 3 ЗАКОНЫ СОХРАНЕНИЯ В помощь учащимся 10—11 классов Москва 2009 УДК 531(075) ББК 22.2я7 Д 64 Долгов А.Н. ПОСОБИЕ ПО ФИЗИКЕ МЕХАНИКА. В 3-х ч. Ч. 3. Законы сохранения. В помощь учащимся 10—11 классов. — М.: МИФИ, 2009. — 76 с. В пособии дается систематическое изложение основного содержания школьного курса физики по разделу Законы сохранения в соответствии с...»

«2 3 1. Цели и задачи изучения дисциплины Геофизические методы поисков и разведки месторождений твердых полезных ископаемых Целью преподавания дисциплины Геофизические методы поисков и разведки месторождений твердых полезных ископаемых является ознакомление будущих специалистов – геологов с основами геофизических методов и их местом в общем комплексе геологических исследований. Роль геофизических методов при решении геологических задач настолько значительна, что геофизические методы применяются...»

«Полная исследовательская публикация Тематический раздел: Физико-химические исследования. _ Подраздел: Теплофизические свойства веществ. Регистрационный код публикации: 2tp-b25 Поступила в редакцию 10 ноября 2002 г. УДК 536.4 ОСНОВНЫЕ ПАРАМЕТРЫ КРИТИЧЕСКОЙ ТОЧКИ МЕТАЛЛОВ С ПЛОТНОУПАКОВАННОЙ КРИСТАЛЛИЧЕСКОЙ СТРУКТУРОЙ © Басин А.С. Институт теплофизики СО РАН Ключевые слова: критические параметры, методика расчета, кристаллическая структура. Резюме Представлен обзор собственных данных и...»

«Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЯДЕРНОЙ ФИЗИКИ ИМ. Д.В.СКОБЕЛЬЦЫНА УДК 551.510; 523.165 Шифр 2007-3-1.3-24-07-126 УТВЕРЖДАЮ Зам. директора НИИЯФ профессор В.И. Саврин _ 2007 г. ОТЧЕТ О НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЕ ПО ГК № 02.513.11. РАЗРАБОТКА РАДИАЦИОННО-СТОЙКИХ НАНОКОМПОЗИТНЫХ УГЛЕВОДОРОДНЫХ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ КОСМИЧЕСКОЙ ТЕХНИКИ (заключительный) Руководитель темы профессор М.И. Панасюк __ 2007 г. Москва СПИСОК ИСПОЛНИТЕЛЕЙ...»

«НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЯДЕРНОЙ ФИЗИКИ ИМЕНИ Д.В.СКОБЕЛЬЦЫНА МОСКОВСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА УДК 537.591 № госрегистрации 01.9.80004286 Инв. № 01/08-02 УТВЕРЖДАЮ Директор НИИЯФ МГУ профессор М.И. Панасюк октября 2008 г. ОТЧЕТ О НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЕ ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ В ОБЛАСТИ РАЦИОНАЛЬНОГО ПРИРОДОПОЛЬЗОВАНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УНИКАЛЬНЫХ УСТАНОВОК ПОИСК ПРЕДЕЛА УСКОРЕНИЯ КОСМИЧЕСКИХ ЛУЧЕЙ В ГАЛАКТИКЕ И МОНИТОРИНГ СОСТОЯНИЯ АТМОСФЕРЫ И...»

«SELECTED ASPECTS OF THE CONDENSED MATTER PHYSICS. WORK AND LIFE OF PROFESSOR B.YA. SUKHAREVSKY V.V. Eremenko 1, V.G. Manzhely 1, V.N. Varyukhin 2, A.D. Alekseev 3, V.A. Beloshenko 2, A. Voronel 3, V.V Pustovalov 1, V.Ya. Maleev 5, S.A. Gredeskul 6, L.P. Mezhov-Deglin 7, A.Yu. Zakharov 8, N.Ya. Fogel 9, I.I. Vishnevsky 10, V.M. Tsukernik 11, V.N. Vasyukov 12, E.P. Feldman 3, A.V. Leont’eva 13, Yu.A. Mamaluy 14, G.G. Levchenko 2, Yu.V. Medvedev 2, A.D. Prokhorov 2, V.M. Yurchenko 2, B.G. Alapin...»

«Министерство образования Российской Федерации НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ М.Ю. Баландин Э.П. Шурина ВЕКТОРНЫЙ МЕТОД КОНЕЧНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ Утверждено Редакционно-издательским советом в качестве учебного пособия для студентов факультета прикладной математики (направление 510200, специализации магистерской подготовки 510202, 510204) Новосибирск 2001 УДК 519.61 (075.8) Б201 Б201 Баландин М. Ю., Шурина Э. П. Векторный метод конечных элементов: Учеб. пособие. — Новосибирск:...»

«Федеральное агентство по образованию РФ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЯДЕРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ МИФИ ПОСОБИЕ ПО ГЕОМЕТРИИ Часть II. Стереометрия В помощь учащимся 10–11-х классов Москва 2009 УДК 512(076) ББК 22.143я7 Пособие по геометрии. Часть II. Стереометрия. В помощь учащимся 10–11-х классов./ О.В. Нагорнов, А.В. Баскаков, О.Б. Баскакова, Н.В. Серебрякова. – М.: НИЯУ МИФИ, 2009. – 108 с. Пособие составлено в соответствии со школьной программой углубленного изучения математики в 10–11-х классах....»

«К исх. № от.04.2006г. К вх. № от.04.2006г. НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЯДЕРНОЙ ФИЗИКИ Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова УДК 524.354 Номер государственной регистрации: Экз.№ 1 инв. № УТВЕРЖДАЮ Директор научно-исследовательского института ядерной физики имени Д.В.Скобельцына МГУ имени М.В.Ломоносова. _М.И.Панасюк 2009 г. НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ОТЧЕТ Методика регистрации и определение конструкции научной аппаратуры для изучения транзиентных атмосферных явлений на...»

«WWW.MEDLINE.RU ТОМ 7, БИОФИЗИКА, ИЮНЬ 2006 Исследование дисперсий фосфолипидов. 1. Меченый NBD-PE и Rh-PE пальмитоилолеоилфосфатидилхолин В.П. Топалы, Э.Е. Топалы Институт Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН, Содержание Аннотация Введение 1. Материалы и методы 2. Результаты и обсуждение 2.1. Первые сомнения 2.2. Флюоресценция меченой дисперсии POPC как функция её возраста 2.3. Влияние ультразвука на флюоресценцию 2.4. Влияние детергентов на флюоресценцию 2.5. Флюоресценция донора и...»

«Сэл Рейчел Изменение Земли и 2012 год Послания Основателей (вторая редакция) Перевод: Любовь Подлипская Март, 2008 Содержание Глава 9 – Изменения Земли, объясненные с разных Предисловие Благодарности преимущественных позиций Антропологические данные Введение Философия изменений Психология изменений Земли Часть 1 – Необходимая основная информация Метафизика изменений Земли Религия Глава 1 - Природа Вселенной Духовность Глава 2 – Божественные Разрешения Биология Глава 3 – Краткая история Земли В...»

«у зверей стих Гофрообразующий ленточный транспортер н-7мм, ширина 150мм толщина 6-7мм 4Утни-т-1111005-50 диаметр кулачка Гдз химия 11 класса нЕКузнецовой Государства мира не имеющие выхода к морю Где у клавиатуры клавиша space Готовность к школе тест векслера методика Горные лыжи бУ в алматы Где у фольксвагена гольф 3 выбит номер кузова и двигателя Гом-2 увд г нижневaртовскa Гостиница у нины лебяжие острова Головокружение у мaлышa Гражданское право Объекты относящиеся исключительно к...»

«Публикации В. М. ТИХОМИРОВ К 100-ЛЕТИЮ СО ДНЯ РОЖДЕНИЯ П. С. УРЫСОНА В этом году исполнилось сто лет со дня рождения Павла Самуиловича Урысона (1898-1924). Его жизнь трагически оборвалась, когда ему было всего двадцать шесть лет, но имя его известно каждому математику — столь фундаментальным явился его вклад в нашу науку. П. С. Урысон родился 3 февраля 1898 года в Одессе. Он рано лишился матери. Заботу о мальчике, наряду с отцом, взяла на себя его сестра — Лина Самойловна Нейман, в будущем —...»

«Лев Николаевич Гумилёв Место исторической географии в востоковедных исследованиях Лев Гумилев МЕСТО ИСТОРИЧЕСКОЙ ГЕОГРАФИИ В ВОСТОКОВЕДНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ Опубликовано Народы Азии и Африки, 1970, N 1, стр. 85-94. О значении географических условий, например рельефа для военной истории, говорилось давно. Еще в XVIII в. один из первых русских историков Иван Никитич Болтин сделал замечание: У историка, не имеющего в руках географии, встречается претыкание [i]. Однако ныне история ставит куда более...»







 
© 2014 www.kniga.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Книги, пособия, учебники, издания, публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.