WWW.KNIGA.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Книги, пособия, учебники, издания, публикации

 

.

b558-

00.04-«»

2013

----------------------------------------------------------------------------------------------------------НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. Г.Х. БУНЯТЯНА

МАРАТ КАРУШЕВИЧ АЛЕКСАНЯН

ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЕЙ И АКТИВНОСТЕЙ ИЗОФОРМ ЦИТОХРОМА b558 В КРОВИ И

БИОПТАТАХ ЧЕЛОВЕКА ПРИ НЕКОТОРЫХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЯХ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - ‘‘Биохимия’’ ЕРЕВАН. :

`.,..

`.,..

.

..

`. «13» 2013., 1400http://aab.sci.am :

2013. 10-:

`..

----------------------------------------------------------------------------------------------------------- Тема диссертации утверждена в Институте биохимии им. Г.Х. Бунятяна НАН РА Научный pуководитель: доктор биологических наук, профессор С.С. Алексанян Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Г.А. Геворгян доктор биологических наук Н.А. Бархударян Ведущая организация Ереванский государственный медицинский университет им. М. Гераци Защита состоится 13-го сентября 2013 г. в 1400 ч на заседании специализированного совета по биохимии, молекулярной биологии и физиологии, действующего в Институте биохимии им. Г.Х. Бунятяна НАН РА (0014, Ереван, ул. П. Севака 5/1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии НАН РА и на сайте http://aab.sci.am Автореферат разослан 10-го августа 2013г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук М.А. Бабаян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы По свободно-радикальной теории канцерогенеза активные формы кислорода (АФК) играют ключевую роль в развитии и гибели опухолевых клеток [Emanuel N.M., 1976; Oberley L.W. et al., 1979; Lee Y.S. et al., 2004; Lu J.P. et al., 2010]. В отличие от нормальных клеток раковые клетки обладают способностью пролиферации при избытке супероксидных радикалов (О2). Это объясняется тем обстоятельством, что в опухолевых клетках активность изоформ супероксиддисмутазы (СОД) значительно ниже, чем в нормальных [Oberley L.W. et al., 1979;

Oberley L.W. et al., 2005; Ushio-Fukai M., 2008], в результате чего в раковых клетках происходит повышение концентрации О2. Как ключевая система продуцирования О2 изоформы NADPH оксидаз (Nox) играют важную роль и в функционировании раковых клеток [Oberley L.W. et al., 1979; Vignais P.V., 2002; Fischer O.M. et al., 2004; Lovat P.E. et al]. В сыворотке крови носителя злокачественного новообразования активность NADPH оксидазы существенно повышена по сравнению с сывороткой крови здорового человека [Berridge M.V. et al, 2000; Ligeti E. et al., 1999; Theron A.J. et al., 1994]. Впервые экстрацеллюлярная NADPH оксидаза (еNox) выделена из сыворотки крови белых крыс [Симонян М.А. et al, 1995]. АФК в соответствующих количествах участвуют в процессе злокачественного новообразования. Соответственно ионизирующая радиация различной природы, а также ксенобиотики (например, полициклические ароматические гидроуглеводы и форболэстер) стимулируют образование АФК, которые в свою очередь стимулируют образование раковых клеток [Gius D. et al., 2006]. Однако повышение продуцирования АФК непосредственно в раковых клетках путем снижения активности MnСОД или активности Nox вызывает апоптоз этих клеток и может быть рекомендовано как возможное терапевтическое средство для нейтрализации раковых клеток [Afаnas’ev I.B. 2010., Kim J.A. et al, 2001]. Водорастворимые Nox выделены и очищены из эритроцитарных мембран и сыворотки крови человека, быка, крыс, мышей. Эти ферменты обладают как NADPHО2-продуцирующей, активностями и участвуют в регуляции окислительно-восстановительных процессов, происходящих в митохондриях, ядрах, мембранах клеток и во внеклеточных средах, а также при регулировании кислородного гомеостаза [Симонян М.А. и др., 1995; Simonyan G.M. et al., 2006; Simonyan G.M. et al., 2008; Ushio-Fukai M., 2008]. Другой природной системой стехиометрического продуцирования О2 является супрол (NADPH содержащий, О2продуцирующий липопротеин сыворотки), который в отличие от изоформ Nox продуцирует О2 бесперерывно и энергично как в гомогенной, так и в гетерогенной фазах, что делает перспективным применение супрола как противоопухолевого агента [Симонян М.А. и др., 1996.].

В настоящее время стратегия канцеротерапии обоснована тем, что противораковые препараты, вакцинация, физические факторы (облучение различной энергии) и т.д. в подавляющем большинстве вызывают нарушение анти- и прооксидантного статусов опухолевых клеток, вызывая их гибель. Однако эти противораковые агенты так или иначе вызывают оксидативное повреждение нормальных клеток, оказывая нежелательные повреждающие эффекты [Тадевосян Л.Г. и др, 2007, 2009, 2010]. С другой стороны, средства для нейтрализации метастаз далеко еще неэффективны и необходимость нахождения принципиально новых подходов решения этой проблемы очевидна.

Aктуальность работы заключается в том, что в ней впервые из клеток тканей плотных и асцитных форм злокачественных новообразований на различных этапах канцерогенеза в аналитических и препаративных целях в клинике и эксперименте выделяются изоформы Nox и eNox. Определяются на оптическом спектральном уровне не только их NADPH зависимая О2продуцирующая, но и ферриHb-восстанавливающая активности.

Выдвигаются два новых подходa канцеротерапии (аутотерапии): 1) введение в постоперационном периоде данному опухоленосителю активированный in vitro супрол из сыворотки крови этого же больного; 2) для получения моно- или поликлональных антител против Nox из опухолевых клеток плотной или жидкой формы также в постоперационном периоде выделять Nox и вводить этому же больному. Таким образом будет нарушен физиологический статус мембран метастаз, в результате чего должен происходить лизис клеток и их гибель.

Цель и задачи исследования Целью данного исследования являлась разработка методов выделения, очистки изоформ Nox и eNox из различных типов опухолевых клеток и получение научных оснований для выдвижения новых подходов аутотерапии рака, которые можно применять для нейтрализации метастаз в постоперационном периоде. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Выделить и очистить Nox из клеток плотной опухолевой ткани лимфосаркомы человека подкожной локализации с определением ее оптико-спектральных характеристик, NADPH зависимой активностей в отсутствии и под влиянием нейроактивного пептида – галармина. Сравнить полученные показатели с показателями Nox из мембран эритроцитов донорской крови. 2.

Провести аналогичные исследования с Nox выделенной из плотной опухоли тонкой кишки человека и саркомы-37. 3. Определить на оптическом спектральном уровне свойства Nox из аденокарциномы толстой кишки челивека. 4. Определить характерные изменения уровня и активностей экстрацеллюлярной Nox (eNox), выделенной и очищенной из жидкости асцитной карциномы легких человека. 5. Провести аналогичные исследования для eNox из жидкости асцитной карциномы яичника женщин на различных этапах заболевания. 6. Определить характерные изменения eNox из жидкости асцитной карциномы Эрлиха у мышей на начальных и терминальных этапах развития болезни, с определением анти- и прооксидантного статусов. 7. Провести исследования для выявления эффекта галармина на активности Nox и eNox из различных типов опухолей. 8. Определить возможность противоопухолевого эффекта экзогенно введенного супрола при саркоме-45 у крыс.

Научная новизна работы 1. Из клеток опухолевой ткани саркомы-37 мышей, лимфосаркомы человека подкожной локализации, из аденокарциномы (АДК) тонкой кишки человека выделены фракции Nox (или цитохрома b558). По характерным максимумам и по форме оптические спектры поглощения эти Nox практически не отличаются от таковых Nox из клеток тканей здоровых мышей (селезенка, печень и эритроцитарные мембраны и т.д.). Есть некоторые отличия величин оптического спектрального индекса (A412/A530). Однако эта Nox обладает повышенной НАДPH-зависимой О2продуцирующей и пониженной ферриHb-восстанавливающей активностями in vitro по сравнению с показателями Nox из приведенных тканей здоровых мышей. а нейропептид галармин повышает активность этих Nox, которые являются рецепторами галармина. 2. Из брюшной жидкости асцитной карциномы Эрлиха (ЖАКЭ) у мышей, из жидкости асцитной карциномы яичника женщин (АКЯЖ), из асцитной карциномы легких (АКЛ) человека в терминальных стадиях канцерогенеза выделена экстрацеллюлярная Nox (еNox) с характерным дополнительным максимальным поглошением при 485 нм. По остальным оптико-спектральным показателям эти eNox практически не отличаются от таковых у eNox из сыворотки здоровых мышей или человека.

При этом NADPH зависимая О2-продуцирующая и ферриHb-восстанавливающая активност eNox из ЖАКЭ ниже таковой у eNox из сыворотки здоровых мышей. Однако содержание eNox из ЖАКЭ выше 8-10 раз. После внутрибрюшинного введения супрола (выделен из сыворотки белых интактных крыс и активирован in vitro следaми ионов Fe+3 in vitro) белым крысам, носителям саркомы-45, в лечебном режиме наблюдается снижение массы опухолевой ткани и числа очагов саркомы-45 подкожной локализации (3,3 раз). Это происходит на фоне приближения уровня Nox из клеток тканей, а также анти- и прооксидантного статусoв тканей животных к норме.

Использованием приведенных методов получения Nox, а также антиоксидантных металлопротеинов выявлены молекулярно-биохимические механизмы канцерогенеза (при указанных типах рака в клинике и эксперименте) на различных этапах его развития, ассоциированных с характерными изненениями уровней и активностей этих металлопротеинов. В частности показывается существенное повышение прооксидантного статуса и ослабление кислородного гомеостаза. Как первый возможный подход аутотерапии рака предлагается введение Nox или eNox, выделенных из опухолевой ткани опухоленосителя в постоперационном периоде самому больному вызывая образование у него антител против этих Nox (они легко доступные и локализованы на поверхности опухолевых клеток), которые могут вызывать лизис опухолевых клеток (метастаз) и их гибель. Как второй возможный подход аутотерапии рака предлагается введение в постоперационном периоде данному опухоленосителю супрола (после его активации in vitro), полученного из сыворотки крови того же опухоленосителя.

Научно-практическое значение работы 1.

Предложенные простые и доступные методы выделения и очистки Nox и eNox (как новые компоненты развития асцитной карциномы) из клеток тканей и асцитной жидкости злокачественных новообразований могут быть внедрены в онкологических центрах. 2. Путем определения характерных количественных и качественных изменений анти- и прооксидантных металлопротеинов для выявления его молекулярно-биохимических механизмов предложенные методы могут быть использованы на различных стадиях канцерогенеза. Эти изменения могут считаться факторами оценки эффективности канцеротерапии и пригодности используемых при лечении рака препаратов и методов. 3. Предложенные в постоперационном периоде подходы аутотерапии для нейтрализации опухолевых клеток (метастаз) могут быть внедрены в клиническую практику после проведения соответствующих предклинических испытаний. 4.

Полученные и очищенные до электрофоретически гомогенного состояния Nox и eNox из опухолевых клеток могут быть предложены для совместных исследований на современном научно-техническом уровне с целью выявления новых структурно-функциональных изменений этих ферментов как новых и чувствительных маркеров канцерогенеза на различных этапах его развития. 5. Приведенные исследования могут быть проведены и при других типах опухолеобразования.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных статей.

Структура и объем работы Диссертацонная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, разультатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 108 страницах, содержит 20 рисунков, 6 таблиц и список литературы из 189 наименований.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИСЛЕДОВАНИЯ

Используемые материалы, приборы и иные приспособления. Для выделения и очистки металлопротеинов крови и клеток контрольных и опухолевых тканей млекопитающих были использованы целлюлозы DE-52, KM-52 («Whatman», Англия), сефадексы DEAE A-50 и G- (“Pharmacia”, Швеция). Для определения супероксиддисмутазной или О2-продуцирующей активности Nox и супрола были использованы нитротетразолиевый синий (НТС), феназин метасульфат (ФМС), пирофосфат натрия, динатриевая или тетранатриевая соль NADPH. Для определения каталазной активности использовали перекись водорода и перманганат калия. Для приготовления буферных растворов использовали одно- и двухзамещенный фосфат калия (марки «чистый для анализа»). Для изменения рН растворов использовали соляную кислоту.

Электрофорез белков был осуществлен на приборе венгерского производства с соответствующими реактивами и приспособлениями. Остальные используемые реактивы (натрий хлористый, NaOH, KOH и др.) также были марки “чистый для анализа”. При гомогенизации был использован стеклянный гомогенизатор с тефлоновым пестиком. Для проведения ионообменной хроматографии были использованы стеклянные колонки со стеклянными фильтрами размерами:

430 см, 220 см, 115 см, а для гель-фильтрации – 390 см и 270 см. Для очищении эритроцитарных мембран, ядер, митохондрий и мембран клеток тканей были использованы центрифуги К-24 и К-70 («Veb MLW Zentrifugenbaum Engelsdorf», Германия).

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли общеизвестным методом вариационной статистики Стьюдента-Фишера с определением критерия достоверности «р». Оптические спектральные измерения осуществляли на спектрофотометре «Specord UV/VIS» (Германия) с длиной оптического пути 1 см при комнатной температуре.

Используемые методы. Для выделения и очистки металлопротеинов из эритроцитов и из клеток тканей мышей и крыс были использованы лицензированные способы [Симонян М.А. и др., 1997; Симонян Г.М. и др., 2001, 2008], с небольшим видоизменением, связанным с дополнитеильным размельчением плотной опухолевой ткани в жидком азоте.

Выделение изоформ Nox из эритроцитарных мембран крыс и мышей. Процедуру получения Nox осуществляли универсальным методом с использованием ионообменной хроматографии на целлюлозах KM-52, DE-52 [Симонян Г.М. и др., 2008]. Из крови мышей (по мл) или крыс (по 2 мл) эритроциты осаждали добавлением к ней физраствора (1:20 мл). После центрифугирования осажденных эритроцитов при (при 6000 об/мин, 5 мин) их подвергали гемолизу в воде (1:10 об/об). Эритроцитарные мембраны (ЭМ) осаждали центрифугированием гемолизата при 6000 об/мин (при рН 5,6) в течении 15 мин. Далее осажденные ЭМ повторно смешивали с водой (1:200 об/об) и после центрифугирования в аналогичных условиях осажденные ЭМ смешивали с водой (1:10) и осуществляли процесс солюбилизации суммарной фракции изоформ Nox ЭМ. После диализа против воды и центрифугирования смеси, из надосадочного раствора фракцию Nox кислого характера получали ионообменным хроматографированием сначала на колонках с КМ-52, а затем с ДЕ-52 целлюлозами, как это показано на примере получения Nox из клеток ткани С-37.

Выделение изоформ NADPH оксидазы (Nox) из мембран, митохондрий и ядер клеток селезенки, почек и печени мышей и крыс. Метод получения Nox из клеток тканей включает следующие процедуры. После промывания тканей (по 2 г) физиологическим раствором и взвешивания, гомогенизацию проводили в 0,25 М сахарозе (1г ткани в 10 мл сахарозы) стеклянным гомогенизатором с тефлоновым пестиком в течение 1 мин при 4оС. Ядра клеток селезенки (ЯКС) осаждали центрифугированием гомогената при 3000 об/мин в течение 10 мин.

Митохондрии осаждали после центрифугирования надосадочного раствора при 12000 об/мин в течение 15 мин. После промывания митохондрий водою (1: 200 об/об), солюбилизации фракции Nox, диализа надосадочного раствора и центрифугирования супернатант подвергали ионообменной хроматографии на целлюлозах КМ-52 и DE-52. Из последней колонки фракцию Nox элюировали 0,2 М КФБ. Мембраны клеток тканей осаждали центрифугированием полученного надосадочного раствора при 6000 об/мин при рН 5,6 в течение 15 мин. Далее осадки ядер и мембан промывали водой (1:100 об/об) и повторно центрифугировали (10000 об/мин, мин). Очищенные от следов сахарозы и других сопутствующих водорастворимых солей адра и мембраны смешивали с водой (1:5 об/об) и повторно гомогенизировали в аналогичном режиме.

После солюбилизации фракции изоформ Nox из очищенных ядер и мембран, удаления нерастворимых осадков центрифугированием и диализа надосадочных растворов против воды, фракции изоформ Nox из ядер и мембран клеток получали путем ионообменной хроматографии на колонках с целлюлозой КМ-52 (для удаления следов гемоглобина или других сопутствующих белков основного характера). Не задерживашиеся на колонке с КМ-52 белковые фракции далее подвергали ионообменной хроматографии отдельно на колонке с целлюлозой ДЕ- (уравновешенной 0,004 М КФБ). После промывания колонки сначала водой, а затем 0,01 М калий фосфатным буфером рН 7,4 (КФБ), изоформы Nox кислой природы из ядер и мембран элюировали 0,2 М КФБ. Количество Nox определяли путем измерения плотности максимального оптического поглощения раствора Nox при 530 нм ( полоса поглощения). Удельное содержание Nox из мембран клеток тканей определяли из рассчета на 1 мл раствора Nоx, полученного из 1 г ткани и мл эритроцитов [Симонян Г.М. и др., 2008].

Выделение фракции СОД1 и каталазы из цитозоля эритроцитов крыс и мышей.

Суммарную фракцию СОД1 (Cu,Zn-СОД) и каталазы из цитозоли эритроцитов выделяли после центрифугирования гемолизата эритроцитов при рН 5,6, диализа против воды, центрифугирования и ионообменной хроматографии супернатанта на колонке с целлюлозой ДЕ-52, из которой суммарную фракцию СОД1 и каталазы элюировали 0,04 М КФБ [Simonyan G.M. et al., 2011].

Выделение суммарной фракции СОД1, СОД2 и калалазы из цитозоля клеток селезенки крыс и мышей. Суммарную фракцию СОД1, СОД2 (Mn-СОД) и каталазы из цитозоля селезенки выделяли после диализа последней против воды, центрифугирования и ионобменной хроматографии супернатанта на целлюлозе ДЕ-52 и элюации этой фракции 0,1 М КФБ [Simonyan G.M. et al., 2011].

Выделение фракции Nox кислой природы из клеток плотной опухолевой ткани:

саркомы-37 мышей, аденокарциномы тонкой кишки человека и лимфосаркомы человека.

Nox из клеток плотной опухолевой ткани саркомы-37 (С-37) подкожной локализации, аденокарциномы (АДК) толстой кишки человека человека и лимфосаркомы подкожной локализации выделяли лицензированным способом Симоняна Г.М., и др. (2008).

Саркома-37 (С-37) получена из прививаемой опухоли-карциномы молочной железы мышей. Кусочек опухолевой ткани (18-22 г) в стерильных условиях очищается от некротических участков, микроразмельчителем ткани в физрастворе (1:5 об/об)приготавливается гомогенная масса,. Полученный гомогенат вводится мышам подкожно, в объеме 0.3 мл.

Декапитацию белых мышей носителей С-37 и контрольной группы (по 6 животных) осуществляли на седьмой и четырнадцатый дни опыта. Опухоль С-37 подкожной локализации отделяли, очищали от жировых и других остатков, промывали физраствором и взвешивали (по 7 -10 г). Свеженабранная опухолевая ткань АДК тонкой кишки человека с давностью заболебания 2-3 г была (доставлена из онкологического диспансера г.Гюумри) очищена от жировых остатков и после промывания физраствором (1:100 об/об) и водой (1:500 об/об) ткань была взвешена (по 7- г). Свеженабранная опухолевая ткань лимфосаркомы (из подмышек) человека подкожной локализации (с давностью заболевания 3-4 года) также была доставлена из онкологического диспансера г.Гюмри, очищена аналогичным образом и взвешена (по 10 г). Гомогенизацию размельченной опухолевой ткани осуществляли в 0,25 М растворе сахарозы (50 мл) при 4о со скоростью вращения ножей 1000 об/мин в течение 1 мин. После центрифугирования гомогената (10 000 об/мин, 20 мин) осадок повторно гомогенизировали в воде (1:100 об/об) и после повторного центрифугирования гомогената в аналогичном режиме осадок промывали водой (1:1000 об/об) и окончательно собирали последующим ценрифугированием. После смешивания осадка с водой (1:10 об/об) и гомогенизации осуществили процесс солюбилизации суммарной фракции Nox. После диализа раствора Nox против воды и центрифугирования при 13 000 об/мин в течение 20 мин супернатант подвергали ионообменной хроматографии на колонке с целлюлозой КМ-52 (уравновешенной 0,002 М калий-фосфатным буфером, рН 7,4) для удаления следов гемоглобина и других белков основного характера. Не задержавшуюся на КМ-52 фракцию Nox далее подвергали иоонобменной хроматографии на колонке с целлюлозой DE-52. Из последней колонки фракцию Nox кислой природы элюировали 0,2 М КФБ. Далее эту фракцию подвергали гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-100 (superfine) размером 490 см. Молекулярную массу изоформ Nox кислого характера определяли методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-100 (superfine), используя в качестве стандартов следующие белки: цитохром С из сердца быка, Cu,Zn-СОД из печени быка, церулоплазмин и трансферрин из сыворотки плацентарной крови женщин, каталаза из печени быка. Был использован также декстран синий для определения свободного объема сефадекса.

Влияние БПП-1 на NADPH-зависимую О2-продуцирующую и ферриHbвосстанавливающую активности изоформ Nox кислой природы из клеток лимфосаркомы.

БПП-1 (5 мкг) инкубируется в течение часа с изоформами (по 3 мл) Nox кислой природы из клеток лимфосаркомы при 36о, затем определяются NADPH-зависимая О2-продуцирующая и ферриHbвосстанавливающая активности изоформ Nox до и после гель-фильтрации этих Nox на колонке с сефадексом G-25 (270см) при 4о (объем разбавленного раствора Nox после гель-фильтрации уменьшаем вакуумной откачкой до 3-х мл, т.к. до гель-фильтрации объем раствора составлял мл).

Выделение фракций экстрацеллюлярной NADPH оксидазы из носителей асцитной карциномы: Эрлиха у мышей, яичника у женщин и легких у человека. Асцитную карциному Эрлиха (АКЭ) у белых мышей, массой 19-22 г вызывали внутрибрюшинным введением 0,3 мл асцитной жидкости (около 1 млн опухолевых клеток). Через 10 и 16 дней после декапитации животных производился забор АКЭ. Мутные, слаборозовые жидкости (по 40 мл ) асцитной карциномы легких человека (АКЛ, шесть больных, 61-74 лет, с давностью заболевания 2,5 и года) и асцитной карциномы яичника женщин (АКЯЖ, также по шесть больных, 46-55 лет, с давностью заболевания 1,2 и 3,5 года) были доставлены из онкологического диспансера г.

Гюмри. еNox слабокислой природы из АКЭ, АКЛ, АКЯЖ и сыворотки донорской крови человека были получены способом, разработаным Симоняном Г.М. и др. (2001). Следы эритроцитов и плазменных клеток из жидкостей приведенных асцитных карцином и из сыворотки донорской крови (СДК) были удалены путем их центрифугирования при 14000 об/мин в теченив 15 мин. Супернатанты инкубировали в аэробных условиях в течение 4-х суток при 4о и после их центрифугирования в приведенных условиях и разбавления водой (15-20 раз) фракции eNox выделяли ионообменной хроматографией надосадочного раствора на сефадексе ДЕАЕ А- с последующим элюированием 0,04 М КФБ. После вторичного разбавления элюата водой (20 раз) и ионообменной хроматографии на колонке с целлюлозой ДЕ-52, фракцию eNox из АКЭ, АКЛ, АКЯЖ и СДК элюировали 0,04 М КФБ. Далее проводится гель-фильтрация растворов Nox на сефадексе G-100, собираются центральные фракции и концентрируются. Уровень еNox определяли путем измерения характерной для нее оптической плотности при А530 ( полоса поглощения). Удельное содержание еNox из АКЭ, АКЛ, АКЯЖ и СДК определяли из рассчета на 1 мл раствора Nox, полученного из 1 мл жидкости асцитной карциномы.

Выделение фракции супрола из сыворотки крови крыс и его активирование in vitro.

Фракции супрола из сыворотки крови животных выделяли по методике Симонян Г.М. и др. (1999).

В частности, отдиализованную против воды сыворотку (по 40 мл) подвергали ионообменной хроматографии на ДЕ-52 целлюлозе, уравновешенной 0,005 М КФБ, рН 7,4. Неактивный супрол элюировали 0,01 М КФБ, и пропускали через биогель Р-150, уравновешенный 0,01 М КФБ.

Центральную слабоопалисцирующую фракцию супрола собирали, концентрировали и активировали (для автономного продуцирования О2) присоединением ионов Fe+3 (510-7 M).

Следы неприсоединившихся к белку ионов железа удаляли пропусканием белка через колонку с ДЕ-52 целлюлозой. Супероксидпродуцирующую активность супрола определяли нитротетразолиевым синим методом. Рассчеты показали, что активный супрол концентрации мкг/мл продуцирует до 510-6М О2 за 1 мин при 250.

Противоопухолевое действие активного супрола. Противоопухолевое действие активного супрола было испытано в лечебном режиме при саркоме 45 (С-45) у крыс. Ткань С-45 (10 г) размельчали, не повреждая клетки, в 20 мл физиологического раствора и инокулировали 1 раз (по 0,5 мл) [Симонян Г.М. и др. 1996]. Белые беспородные крысы-самцы массой 200-220г были разделены на три группы (по 8 в каждой). Ткань С-45 (10 г) размельчали, не повреждая клетки, в 20 мл физиологического раствора [Симонян Г.М. и др. 1996]. Kрысам первой опытной группы (ОГ-1) подкожно вводили по 1 мл смеси опухолевых клеток. Животным ОГ-2 вводили клетки С- и через 72 ч им в том же объеме вводили активный супрол (120 мкг/мл) также подкожно, 4 раза через 2 суток. Крысы контрольной группы (КГ) вместо супрола получали по 1мл физиологического раствора в аналогичных условиях.

Определение О2-продуцирующующей активности изоформ Nox. О2-продуцирующую активность изоформ Nox кислой природы определяли нитротетрозолиевым синим (НТС) методом, путем вычисления процента стимулирования образования формазана (при 560 нм) в результате восстановления НТС супероксидными радикалами. За единицу О2-продуцирующей активности принимали количество белка, которое стимулирует образование формазана на 50%. При этом NADPH зависимую О2-продуцирующую активность цит b558 определяли заранее инкубировав этот гемопротеин с NADPNa4 (10-4 М) в течение 20 мин при 4о. В этой реакционной смеси (3 мл) величина плотности поглощения Nox (при 530 нм) составляла 0,03.

Определение ферриHb-восстанавливающей активности изоформ Nox.

Ферригемоглобин (ферриHb)-восстанавливающие активности изоформ Nox определяли основываясь на том, что при аэробном инкубировании Nox и ферриHb, происходит восстановление ферриHb до ферроHb in vitro [Simonyan G.M. et al., 2006]. В частности, был использован электрофоретически гомогенный ферриHb из эритроцитов крыс. К 3 мл этого ферриHb (А565=0.9) добавляли Nox из различных источников (эритроциты, селезенка, печень и опухоль С-37 мышей) с объемом 0,1 мл и с Ао530=0,3 (плотность оптического поглощения -полосы на оптическом спектре матричного раствора изоформ Nox). Для определения влияния БПП-1 заранее инкубировали Nox и БПП-1 в течение 15-20 мин при 20о (так поступали и при определении влиянии БПП-1 на NADPH зависимую О2-продуцирующую активность Nox), а потом дабавляли ферриHb и без перемешивания ставили реакционную смесь в термостат при 36о в течении 5-6 ч. Далее реакционные смеси поместили в стеклянные трубки (51 см) и регистрировали кинетику снижения изменения плотности -поглощения (при 565 нм) ферриHb, инкубируя реакционную смесь в течение 4-х ч при 20о. Постепенное восстановление ферриHb до ферроHb сопровождается снижением плотности -поглощения ферриHb. Это снижение прямо прапорционально образованию ферроHb (при 555 нм). За единицу ферриHb-восстанавливающей активности принимается количество цит b558, вызывающее снижение плотности -поглощения ферриHb до 0,05 в течение 30 мин при 20о.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

восстанавливающвй активности изоформы Nox кислой природы из клеток опухолевой ткани саркомы-37 под влиянием богатого пролином полипептида (БПП-1) in vitro Впервые получены фракции изоформ Nox (цитохрома b558) из клеток опухолевой ткани саркомы-37 (С-37) мышей, а также из клеток селезенки, печени и эритроцитарных мембран здоровых мышей. Фракция Nox из приведенных тканей получается с выходом 65-68%.

Рассчетное удельное содержание (плотность поглощения при 530 нм 1 мл Nox, полученного из 1 г ткани, таково: 0.45 ± 0.03 (для Nox из клеток С-37); 8,10 ± 0,5 (для Nox из клеток селезенки);

4,12 ± 0.3 (для Nox ЭМ); 1,21 ± 0,1 (для Nox из клеток печени). Эти данные свидетельствуют о том, что по сравнению с клетками других тканей, в клетках С-37 содержание изоформ Nox намного ниже. Полученные Nox из клеток С-37, из клеток печени, селезенки и из ЭМ в окисленном и в восстановленном состояниях показывают характерные для Nox из тканей крыс или крови человека оптические спектры поглощения (рис 1). После восстановления дитионитом натрия появляется характерное для Nox поглощение при 558 нм (-полоса поглоюения). Однако по величинам оптических спектральных индексов (А 412/А530) фракции изоформ Nox кислой природы у мышей несколько отличаются. Этот индекс для Nox составляет: из клеток печени 11,0; из ЭМ – 9,8; из клеток селезенки – 8,2 и из клеток С-37 – 11,6. Все полученные фракции изоформ Nox из тканей мышей (включая и Nox из клеток Сявляются водорастворимыми гемопротеинами, и все они обладают как NADPH зависимой О2-продуцирующей, так и ферриHb-восстанавливающей активностями (рис 2,3).

Рис. 1. Оптические спектры поглощения фракции изоформ Nox кислого характера:

а – из клеток печени в окисленном (1) и в восстановленном (2) состояниях;

б – из ЭМ в окисленном (1) и в восстановленном состояниях (2);

в – то же самое из клеток селезенки;

Рис. 3. Кинетические кривые снижения плотности -поглощения ферриHb (при 565 нм) под влиянием фракции Nox кислого характера из:

а – клеток С-37 (1), печени (2), ЭМ (3), селезенки (4) и после 20 мин инкубирования Nox из С-37 с БПП-1 (5), p0,05, n=6.

б – скорость снижения -полосы поглощения Nox (tg наклона угла кинетических кривых) под влиянием фракции изоформ Nox: из селезенки (1), ЭМ (2), печени (3), из клеток С-37 (4), из клеток С-37, инкубированые в течение 20 мин с 4 мкг БПП-1 (5).

По сравнению с активностью Nox из печени, селезонки и ЭМ фракции Nox из клеток С-37 обладают высокoй NADPH зависимой О2-продуцирующей активностью. Интересно то обстоятельство, что низкие дозы БПП-1 (4мкг) повышают NADPH зависимую О2-продуцирующую активность изоформ Nox из клеток С-37 in vitro (до 16,6 ± 2,1%, Р0,05). По сравнению с другими изоформами Nox кислого характера, Nox из клеток ткани С- обладает низкой ферриHb-восстанавливающей активностью, как это показано на примере снижения плотности максимального оптического поглощения ферриHb с характерной кинетической зависимостью (рис. 3 а). Наклон угла этих кинетических кривых (А565/ч) – tg, выше у Nox из клеток селезенки, а затем из ЭМ. Nox из клеток С-37 обладают сравнительно низкой ферриHb-восстанавливающей активностью. Инкубирование Nox из клеток С-37 с БПП-1 (также до 4мкг) вызывает существенное повышение ее ферриHb-восстанавливающей активности (рис 3, б). Нетрудно заметить, что возможно и этим механизмом БПП-1 проявляет антиопухолевый эффект, вызывая стимулирование кислородного гомеостаза опухолевых клеток 2. Ассоциирование богатого пролином полипептида – галармина, с двумя изоформами Nox из клеток опухолевой ткани лимфосаркомы человека Из клеток ткани лимфосаркомы человека подкожной локализации (по 10 г) с давностью заболевания 3-4 года по приведенному выше способу выделяли суммарную фракцию Nox, которая имеет характерные для Nox максимальные оптические поглощения и формы оптических спектров После гель-фильтрации на сефадексе G-100 суммарной фракции Nox из клеток ткани лимфосаркомы получали изоформы Nox с повышенной молекулярной массой (цит b1558) до 95- кДа и пониженной молекулярной массой (цит b2558) – 60-70 кДа. Оптические спектры поглощения (УФ и видимой области) фракции этих Nox кислой природы (из колонки с целлюлозой DE- также элюируется 0.2 М КФБ) приведены на рис. 5,6. Оптический спектральный индекс (А 412/А530) для цит b1558 составляет 7.5, а для цит b2558 – 10.0. С другой стороны, отношение А280/А412 для цит b1558 составляет 2.6, а для цит b2558 – 1.6 (рис. 4). После гель-фильтрации этой фракции на колонке с сефадексом G-100 и концентрации на колонке с целлюлозой DE-52 (уравноешенной 0.002 М КФБ) получали по 3 мл фракции цит b1558 с Ао530=0,20 и 6 мл цит b2558 с Ао530=0,24. Таким образом, в результате обработки на колонках с DE-52, КМ-52, G-100 и повторно на DE-52 потеря цит b558 составляет около 30%. NADPH-зависимая О2-продуцирующая активность вышеуказанных Nox повышается после их часовой инкубации с БПП-1. Эта активность практически не изменяется после гель-фильтрации инкубационного раствора цит b1558 с БПП-1 на колонке с сефадексом G-25 (рис. 5-а). Аналогичным образом повышается и NADPH-зависимая О2-продуцирующая активность цит b2558 после инкубации с БПП-1 при тех же условиях (рис. 5-б).

С другой стороны, при инкубации с БПП-1 3 мл БПП-1 инкубировали с цит b1558 и цит b2558 с А530=0.2 в течение часа при 36о (0.5 мл, 5 мкг) повышается ферриHb-восстанавливающая активность цит b1558 и цит b2558. Эта активность не понижается и после гель-фильтрации инкубационного раствора на сефадексе G-25 и концентрирования до объема белка, который был до процесса гель-фильтрации (рис. 6-а, б).

Рис.4. Oптические спектры поглощения цит b1558 (а) и цит b2558 (б) из клеток опухолевой ткани лимфосаркомы человека в окисленном (1) и восстановленном состояниях (2).

Рис.5. Фракции изоформ цит b1558 (а) и цит b а – NADPH-зависимая О2-продуцирующая активность цит b1558 (1); после его часовой инкубации (по 0.2 мл, с Ао530=0,20) с БПП-1 (5 мкг, 0,5 мл) при 36о (2); после гель-фильтрации b1558 с БПП-1 на сефадексе G-25 и концентрирования до прежнего объема (3).

Рис.6. ФерриHb-восстанавливающая активность фракции изоформ Nox (цит b1558 и цит b2558) из клеток ткани лимфосаркомы человека:

а – ферриHb-восстанавливающая активность цит b1558 (1) I и после инкубации последнего (0. мл, с Ао530=0,20) с 0,5 мл БПП-1 (5 мкг) при 36о (2) и после гель-фильтрации смеси на сефадексе G-25 (3).

б – то же самое для цит b2558. n=6, р=0,01; 0,05 и 0,05 для 1-3, соответственно.

Факт практической неизменности вышеназванных активностей изоформ b558 под влиянием БПП-1 после гель-фильтрации на сефадексе G-25 свидетельствует о том, что БПП-1 ассоцируется с изоформами цит b1558 и цит b2558 из клеток опухолевой ткани лимфосаркомы человека и связь цит b558 с БПП-1 не расщепляется в результате гель-фильтрации.

3. Оптические спектральные характеристики и активности фракции Nox из клеток ткани аденокарциномы тонкой кишки человека. Из клеток аденокарциномы (АДК) тонкой кишки человека (по 7 г) получали фракцию Nox кислой природы (пo 8 мл, c A530 = 0,2 ± 0,04), которая имеет характерные для Nox максимальные оптические поглощения и формы оптических спектров в видимой и ультрафиолетовой областях. В окисленном состоянии Nox из АДК кишки имеет характерные максимальные оптические поглощения при 530, 560, 412 и 275 нм. Для сравнения приведены аналогичные показатели Nox кислой природы из ЭМ человека (рис.7). Обе Nox (из ЭМ и из клеток АДК) отличаются по величинам оптических спектральных индексов (А412/А530) для Nox ЭМ – 10,2, а для Nox из клеток АДК – 4,4.). Это свидетельствует о том, что окислительно-восстановительные характеристики Nox из ЭМ и АДК несколько отличаются.

Удельная NАДРН-зависимая О2-продуцирующая активность Nox из ЭМ на 25,4 ± 2,2% (P0,05) меньше таковой у Nox из АДК. Однако, ферриНb-восстанавливающая активность цит b558 из ЭМ на 30.2% ± 3,1% (Р0,05) выше таковой у Nox из АДК (рис.7).

Эти результаты свидетельствуют о том, что Nox из АДК имеет некоторые качественные отличия по сравнению с Nox из ЭМ.

4. Экстрацеллюлярная NADPH оксидаза из асцитной карциномы Эрлиха и дисбаланс между прооксидантными и антиоксидантными металлопротеинами клеток тканей мышей.

По сравнению с интактными показателями у мышей, носителей асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) в подавляющем большинстве наблюдается резкое повышение уровня изоформ Nox из мембран клеток селезенки (МКС), мембран клеток печени и почек, а также ЭМ (16-191%).

Снижается только уровень экстрацеллюлярной NADPH оксидазы из сыворотки крови мышей (27, %), носителей АКЭ. Резко повышается и их NADPH зависимая О2-продуцирующая активность (в среднем от 23% до 164%). У мышей, носителей АКЭ, ферриHb-восстанавливающая активность заметно снижается (12-41 %). При этом наблюдается неадекватное изменение уровня и активности Nox в мембранах клеток приведенных тканей. На этом фоне активность Cu,Zn-СОД эритроцитов и суммарная Cu,Zn-СОД и Мп-СОД активности печени, почек и, особенно, селезенки повышается до 2,16 раз. Повышение СОД-активности является ответом адаптационных механизмов клеток против резкого повышения уровня О2. С другой стороны, у мышей-опухоленосителей активность каталазы в эритроцитах и печени снижается, но повышается в клетках почек и, особенно, в клетках селезенки (69,1± 6,5 %, р0,02), Возможное увеличение уровня каталазы в клетках почек и, особенно, селезенки ассоциировано с увеличением активности СОД для расщепления продуцируемой перекиси водорода. Оптические спектральные характеристики фракций Nox из мембран клеток в подавляющем большинстве не отличаются от таковых у Nox из мембран клеток тканей мышей, носителей АКЭ. Впервые из асцитной жидкости АКЭ получена изоформа еNox слабокислой природы с характерными для экстрацеллюлярной Nox из сыворотки млекопитающих оптическими спектральными свойствами (имеется характерный для eNox максимум оптического поглощения при 485 нм). Фактически, при АКЭ in vivo для пролиферации и развития опухолевых клеток основным источником продуцирования О2 является экстрацеллюлярная Nox. Чрезмерное повышение (до 8-10 раз) уровня eNox и,соответственно, продуциривание О2 этим ферментом на 15-16-ый день опыта по сравнвнию с показателями на 9-10 день опыта, может повысить фон оксидативного повреждения этих клеток, вызывая гибель животных.

5. Повышение уровня экстрацеллюлярной NADPH оксидазы в жидкосте асцитной карциномы легких человека Из асцитной карциномы легких человека (АКЛ) с давностью заболевания 2,5 и 3 года впервые выделена фракция eNox, которая имеет характерные для Nox оптические спектральные показатели (рис.8). Наряду с максимумами оптического поглощения в окисленном (560, 530, нм) и в восстановленном (558, 525 и 418 нм) состояниях, имеется и характерное для eNox сыворотки донорской крови оптическое поглищение при 485 нм. По форме оптических спектров eNox из АКЛ не отличается от eNox из СДК. При давности заболевания 2,5 года удельное содержание eNox из АКЛ (плотность максимального оптического поглощения -полосы при мн) выше таковой у eNox из СДК на 60,1 ± 7,3% (р0,05), а при давности заболевания до 3 года рост eNox повышается до 75,8 ± 6,4%. Наряду с этими данными, NADPH зависимая О2продуцирующая активность eNox из АКЛ практически близка к таковой у eNox из СДК (увеличена всего на 8,3 ±1,1%, р0,03). С другой стороны, ферриHb-восстанавливающая активность eNox из АКЛ ниже таковой у eNox из СДК на 21,5± 4,4 % (р0,05).

Снижение ферриHb-восстанавливающей активности у eNox из АКЛ свидетельствует об определенном ослаблении кислородного гомеостаза при АКЛ (ферриHb или метHb не способны перенести молекулярный кислород к клеткам [Della R.F. et al., 1995]). При этом факт слабого покраснения жидкостной среды карциномы легких свидетельствует о том, что при накоплении этой жидкости в легких происходит снижение стабильности эритроцитов и выход из них гемоглобина.

Механизм формирования eNox пока не определен, однако это имеет место при таких патологических состояниях, когда наблюдается снижение стабильности эритроцитов в результате перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот эритроцитарных мембран (лимфобластический и миелобластииеский лейкозы [Симонян Г.М. 2002], саркома-45 [Симонян Г.М. и др.2005], интоксикация тяжелыми металлами [Сираканян М.С. и др., 2006], сердечнососудистые заболевания [Алексанян Серг.С. и др., 2003]). Фактически для роста АКЛ определенную роль играют не только интрацеллюларные [Juhasz A. et al., 2009], но и экстрацеллюлярные О2, продуцируемые eNox в жидкостной среде, в которой находятся клетки карциномы легких человека.

6. Уровень и активности фракции экстрацеллюлярной NADPH-оксидазы из асцитной карциномы яичника женщин (АЯКЖ) на различных стадиях заболевания Из 20 мл жидкости АКЯЖ со сроком давности 1,2 года получается по 10 мл фракция eNox с выходом до 68% и плотностью оптического поглощения при 530 нм (-полоса поглощения) равной 0,4 оптической единицы, а со сроком давности заболевания 3,5 года – 0,58. Этот показатель для донорской крови составляет 0,15 оптических единиц. Вышеуказанные eNox имеют характерные для eNox из других источников оптические спектральные показатели. В окисленном состоянии в видимой области спектра наряду с максимумами оптического поглощения при 560, 530, 412 нм имеется и характерное для eNox сыворотки донорской крови оптическое поглощение при 485 нм, а в восстановленном состоянии максимумы оптического поглощения наблюдаются при 558, 525 и 418 нм. Однако, удельное содержание eNox из жидкости АКЯЖ (плотность максимального оптического поглощения -полосы при 530 мн) выше таковой у eNox из СДК при давности заболевания 1,2 года в 2,6 ± 0,3 раза (р0,05), и 3,8 ± 0,2 раза (р0,05) при давности заболевания 3,5 года. По сравнению с eNox из СДК NADPH зависимая О2-продуцирующая активность eNox из жидкости АКЯЖ увеличена на 10,4±1,3% (р0,03) и 16,3±2,5% (р0,03) при давности заболевания 1,2 и 3,5 года соответственно (рис.9-а). Оданко, по сравнению с eNox из СДК ферриHb-восстанавливающая активность eNox из ЖАК снижена на 14,1 ± 1.1% (р0,05) и 22,3 ± 2,0% (р0,02) при давности заболевания 1,2 и 3,5 года соответственно (рис.9-б).

При АКЯЖ снижение ферриHb-восстанавливающей активности у eNox из АКЯЖ, особенно с давностью заболевания 3,5 года, свидетельствует об определенном ослаблении кислородного гомеостаза. При этом факт слабого покраснения жидкостной среды карциномы яичника с давностью заболевания 1,2 года и существенное увеличение этой окраски с давностью заболевания 3,5 года свидетельствуют о том, что накопление eNox в яичнике женщин также происходит на фоне существенного снижения стабильности эритроцитов и увеличения степени их гемолиза. Механизм формирования eNox пока не определен, однако это наблюдается при таких патологических состояниях, когда имеет место снижение стабильности эритроцитов в результате перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот эритроцитарных мембран (повышение текучести эритроцитов) активными формами кислорода, уровень которых резко увеличивается при канцерогенезе [Liu P. et al., 1997; Kkoev V.P., 1990;

Girotti A.W. et alа, 1985]. Фактически для роста опухолевых клеток определенную роль играет не только интрацеллюлярные, но и экстрацеллюлярные О2, продуцируемые eNox в жидкости АКЯЖ. Возможно, введением в жидкостную среду карциномы антиоксиданта (для снижения уровня О2) или, наоборот, прооксиданта – супрола для чрезмерного увеличения уровня супероксидов, можно изменить окислительно-восстановительный статус [Gius D. et al., 2006] опухолевых клеток АКЯЖ, вызывая их гибель.

7. Механизмы противоопухолевого действия супрола Активированный супрол из сыворотки крови крыс (150 мкг/мл) продуцирует до 310- М/мин О2 при 250. Активный супрол является уникальным метаболитом продуцирования О2.

Этот процесс неперерывный и идет как в гомогенной (в растворе), так и в гетерогенной фазaх (когда при его длительном хранении происходит самоагрегация). При хранении (при 1-20 в течение месяца) потеря активности супрола составляет всего 10-12%. Супрол является энергичным, естесственным источником О2 и приемлемым для различных биосистем NADPH содержащим липопротеином высокой плотности и не оказывает нежелательных побочных эффектов (аллергия, токсикоз и пирогенность после введения крысам даже в повышенных дозах).

Через 3 дня после трансплантации опухолевых клеток, под влиянием внутрибрюшинно введенного активного супрола (120 мкг/мл по 1 мл подкожно 4 раза через 2 суток в течение дней) белым крысам, носителям саркомы-45 (С-45), наблюдается снижение массы и числа распространенности (до 3-3,3 раз) подкожных очагов С-45 (табл.1). При С-45 после промывания ЭМ практически не теряют свой красноватый оттенок, в отличие от ЭМ контрольной группы (в последнем случае ЭМ нормально промываются 0,04 М КФБ, приобретая слаборозобый цвет).

Действительно, при С-45 после солюбилизации Nox из ЭМ, оптический спектр поглощения имеет смешанную форму спектрoв гемоглобина и Nox. Удаление из примеси гемоглобина достигалось пропусканиeм фракции комплекса Hb с Nox через КМ-52, что привело к возвращению спектра При С-45 (ОГ-1) наблюдается существенное повышение уровня, NADPH зависимой О2продуцирующей активности Nox из сыворотки крови (еNox), а также из ЭМ, МКС и ядер клеток селезенки (ЯКС) по сравнению с аналогичными показателями в ОГ-2 (под влиянием супрола) и с контролем (табл. 2, 3). Механизм такого воздействия супрола, скорее всего, связан с воздействием продуцируемых супролом супероксидов на мембраны опухолевых клеток со стимулированием липидной пероксидации ненасыщенных жирных кислот этих мембран, с измемением окислительно-восстановительного статуса этих клеток, и, как следствие, их лизисом.

Введенный интактным животным активный супрол приводит к незначительному увеличению числа лейкоцитов в периферической крови (11-14%), в то же время после введения активного супрола животным, носителям С-45 (ОГ-2), наблюдается повышение уровня лейкоцитов почти до уровня здоровых животных (уровень лейкоцитов больных животных повышается на 38-42%). По-видимому, при подавлении роста опухолей немаловажную роль играет стимуляция лейкопоэза, приводящая к повышению сопротивляемости организма.

У крыс, носителей С-45, ферриHb-восстанавливающая активность изоформ Nox из ЭМ, МКС, ЯКС и сыворотки заметно снижается в ОГ-1 (табл.4), что свидетельсывует о существенном нарушении кислородного гомеостаза при С-45. Возможно, это ассоциировано с повышенным употреблением молекулярного кислорода в процессе продуцирования О2 вышеуказанными Nox.

Под влиянием введенного активного супрола наблюдается приближение ферриHbвосстанавливающeй активности изоформ Nox из ЭМ, МКС, ЯКС и сыворотки к норме (ОГ-2, табл 4). Однако в ОГ-2 полученные данные не выявляют механизма регулирования кислородного гомеостаза супролом. При С-45 адаптационные механизмы крови вырабатывают соответственное повышение активности СОД и, особенно, каталазы в приведенных тканях (ОГ-1), против повышенного уровня О2 и перекиси водорода. Введенный супрол (ОГ-1) несколько снижает эти активности, приближая их к норме при СОД, оставляя активность каталазы выше нормы (табл.5).

При чрезмерном воздействии продуцируемые супролом О2 могут инициировать липидную пероксидацию фосфолипидных остатков самого супрола (они ответственны за растворимость этого липопротеина), вызывать его самоагрегацию и снижение его уровня (ОГ-1). Однако, и в этом состоянии потери О2-продуцирующей активности супрола не происходит. Более того, наблюдается некоторое увеличение этой активности в ОГ-1. В ОГ-2 экзогенно введенный супрол, полученный из сыворотки крови крыс, вероятно компенсирует потерю уровня эндогенного супрола, тем самым вызывая приближение его к норме (табл. 6).

Вес oпухоли и число очагов С-45 в ОГ-1 и ОГ-2 (p0,05, n=6) Уровень (плотность оптического поглощения при 530 нм) Nox в КГ, ОГ-1 и ОГ-2 (p0,03, NADPH зависимая О2 -продуцирующая активность изоформ Nox в КГ, ОГ-1 и ОГ-2 (p0,01, ФерриHb-восстанавливающая активность изоформ Nox в КГ, ОГ-1 и ОГ-2 (p0,01, n=6) Активности СОД и каталазы в КГ, ОГ-1 и ОГ-2 (р0,05, n=6) Цитозоль 304,8±45,4 2100±201,7 355,7±51,0 8480±324,7 325,8±21,8 3410±334, эритроцитов Цитозоль 210,5±32,0 430,0±42,8 273,3±50,3 736,6± 61,8 223,2±32,9 584,5± 63, селезенки Уровень и О2 -продуцирующая активность супрола в КГ, ОГ-1 и ОГ-2 (р0,02, n=6).

активность Супероксиды губительно действуют на опухолевые клетки, в которых заметно понижен уровень антирадикальных защитных систем. Их действие на нормальные клетки менее ощутимо, так как в них имеется достаточное количество антиоксидантных защитных систем. Мы использовали активный супрол, полученный из сыворотки крови здоровых крыс. Однако использование активированного супрола из сыворотки крови крысы, носителя С-45, в постоперационном периоде было бы более приемлемым так как исключает перенос инфекции, а также других нежелательных явлений (антигенность, аллергияи др.). С другой стороны, использование супрола носителя опухоли в постоперационном периоде увеличивает шансы его применения в клиническую практику, как эффективного, природного и энергичного противоопухолевого средства.

8. Новые подходы аутотерапии рака в постоперационном периоде Стратегией антираковой терапии является применение цитотоксических средств, вызывающих повышение уровня АФК в клетках опухолевой ткани и подавление активности антирадикальной защитной системы опухолевых клеток [Fang J. et al., 2007]. Повышение продуцирования АФК непосредственно в раковых клетках путем снижения активности Mn-СОД или активности Nox вызывает апоптоз этих клеток и может быть рекомендовано как возможное терапевтическое средство [Afanas'ev I.B., 2010]. С другой стороны, мембранные субъединицы Nox локализованы на поверхностных участках мембран нормальных и опухолевых клеток и ответственны за продуцирование О2 и их выход в экстрацеллюлярную среду [Heijenski L.L. et al., 2004; Yang S. et al., 2000; Younagson C. et al., 1997; Mzukami Y. et al.]. Однако NADPH зависимая О2-продуцирующая активность изоформ Nox из опухолевых клеток и асцитных жидкостей существенно повышена, но по сравнению с показателями Nox нормальных клеток снижена их ферриНb-восстанавливающая активность. При этом содержание eNox существенно увеличивается при лимфобластическом и миелобластическом лейкозах у человека [Симонян Г.М. и др., 2002].

Введенный крысам супрол, полученный и активированный из сыворотки плацентарной крови человека, увеличивает количество лейкоцитов, подавляет рост опухолевых клеток лимфосаркомы и саркомы М-1 в среднем на 52% и 31% соответственно. При этом под влиянием 15 мкг/мл супрола наблюдается повышение пролиферации куриных эмбриональных клеток. Однако при концентрации 50 мкг/мл и выше супрол, из-за повышенного продуцирования О2, вызывает лизис этих клеток [Симонян М.А. и др., 1996]. Как было показано, продуцируемые супролом О вызывают противоопухолевый эффект у крыс при саркомы 45. Исходя из того, что практически из всех типов раковых клеток мы выделяем изоформы Nox появляется возможность получения полии моноклональных антител (гамма-глобулинов) против этих Nox. Эти антитела, нейтрализуя Nox, локализованную на поверхности мембран опухолевых клеток (метастаз), могут вызывать их гибель. Предлагаются следующие подходы аутотерапии рака (нейтрализация мигрирующих раковых клеток - метастаз) в постоперационном периоде: 1. После удаления опyхолевой ткани вызывать образование антител у этого же больного против внутривенно введенной изоформы Nox, полученной из клеток удаленной опухолевой ткани. При предклиническом испытании в эксперименте определить эффективную концентрацию (титр) сформированных антител против Nox. 2. При асцитной карциноме после удаления опyхолевой ткани вызывать образование антител у этого же больного против внутривенно введенной изоформы еNox, полученной из асцитной жидкости. 3. После удаления опухолевой ткани из крови больного выделить и активировать супрол in vitro и вводить его внутривеннo. При предклиническом испытании определить эффективную дозу и периодичность введенного супрола.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Повышение продуцирования АФК непосредственно в раковых клетках путем снижения активности Mn-СОД или активности NADPH оксидазы (Nox) вызывает апоптоз опухолевых клеток и может быть рекомендовано как терапевтическое средство. Опухолевые клетки очень чувствительны к нарушению окислительно-восстановительного статуса, вызванного под влиянием экзогенных АФК. Доказано, что некоторые субъединицы Nox локализованы на поверхностности мембран клеток и ответственны за продуцирование О2 и за их выход в экстрацеллюлярную среду.

При этом О2 продуцируется не тольмо изоформами клеточных Nox, но и экстрацеллюлярной NADPH оксидазой (eNox). Впервые с использованием метода ионообменной хроматографии на целлюлезах КМ-52, ДЕ-52, сефадексе ДЕАЕ А-50 и гель-фильтрации на сефадексе G-100 из шести различных типов злокачественной опухоли в клинике и эксперименте выделены изоформы Nox и экстрацеллюлярной Nox (последние выделены из асцитных жидкостей опухолей). По характерным максимумам и по форме оптические спектры поглощения этих Nox и eNox в основном не отличаются от таковых у Nox из клеток тканей здоровых мышей, крыс и крови человека, но обладают более повышенной NADPH зависимой О2-продуцирующей и пониженной ферриHb-востанавливающей активностями. Снижение ферриHb-восстанавливающей активности Nox опухолевых клеток является новым механизмом ослабления кислородного гомеостаза при канцерогенезе. Другим важным феноменом является то, что галармин, также повышает NADPHзависимую О2-продуцирующую и ферриHb-востанавливающую активности Nox опухолевых клеток. Причем эти Nox являются рецепторами галармина. Возможно БПП-1 путем нарушения окислительно-восстановительного статуса и кислородного гомеостаза опухолевых клеток проявляет противоопухолевый эффект. Уровень eNox в жидкостях асцитных карцином, особенно, в фазе обострения болезни, повысился в 4-8 раза. Это свидетельствует о том, что для развития клеток асцитной карциномы различной локализации определенную роль играют не только интрацеллюлярные Nox, но и eNox. Как природный и стойкий источник О2 супрол, за счет продуцируемых О2, оказывает противоопухолевый эффект при саркоме-45 у крыс. На основании полученных результатов выдвигаются три новых подхода аутотерапии раковых заболеваний (для нейтрализации метастаз) в постоперационном периоде: 1. При плотной форме опухолевой ткани у данного опухоленосителя после ее удаления вызвать образование антител против внутривенно введенной изоформы Nox, полученной из клеток удаленной опухолевой ткани самого же больного; 2. Для асцитных форм рака из асцитной жидкости выделить eNox и вводить ее этому же больному для образования антител. Антитела путем снижения уровня Nox и eNox могут изменять окислительно-восстановительный статус опухолевых клеток и вызывать их гибель; 3. В ходе удаления плотной опухолевой ткани из крови опухоленосителя выделить супрол, активировать его in vitro (для продуцирования О2) и вводить этому же больному. Генерированные О2 могут вызывать лизис опухолевых клеток путем индуцирования липидной пероксидации мембран этих клеток.

ВЫВОДЫ

- Разработанные методы выделения и очистки NADPH оксидазы (Nox) и экстрацеллюлярной NADPH оксидазы (eNox) из клеток плотных и асцитных форм опухолевой ткани являются простыми, кратковременными и могут быть внедрены в онкологических центрах после соответствующих предклинических испытаний.

- Количественные и качественные отклонения Nox и eNox из клеток, приведенных опухолевых тканей, от нормы являются новыми и чувствительными биохимическими маркерами оценки эффективности канцеротерапии.

- По основным оптико-спектральным показателям Nox и eNox из опухолевых клеток мало отличаются от аналогичных показателей Nox из нормальных клеток тканей мышей и мембран эритроцитов человека.

- Увеличение уровня NADPH-зависимой О2-продуцирующей активности, и снижение ферриHbвосстанавливающей активностей Nox, и, особенно, eNox являются новыми молекулярнобиохимическими механизмами повышения прооксидантного статуса и ослабления кислородного гомеостаза в терминальных стадиях канцерогенеза.

eNox играет определенную роль в развтии опухолевых клеток.

Nox и eNox из опухолевых клеток играют роль рецептора для синтетического аналога богатого пролином полипептида – галармина.

Вводится новый термин «аутотерапия рака», путем введения данному опухоленосителю супрола из сыворотки крови самого же больного, а также формировния антител против Nox и еNox из опухолевых клеток данного опухоленосителя в постоперационном периоде.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Алексанаян М.К., Галоян К.А., Симонян Г.М., Степанян Г.М., Симонян Р.М., Мурадян Р.Е., Алексанян С.С., Симонян М.А., Галоян А.А. Повышение NADPH-зависимой супероксидпродуцирующей и ферриHb-восстанавливающвй активности изоформы цитохрома b558 кислого характера из клеток опухолевой ткани саркомы-37 мышей под влиянием богатого пролином полипептида (БПП-1) in vitro // Вопросы теоретической и клинической медицины, 2010, том 13, № 2 (58). С. 54-57.

2. Алексанян М.К., Симонян Г.М., Хачатрян А.Р., Симонян Р.М., Бабаян М.А., Ширинян В.С., Галоян К.А, Алексанян С.С., Симонян М.А., Галоян А.А. Ассоциирование богатого пролином полипептида с двумя изоформами цитохрома b558 из клеток опухолевой ткани лимфосаркомы человека // Вопросы теоретической и клинической медицины, 2010, том 13, 3. М.К.Алексанян Оптические спектральные характеристики и активнсти фракции цитохрома b558 из клеток ткани аденокарциномы тонкой кишки человека // Вопросы теоретической и клинической медицины.- 2010, том 13, № 4 (60), С. 68-70.

Симонян Г.М., Алексанян М.К., Симонян Р.М., Хачатрян А.Р., Бабаян М.А., Алексанян С.С., Симонян М.А. Новые подходы аутотерапии рака в постоперационном периоде // Вопросы теоретической и клинической медицины, 2011, том 14, № 4 (64), С. 3-7.

Алексанян М.К., Симонян Р.М., Симонян Г.М., Бабаян М.А., Алексанян С.С., Симонян М.А. Экстрацеллюлярная NADPH оксидаза из асцитной жидкости карциномы Эрлиха и дисбаланс между прооксидантными и антиоксидантными металлопротеинами клеток тканей мышей // Медицинская наука Армении, 2011, т. LI, № 4, С. 46-57.

Алексанян М.К., Симонян Г.М., Симонян Р.М., Аракелян Л.Н., Алексанян С.С., Симонян М.А. Противоопухолевый и антистрессорный эффект супрола, введенного белым крысам при саркоме-45 // Медицинская наука Армении, 2012, т. LII, № 3, С. 23-35.

Алексанян М.К, Симонян Г.М., Алексанян Серг. С., Симонян Р.М., Ширинян В.С., Алексанян С,С., Симонян М.А., Степанян Г.М. Повышение уровня экстрацеллюлярной NADPH оксидазы в асцитной карциноме легких человека // Вопросы теоретической и клинической медицины, 2012, том 15, № 1 (68), С. 10-12.

Алексанян М.К., Саргсян М.Г., Ширинян В.С., Симонян Р.М., Алексанян А.С., Бабаян М.А., Алексанян С.С., Симонян М.А Уровень и активности фракции экстрацеллюлярной NADPH оксидазы из асцитной карциномы яичника женщин на различных стадиях заболевани // Вопросы теоретической и клинической медицины, 2012, том 15, № 3 (70), С.

ДЕ-52 ДЕАЕ А-50 - G-100, (A412/A530) :, in vitro. NoxNox- NADPH О2Hb :, Nox- -45- :

Nox-, 3. eNox- The levels and activity of cytochrome b558 from human blood and bioptics at various type

SUMMARY

As an enzymatic system of the generation of the superoxides for the growth and apoptosis of the tumor cells the aim and its realization is connected with the isolation of the isoforms of NADPH oxidases (Nox) or cytochrome b558 from malignant tumor-bearing human, white mouses and white rats by various lacalization (in the case of solid tumor and ascites carcinomas) blood and tumor tissues (bioptics) and fluids of ascites carcinomas. Immediately, after operation and removing of the tumor tissues and ascites carcinomas, the isolation of the isoforms of Nox from human lymphosarcoma tissue at intracutaneous localization and from the large intestine adenocarcinoma tissues, from fluides of lung and women's ovarian carcinomas were carried out.

In the next phase of the work the isolation of the isoforms of Nox from modeling experimental tumor tissues in the animals: sarcoma-37 from mousus, sarcoma-45 from wite rats, from fluide of Ehrlich ascites carcinomas of the mouses were take place. Simultaneously, the determination of characteristic changes of the blood Nox and other metalloproteins were carried out. Specifically, the characteristic changes of the levels, activities and optical absorption spectra of these enzymes from donor and tumor-bearing blood were determined. Simultaneously, as a stable superoxide producing system the isolation of the suprol (superoxide-producing lipoprotein) from blood serum and its activation by the traces of the ions of transition metalls in vitro and injection to the tumor-carrier animals were carried out.

For the first time the isolation of the isoforms of cellular Nox from solid tumors tissues and extracellular Nox (eNox) from fluides of ascites carcinomas (using the methods of ion-exchanging chromatography on the celluloses KM-52, DE-52, sephadex DEAE A-50 and gel-filtration on the sephadex G-100) were carried out. These Nox with the molecular mass to 60-70 kDa from sarcomasarcoma-45, from fluids of Ehrlich ascites sarcomas of the mouse, from human limphosarcoma, from fluids of ascites carcinomas of the human lung and ovarian ascites fluids, as well as, from intestines adenocarcinomas of the human were isolated. The molecular mass of these acidic character Nox and eNox is composed to 60-70 kDa. According to characteristic forms and maximums of the optical absorption spectra of the Nox and eNox practically is not differed from the Nox or eNox isolated from haelthy animals cells (spleen, liver, erythrocytes membranes). Although, on the absorption spectra of the eNox the characteristic maximal absorbance at 485 nm is present.

Some differences of the molecular mass and optical spectral index (A412/A530) of these Nox is observed. On the other hand, the increase of the NADPH depended О2-producing activity and decrease of the ferrihemoglobin-reducing activity of the isoforms of Nox from tumor cells or fluids of ascites carcinomas takes place. The decrease of the ferriHb-reducing activity of the tumor’s Nox can be as a new mechanism of the decrease of the oxygen homeostasis of the tumor carriers is determined. The increase of NADPH depended О2-producing and ferrihemoglobin-reducing activities of these Nox by the galarmin (syntetic analog of proline rich polypeptide-1 from granulocytes) to 1,5-7 mkg is observed. It is possible, that these Nox can be as a receptor for the galarmin. The increase of the level of the eNox in the fluids of presented ascites carcinomas to 4- fold, еspecially in the acute phase of the diseases, is observed.

This tesсtifies that the intracellular and extracellular Nox (as О2-producing agents) plays a significant role for the growth of the tumor cells. The antitumor and antistressor effect of the injected suprol (as a intensive О2-producing agent) at the sarcoma - 45 in the rats is taken place. On the base of these results the new approaches of the neutralization of the metastasis in post operational phase are presented: 1. the injection of the animals of the activated suprol in vitro (as an О2producing agent)., 2. the injection of the Nox for the producing of the antibodies against the Nox, localized on the surfаce of the metastasis. 3. the injection of the animals of the eNox for the producing of the antibodies against eNox in the fluids of ascites carcinomas.



 
Похожие работы:

«ЧУКИЧЕВА ИРИНА ЮРЬЕВНА ЗАКОНОМЕРНОСТИ АЛКИЛИРОВАНИЯ ФЕНОЛОВ МОНОТЕРПЕНОИДАМИ И НАПРАВЛЕННЫЙ СИНТЕЗ ТЕРПЕНОФЕНОЛОВ 02.00.03 – Органическая химия Д И С СЕ РТ АЦ И Я на соискание ученой степени доктора химических наук Сыктывкар 2013 СОДЕРЖАНИЕ СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ ВВЕДЕНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ...»

«Идентификация микроорганизмов Стандарт в идентификации микроорганизмов Erba Lachema в течение многих лет производит и поставляет диагностическую продукцию для клинических лабораторий. Достигнуты значительные успехи в расширении ассортимента и улучшении качества продукции для биохимической идентификации бактерий. Принцип работы и дизайн наборов МИКРО-ЛА-ТЕСТ® Наборы MIKRO-LA-TEST® - микротитровальные стриппированные 96-ти луночные пластинки с 1, 2 или 3 рядными вертикальными стрипами для...»

«РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ РАДИОЛОГИИ И АГРОЭКОЛОГИИ (ГНУ ВНИИСХРАЭ) ОЦЕНКА РАДИОЛОГИЧЕСКОЙ И ЭКОНОМИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЗАЩИТНЫХ МЕРОПРИЯТИЙ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИХ ПРОИЗВОДСТВО НОРМАТИВНО ЧИСТЫХ ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ НА ПРИМЕРЕ ТЕСТОВЫХ СЕЛЬСКИХ НАСЕЛЕННЫХ ПУНКТОВ Информационный буклет Обнинск-2010 УДК [574:539.1.04]:614.876 Авторский коллектив ГНУ Всероссийский...»

«010923 Область изобретения В широком смысле настоящее изобретение относится к биохимической и химической промышленности и, более конкретно, к способу, который можно использовать для ферментации углеводных субстратов растительной природы с целью получения С1-С5 спиртов и для синтеза высших спиртов, других кислородсодержащих соединений и углеводородов, а также для получения компонентов моторного топлива из биомассы. Так как С6 и высшие спирты, простые эфиры, ацетали и высшие углеводороды нельзя...»

«БИБЛИОГРАФИЯ НАУЧНЫХ ТРУДОВ КНЦ РАН ЗА 2013 ГОД КНИГИ Монографии Геологический институт Нерадовский Ю.Н., Войтеховский Ю.Л. Атлас структур и текстур кристаллических сланцев Больших Кейв. – Апатиты: Изд-во K & M, 2013. – 114 с. Горный институт Современный опыт проходки большепролетной выработки значительной протяженности в сложных горно-геологических условиях Хибинского массива / Н.Н. Мельников, В.П. Абрамчук, А.Ю. Педчик, В.В. Костенко, Ю.А. Епимахов, Н.Н. Абрамов, В.А. Фокин. – Апатиты: Изд....»

«  Процессы и аппараты химических и других производств. Химия УДК 66. 047 ОСОБЕННОСТИ МЕХАНИЗМА И КИНЕТИКИ СУШКИ КАПЕЛЬ ДИСПЕРСИЙ (на примере сушки послеспиртовой барды) Ю.В. Пахомова, В.И. Коновалов, А.Н. Пахомов Кафедра Технологические процессы и аппараты, ГОУ ВПО ТГТУ; kvipri@ce.tstu.ru Ключевые слова и фразы: депиннинг; испарение капли; образование корки; послеспиртовая барда; пиннинг; структурообразование в капле; тепломассообмен. Аннотация: Выполнен анализ современных исследований в...»

«А. Л. Гулевич, С. М. Лещев, Е. М. Рахманько Экстракционные методы разделения и концентрирования веществ Пособие для студентов химического факультета специальности 1-31 05 01 Химия (по направлениям) Минск БГУ 2009 2 УДК 542.61 (075.8) ББК 24.46я73 Г94 Рекомендовано Ученым Советом химического факультета 20ноября 2007 г., протокол №4 Р е ц е н з е н т ы: кафедра аналитической химии Белорусского государственного технологического университета (заведующий кафедрой кандидат химических наук Е. В....»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Тихоокеанский государственный университет УТВЕРЖДАЮ Проректор по учебной работе С.В. Шалобанов 200г. ПРОГРАММА ДИСЦИПЛИНЫ По кафедре Экономика и управление в отраслях химико-лесного лесного комплекса Планирование на предприятии Утверждена научно-методическим советом университета для специальностей Экономика и управление на предприятиях Специальность – 080502.65 Экономика и...»

«СОДЕРЖАНИЕ 50.kz | №11-12 (51-52) | 2012 новости / жаалытар 4 точка сбора 8 Научно-технический потенциал 11 Казахстана: краткий обзор 14 К вопросу о трансферте технологий 20 20 Трансферт технологий 24 Инновационно-технологическое развитие наукоемких отраслей экономики 30 Использование достижений науки и техники 36 Роль прямых и венчурных инвестиций 22 в развитии инновационной экономики 40 Обзор науки, технологии и промышленности ОЭСР за 2011 год Инновации могут играть важную роль в процессе...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Уральский государственный лесотехнический университет Кафедра ФИЗИЧЕСКОЙ, ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ И НАНОДИСПЕРСНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ Утверждаю. Одобрена: Декан инженерно-экологического кафедрой физической, органической химии и факультета нанодисперсных технологий А.В. Вураско Протокол №_ от _20_ г. _ 20_ г. Зав. кафедрой В.В.Свиридов Методической...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Институт цветных металлов и материаловедения Кафедра физической и неорганической химии С.В. Сайкова МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ХИМИЧЕСКИХ ОТКРЫТИЙ УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ СТУДЕНТОВ Направление 020100.62 – Химия Красноярск 2011 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ 1. СТРУКТУРА САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ 2....»

«)ХЛ)июддо СКИЙ Щ СУДДАРСТВЕННЫЙ ЖЙЩЕРСИТЕТ и м.с л ОРЛЙГЫРОВА Министерство образования и науки Республики Казахстан Павлодарский государственный университет им. С Торайгырова. ПГУ В ЛИЦАХ Павлодар 2005 ББК-27.5 П-75 П АВЛ О Д АРСКИЙ ГО СУД АРСТВЕННЫ Й УН И ВЕРСИ ТЕТ И М. С. ТОРАЙ­ ГЫ Р О В А (1 9 6 0 - 2 0 0 5 гг.). - П авлодар: ЭКО, 2 0 0 5. - с. ISB N -9965-635-17 -4 Павлодарский государственный университет им. С. Торайгырова: Биографи­ ческий справочник / А.Талтенов, Н.Пфейфер, Р.Ж....»

«Статья была опубликована в издании Consilium Medicum (2008 / том 3 / №3) Оптимизация лечения впервые выявленных больных туберкулезом легких на основе принципов доказательной медицины В.Ю. Мишин Кафедра фтизиопульмонологии ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава Проблема клинического излечения впервые выявленных больных туберкулезом легких является приоритетной для отечественной фтизиат рии [1, 2]. Это связано с тем, что излечение данного контингента пациен тов предотвращает развитие неизлечимых хронических...»

«Федеральное агентство по образованию Сыктывкарский лесной институт — филиал ГОУ ВПО Санкт-Петербургская государственная лесотехническая академия имени С. М. Кирова КАФЕДРА ХИМИИ ОБЩАЯ И НЕОРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ (разделы: Общая химия и Общая химия и химия элементов) СБОРНИК ОПИСАНИЙ ЛАБОРАТОРНЫХ РАБОТ для подготовки дипломированного специалиста по направлениям 655000 Химическая технология органических веществ и топлива специальности 240406 Технология химической переработки древесины и 656600 Защита...»

«В.Д. ФЕДОРОВ ИЗМЕНЕНИЯ В ПРИРОДНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ Под редакцией и с комментариями профессора В.Н. Максимова Москва 2004 1 УДК ББК С Москва, издательство Спорт и Культура, 2004, 368 стр. В книге собраны работы автора по ключевым вопро сам биологии, экологии и гидробиологии второй поло вины XX века. ISBN 2 СОДЕРЖАНИЕ Предисловие редактора Полифосфаты фотосинтезирующих бактерий О закономерности отмирания клеток в размножающихся культурах сине зеленых водорослей Anabaena variabilis и...»

«http://www.bio.bsu.by/genetics/people.phtml Страница 1 Распечатать Сайт Биологического Факультета - версия для печати или вернуться Персоналии кафедры генетики Биологического факультета БГУ. Сотрудники кафедры - Профессорско-преподавательский состав - Учебно-вспомогательный состав - Научные сотрудники - Аспиранты и магистранты Максимова Наталья Павловна Заведующая кафедрой; доктор биологических наук, профессор. Преподаваемые дисциплины Читаемые курсы: генетика, молекулярная биология гена,...»

«Оценка растворимости и высвобождения ЛС СБОРНИК МАТЕРИАЛОВ ПО СИСТЕМАМ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАСТВОРИМОСТИ Издание 2011–2012 гг. Предисловие Фирма Аджилент текнолоджиз, хорошо известная работникам фармацевтической промышленности как поставщик большого ассортимента приборов, комплектующих и расходных материалов, предлагает ряд приборов для определения растворимости и испытания лекарственных средств. Как передовой изготовитель аналитических приборов Аджилент в состоянии удовлетворить все потребности в...»

«1944 5 января. Распоряжением ВКВШ при СНК СССР окончание 1943/44 учебного года отсрочено до 15 июля, зимние каникулы отменены, начало учебных занятий 1944/45 учебного года перенесено на 15 октября. Летопись. Т. 1. – С. 446. 5 января. Утвержден состав Ученого совета КГУ в количестве 36 человек под председательством ректора К.П.Ситникова и при ученом секретаре М.М.Кравцове. Совету разрешено принимать к защите докторские и кандидатские диссертации, присуждать ученую степень кандидата наук и...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС по дисциплине Б.2 Неорганическая и аналитическая химия (индекс и наименование дисциплины) 111900 Ветеринарно - санитарная Код и направление экспертиза подготовки Профиль 111900.62 Ветеринарно-санитарная подготовки экспертиза Квалификация бакалавр (степень)...»

«Областная научно-практическая конференция обучающихся Путь в науку секция ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ РЕКИ АЛЕШНЯ В ОКРЕСТНОСТЯХ П. ЗЕЛЁНЫЙ ГАЙ И с. ЖИДИЛОВКИ Конюхова Анна обучающаяся 11 класса Жидиловского филиала МОУ Заворонежской СОШ Научный руководитель: Туркинен Надежда Викторовна учитель биологии Жидиловского филиала МОУ Заворонежской СОШ; Околелов А.Ю., доцент кафедры экологии и БЖД ТГУ им. Г.Д. Державина, кандидат биологических наук под координацией...»




 
© 2014 www.kniga.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Книги, пособия, учебники, издания, публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.