WWW.KNIGA.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Книги, пособия, учебники, издания, публикации

 

1

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Российского химикотехнологического университета им. Д.И.Менделеева.

Научный консультант: доктор химических наук, профессор

Крылов Игорь Алексеевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Коваленко Леонид Владимирович

доктор химических наук, профессор Сульман Эсфирь Михайловна доктор химических наук, профессор Семенова Мария Германовна Ведущая организация: Научно-Технический Центр «Лекарства и биотехнология»

(НТЦ «Лекбиотех») Защита диссертации состоится «24» ноября 2009 г в 1030 часов на заседании объединенного Диссертационного совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева по адресу: 125047, Миусская пл., д.9 в аудитории 443.

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева.

Автореферат диссертации разослан «_»2009г.

Ученый секретарь Диссертационного совета ДМ 212.204.13, к.т.н. И.В. Шакир

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Разработка недорогих эффективных препаратов кормового, пищевого и медицинского назначения отечественного производства является одной из актуальных задач современной биотехнологии. Среди такого рода препаратов наибольшее практическое значение имеют гидролизаты белковой, липидной, нуклеотидной и углеводной природы Препараты нуклеотидной природы находят широкое применение в качестве лекарственных средств. Они регулируют обмен нуклеотидов в тканях, обладают иммуномодулирующими свойствами, применяются для лечения абиотрофий различного происхождения, псориаза, рассеянного склероза и других социально значимых заболеваний.[Шабанова М.Е., 2005 и др.] Препараты белковой природы в виде гидролизатов и ферментолизатов находят применение в качестве азотсодержащей основы питательных сред для культивирования микроорганизмов, в качестве пищевых добавок, а при соответствующем уровне очистки в виде смеси аминокислот и в медицине для парентерального питания и в качестве сырья [Нестерова Е.И., 2001].

Гидролиз углеводсодержащих субстратов позволяет получать моносахара, которые можно использовать для производства кормовых и пищевых препаратов углеводов. [Мамыкин В.К. и др., 1998]. На основе жировых отходов получают свободные жирные кислоты, применяемые для производства различных видов мыл, высших спиртов, пищевых, парфюмерно-косметических и фармацевтических продуктов [Малахов И.А. и др., 2003].





Для получения гидролизатов биополимеров наиболее перспективно использовать возобновляемые отходы пищевой и микробиологической промышленности, животного, растительного и микробного происхождения. Примером отходов растительного происхождения является пивная дробина – отход пивоваренной промышленности, животного - жиросодержащие и кератинсодержащие отходы мясоперерабатывающей промышленности, микробного - биомасса хлебопекарных дрожжей – отход спиртового производства, биомасса бактерий Brevibacterium glutamicum – отход производства аминокислот микробиологическим синтезом и др.

Практическая ценность перечисленных отходов обусловлена следующими причинами:

- высоким содержанием липидов, белков, углеводов, нуклеиновых кислот;

- возможностью улучшения экологической обстановки на соответствующих производствах в случае утилизации данных отходов;

- возможностью организации выпуска дополнительной конкурентоспособной продукции, что позволит повысить рентабельность основного производства.

Вследствие высокого содержания биополимеров данные отходы целесообразно перерабатывать в гидролизаты белковой, липидной, нуклеотидной и углеводной природы пищевого, кормового или медицинского назначения. Для этого используют химический и ферментативный гидролиз. К недостатку первого относятся жесткие условия проведения: высокая температура, сильнокислые или сильнощелочные значения рН среды, что приводит к образованию нежелательных побочных продуктов, а также увеличению содержания минеральных примесей в получаемых гидролизатах, что осложняет и удорожает их очистку. Вышеуказанных недостатков лишен ферментативный гидролиз, проводимый в более мягких условиях. Однако в этом случае не удается достичь высокой степени гидролиза субстрата по причине инактивации ферментов. В связи с этим гидролиз проводят в режиме дробной подачи фермента. Это ведет к повышению нормы расхода последнего, и, следовательно, к увеличению себестоимости готового продукта, т.е.

эффективность ферментативного процесса существенно снижается. Одним из путей ее повышения является стабилизация ферментов. Для этого в реакционную среду или в ферментный препарат вводят различные химические соединения: полиолы, амины, аминокислоты, минеральные соли и др. [Tropak M.B.,2007]. Однако в этом случае у потребителей продуктов ферментативного гидролиза, особенно, для пищевых, медицинских и кормовых целей могут возникнуть проблемы с качеством гидролизатов. Наиболее просто решить данную проблему, если найти природный источник нетоксичных стабилизаторов. В качестве таких стабилизаторов можно использовать вырабатываемые микробными клетками ауторегуляторы, называемые факторами d1, которые стабилизируют ферментные системы клетки и обеспечивают ее выживание в анабиозе. Известно, что данные соединения относятся к классу алкилоксибензолов (АОБ) и способны расширять температурный и рН оптимум действия фермента, что значительно снижает риск развития посторонней микрофлоры при продолжительном гидролизе и не требует поддержания стерильных условий. Кроме того, введение АОБ приводит к значительному увеличению скорости ферментативного гидролиза [Колпаков А.И., 2000].





«Узким» местом существующих технологий ферментативного гидролиза является также очистка получаемых гидролизатов. Как правило, она предполагает использование дорогостоящих реагентов и препаративных методов (аффинной хроматографии, гель-фильтрации, диализа и т.п.), которые сложно масштабировать в промышленном крупнотоннажном производстве. Таким образом, проблема утилизации отходов пищевой и микробиологической промышленности является актуальной и перспективной, однако, требуется разработка эффективных способов получения и очистки ферментативных гидролизатов на их основе.

Анализ литературных данных показывает, что технологии получения и очистки ферментативных гидролизатов, получаемых из микробного, животного и растительного сырья существенно различаются как стадиями предварительной подготовки сырья, так и используемыми ферментными препаратами и методами очистки гидролизатов. В связи с этим целесообразно разработать общие подходы к получению ферментативных гидролизатов из различных видов сырья, предложить общие пути повышения эффективности процессов ферментативного гидролиза, создать типовые кинетические схемы для количественного описания технологических стадий, что позволит в дальнейшем разработать универсальные алгоритмы управления технологическими процессами.

В условиях рыночной экономики конкурентоспособным может быть только гибкое, динамичное производственное предприятие, способное быстро адаптироваться к изменяющимся условиям рыночной среды и спроса на продукцию. Поэтому представляется целесообразным разработать максимально унифицированную малоотходную технологию получения ферментативных гидролизатов, которая позволила бы предприятию перерабатывать отходы различного происхождения и получать на их основе продукцию требуемого качества и назначения.

Целью работы является разработка научных основ технологии получения ферментативных гидролизатов промышленности белковой, липидной, углеводной и нуклеотидной природы с использованием технических ФП на основе отходов пищевой и микробиологической, а также повышение эффективности ферментативных процессов за счет введения в среду гидролиза природных ауторегуляторов – факторов d1, обеспечивающих повышение устойчивости и стабильности ферментов. Последнее должно привести к повышению качества гидролизатов при более низких нормах расхода ФП.

Для достижения поставленной цели в работе необходимо было решить следующие задачи:

1) разработать технологические приемы предварительной обработки растительного, животного и микробного сырья, способные обеспечить повышение эффективности последующего ферментативного гидролиза;

2) изучить, используя кинетический метод исследований, количественные закономерности процессов гидролиза в отсутствии и в присутствии интенсифицирующих факторов (АОБ) на модельных системах (высокоочищенных ферментах и субстратах);

3) установить единую для всех субстратов, ферментов и АОБ схему ферментативных превращений, учитывающую влияние АОБ на скорость ферментативной реакции.

4) на основе полученных на модельных системах закономерностей ферментативного гидролиза рекомендовать пути повышения его эффективности для гидролиза микробного, растительного и животного сырья техническими ФП;

5) разработать технологические приемы выделения и очистки ферментативных гидролизатов белковой, липидной, нуклеотидной и углеводной природы и дать рекомендации по оптимальным условиям их проведения;

6) провести проверку соответствия физико-химических показателей получаемых препаратов требованиям соответствующих ТУ;

7) провести оценочные технико-экономические расчеты разработанных технологий и оценить их эколого-экономическую эффективность;

8) используя физико-химические методы анализа, установить структуры интермедиатов на уровне субстрат – АОБ – фермент, способные научно обосновать наблюдаемый эффект автокатализа или ингибирования от введения АОБ в среду гидролиза.

Научная новизна. Впервые с использованием кинетического метода исследований установлены количественные закономерности процесса ферментативного гидролиза биополимеров белковой, липидной, углеводной и нуклеотидной природы техническим препаратами гидролаз.

Впервые показана возможность применения кинетического метода для описания закономерностей ферментативного гидролиза субстратов липидной, белковой и углеводной природы в составе микробного, растительного и животного сырья техническими препаратами гидролаз с участием АОБ.

Установлена единая для всех субстратов, ферментов и АОБ схема ферментативных превращений, учитывающая влияние АОБ на скорость ферментативной реакции. Показано, что ключевыми стадиями, определяющими скорость ферментативного гидролиза в присутствии АОБ, являются образование интермедиатов фермента с АОБ и субстрата с АОБ.

Показана возможность применения выбранного подхода к отличным от гидролаз комплексным ферментным препаратам на примере ферментных систем клеток печени, осуществляющих трансформацию серосодержащих аминокислот (цистеина и цистина) в таурин.

Разработано количественное описание стадий ионного обмена и осаждения продуктов ферментативного гидролиза из водных и водно-спиртовых растворов.

Предложенные кинетические схемы позволят в дальнейшем разработать единый алгоритм управления технологическими процессами получения ферментативных гидролизатов на основе сырья различного происхождения.

Впервые с использованием квантово-химических и термодинамических расчеттов, подтвержденных физико-химическими методами (УФ-, ИК-спектроскопия) показано, что образование интермедиата АОБ с ферментом происходит за счет образования водородных связей между ОН-группами АОБ и амино- и гидроксогруппами аминокислот фермента, расположенными вблизи активного центра, а также гидрофобных взаимодействий. Установлено, что образование интермедиата между АОБ и субстратом также связано с образованием водородных связей.

Практическая значимость. Проведенные исследования явились основой для подбора технологических режимов, обеспечивающих повышение эффективности ферментативного гидролиза биополимеров в составе отходов микробиологической и пищевой промышленности:, а именно: экстракции белковых веществ из биомассы дрожжей и бактерий на примере Saccharomyces cerevisiae и Brevibacterium glutamicum техническим ферментным препаратом (ФП) протосубтилином Г3х, переработки кератинсодержащего сырья в таурин с использованием технических ферментных препаратов протосубтилина Г3х, ферментных систем поджелудочной железы крупного рогатого скота (ФС ПЖ КРС) и печени быка (ФС КП); получения углеводной фракции из пивной дробины путем ее гидролиза техническим ФП целловиридином Г3х, грибной глюкоамилазы Aspergillus awamori и панкреатической -амилазы; получения панкреатического гидролизата дрожжевой РНК и гидролиза жиросодержащих отходов панкреатической липазой.

На основе разработанных кинетических схем подобраны режимы ведения вышеперечисленных процессов ферментативного гидролиза, обеспечивающих степень конверсии субстрата в присутствии АОБ не менее 90%, что позволяет сократить норму расхода ФП и время ведения процесса в 2 – 9 раз.

Разработаны технологические схемы переработки гидролизатов белковой, липидной, нуклеотидной и углеводной природы в конкурентоспособную продукцию медицинского, пищевого и кормового назначения. Используя кинетический метод исследований, обоснованы оптимальные режимы ведения стадий выделения и очистки продуктов гидролиза, основанные на применении методов ультрафильтрации, ионного обмена и осаждения из водных и водно-спиртовых растворов.

Проведена технико-экономическая оценка разработанных технологий, которая показала, что применение АОБ для интенсификации ферментативных процессов приводит к снижению себестоимости продукции в 2- 4 раза за счет снижения затрат на ФП, сокращения длительности технологического цикла и повышения вследствие этого эффективности работы оборудования. На основе экологоэкономической оценки разработанных технологий показано, что предложенные способы переработки отходов позволяют снизить экологический ущерб на 0,5 – 1, млн. руб/год.

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в разработке направления исследований, получении экспериментальных результатов и их обобщении.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы изложены на Международных и Всероссийских научно-технических конференциях, в том числе: Международной конференции «Химия и технология лекарственных средств» (Санкт-Петербург, 1994 г), 3 –5-ой и 12-ой Международных конференциях «Окружающая среда для нас и будущих поколений: экология, бизнес, экологическое образование» (Самара – Астрахань – Самара, 1998, 1999, 2000, 2007 гг), Заочной научно-практической конференции «Биотехнология в ФЦП «Интеграция»

(Санкт-Петербург, 1999 г), Международной конференции «Химия и биотехнология пищевых веществ. Экологически безопасные технологии на основе возобновляемых природных ресурсов» (Москва, 2000 г), Международной конференции «От фундаментальной науки к новым технологиям. Химия и биотехнология БАВ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии» (Москва – Тверь, 2001 г), 1 – 5 Международных конгрессах «Биотехнология – состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003, 2005, 2007, 2009 гг), Научнотехнической конференции «Технологии живых систем» (Москва, 2003 г), XII Всероссийской конференции «Нейроиммунология» (Санкт-Петербург, 2003 г), Международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006 г), 4 – 5-ой Российских конференциях «Нейроиммунопатология» (Москва, 2006, 2007 г).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано более 60 работ, в том числе 11 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, получено 6 патентов РФ на изобретения. Результаты исследования нашли отражение в 4-х учебных пособиях и монографии, написанной с участием автора.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, х анализа современного состояния проблемы по данным отечественной и зарубежной научной литературы и патентной документации, описания материалов и методов исследования, 7-ми глав изложения экспериментальных результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Материал изложен на 327 стр. компьютерного текста и содержит 122 таблицы и 196 рисунков. Список литературы включает 425 наименований работ, в том числе 195 зарубежных авторов. Материалы, подтверждающие основные результаты работы, приведены в приложении.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность и необходимость переработки отходов растительного, животного и микробного происхождения в ферментативные гидролизаты различного назначения, разработки общих подходов к повышению эффективности ферментативного гидролиза, направленного на сокращение времени процесса и нормы расхода ФП.

Глава 1. Обзор литературы.

В представленном обзоре научной и научно-технической литературы приведена характеристика и области применения гидролизатов, получаемых на основе белкового, липидного, углеводного и нуклеотидного сырья, дан обзор и анализ существующих технологий их получения. Аргументировано, что ключевой стадией, оказывающей влияние на выход и качество гидролизата, является ферментативный гидролиз. Приведены данные по строению и свойствам наиболее распространенных гидролитических ферментов. Приведен анализ существующих способов стабилизации ферментов, включая использование химических, фармакологических и молекулярных шаперонов для этой цели. Обоснована целесообразность применения природных АОБ в качестве стабилизаторов ферментов. Дана характеристика имеющихся данных по количественному и качественному изучению процессов взаимодействия химических шаперонов и АОБ с высокомолекулярными соединениями. На основе проведенного анализа литературных данных обоснована актуальность проведенных в работе исследований В главе 2 «Материалы и методы» перечислены физико-химические и квантово-химические методы, используемые в работе, методы математической обработки экспериментальных данных и проведения экспериментов, дана характеристика объектов исследования: ФП, субстратов и АОБ.

Глава 3. Экспериментальная часть и обсуждение результатов.

Среди большого разнообразия видов биотехнологического сырья в настоящее время ведущая роль принадлежит отходам пищевой и микробиологической промышленности. В табл. 1 приведен состав и среднегодовое количество отходов пищевой и микробиологической промышленности, использованных в работе.

Состав возобновляемых отходов растительного, животного и микробного происхождения Наименование вторичного сырья Среднего- сырого угле- липи- Нукпротеина водов дов леинодовое Нативная биомасса дрожжей на при- 10000 52,0 22,0 21,0 6, мере Saccharomyces cerevisiae Нативная биомасса бактерий на при- 10000 61,2 12,2 20,0 8, мере Brevibacterium flavum Анализ представленных данных показывает, что данные отходы характеризуются высоким содержанием какого-либо биополимера и могут быть использованы для получения низкомолекулярных продуктов белковой, липидной, нуклеотидной и углеводной природы путем гидролиза препаратами промышленных гидролаз.

Однако исследование количественных закономерностей и путей повышения эффективности ферментативного гидролиза промышленных субстратов техническими ФП представляет собой сложную задачу. Кроме того, с целью повышения эффективности ферментативного гидролиза необходимо разработать стадии предварительной подготовки сырья. Таким образом, была разработана единая схема проведения экспериментальных исследований, приведенная на рис.1.

Исследование закономерностей ферментативного гидролиза биополимеров в отсутствии и в присутствии интенсифицирующих факторов на модельных субстратах Апробация подобранных оптимальных условий гидролиза на модельных субстратах для гидролиза биополимеров в составе растительного, животного и микробного сырья Разработка стадий выделения и очистки гидролизата Технико-экономическая и эколого-экономическая оценка эффективности разработанных технологий Рис. 1. Схема проведения исследований 3.1. Получение ферментативных гидролизатов белковых веществ из микробного сырья В качестве сырья для получения белковых гидролизатов использовали: биомассу дрожжей Saccharomyces cerevisiae (отход пивоваренного производства) и биомассу бактерий Brevibacterium flavum (отход производства аминокислот). Данные субстраты характеризуются высоким содержанием сырого протеина и нуклеиновых кислот (см. табл. 1). Поэтому из них целесообразно получать гидролизаты белковой и нуклеотидной природы. С целью извлечения из биомассы нуклеиновых кислот ее подвергали предварительной денуклеинизации по ранее разработанной технологии [Крылов, Волкова,. 1995 г.]: температура 90оС, рН 9,0, время обработки клеток 1 ч, концентрация клеток в суспензии – 10% СВ. Полученную денуклеинизированную биомассу (ДНБМ) отделяли фильтрованием и направляли на ферментативный гидролиз.

Из литературных данных известно, что наибольшее практическое значение имеют гидролизаты со степенью гидролиза белка (отношением аминного азота к общему) не менее 50%. Такая степень гидролиза может быть достигнута за счет использования пептидаз. В качестве последних были выбраны пептидазы в составе поджелудочной железы крупного рогатого скота (ПЖ КРС), подготовленные по известной методике [Неклюдов А.Д., 1995]. С целью снижения нормы расхода ПЖ КРС, как показали предварительные исследования, ферментативный гидролиз целесообразно проводить в два этапа: на первом этапе осуществлять гидролиз белков микробной биомассы протеазой (в качестве таковой был выбран технический ФП протосубтилин Г3х) с целью расщепления ВМФ белка до пептидов, а на втором этапе – проводить гидролиз ФП ПЖ КРС.

Для установления количественных закономерностей ферментативного гидролиза белка на первом этапе были проведены исследования по гидролизу модельного белка БСА трипсином. Для математического описания модельного процесса была использована кинетическая схема Михаэлиса-Ментен, которая вследствие различия в скорости гидролиза различных связей в молекуле белка может состоять из нескольких последовательных стадий. Установление их лимитирующего числа было одной из задач исследования.

Схема проведения исследований предполагала получение массива экспериментальных данных по влиянию следующих факторов на процесс ферментативного гидролиза: 1) концентрации субстрата для обработки данных в координатах Лайнуивера-Берка; 2) концентрации фермента на скорость процесса, необходимая для нахождения линейного участка зависимости скорости реакции от концентрации фермента; 3) температуры; 4) рН среды.

Типичные результаты экспериментов представлены на рис. 2 – 5.

Обработка полученных экспериментальных данных по стандартным методикам показала, что для математического описания гидролиза БСА трипсином можно использовать кинетическую схему, включающую две лимитирующие стадии:

где: Р0, E, EР0, EP1 – соответственно концентрации субстрата, фермента, продукта, фермент-субстратного комплекса; К1, К2 – константы равновесия образования соответствующих комплексов, kр1, kрр0, kрр1 – эффективные константы скорости гидролиза.

Температурная зависимость описывалась уравнением Аррениуса, а рН среды – уравнением специфического кислотно-основного катализа:

k = k*/(1 + Ka ·[H+]) (2), где: k0 – константа скорости, не зависящая от рН среды, Ка – константа равновесия образования протонированного комплекса, [H+] – концентрация ионов водорода.

В результате обработки данных были найдены значения эффективных констант, энергий активации и параметров уравнения рН зависимости (табл.2).

Однако найденные закономерности оказались справедливыми только для начального участка кинетических кривых, а в дальнейшем экспериментальные данные по накоплению продуктов гидролиза оказались существенно ниже расчетных. Этот факт может быть связан с инактивацией фермента в свободном состоянии или в виде фермент-субстратного комплекса, а также с ингибированием фермента продуктами гидролиза. Поэтому было дополнительно исследовано влияние начальной концентрации продукта на скорость гидролиза; а также гидролиз субстрата частично инактивированным ферментом, что достигалось путем прогрева последнего до температуры 90оС в течение различного времени. Полученные результаты приведены на рис. Рис.2. Зависимость начальной скорости Рис.3. Влияние начальной концентрации Рис. 4. Влияние температуры на выход Рис. 5. Влияние рН среды на выход продуктов продуктов гидролиза БСА трипсином гидролиза БСА трипсином.

Было установлено, что для гидролиза БСА трипсином характерна инактивации свободного фермента при отсутствии ингибирования конечным продуктом.

Дополнение предложенной кинетической схемы (1) уравнением инактивации позволило добиться адекватного описания экспериментальных данных:

где: kин – константа скорости инактивации, Ен/а – концентрация инактивированного фермента.

Анализ экспериментальных данных показывает, что степень гидролиза БСА, достигаемая при оптимальных условиях гидролиза, не превышала 40%.

Значения эффективных констант и энергий активации отдельных стадий процесса ферментативного гидролиза БСА трипсином А) в отсутствии АОБ Пут Е, 42 ±3 (3,53 ± 0,46)·10-6 0,0020 ± 0, kp kpp0 22± kpp1 18± 1 (1,05 ± 0,14)·10-5 0,015 ± 0, kин 20±1 0,119 ± 0,015 0,00023 ± 0, Б) в присутствии АОБ d1-C7/ d1-C kpp0,d1 17±1/23± kpp1,d1 16±1/15± kpp0,d2 18±2/21± kpp1,d2 17±2/14± С помощью разработанной кинетической схемы с последующей проверкой результатов расчетов экспериментом, было установлено, что достижение 90%-ной конверсии БСА возможвремя, мин но при условиях гидролиза, приведенных в табл. 3. Таким образом, норма Рис.6. Влияние времени прогрева трипсина при температуре 90оС на скорость гидролимассы субстрата, а длительность гидроза БСА трипсином. Время прогрева трипсилиза составляет не менее 4 ч.

на: 1 – 0 мин, 2 – 10 мин, 3 – 20 мин, 4 – мин.

Поэтому на следующем этапе исследований был предложен другой способ повышения эффективности ферментативного гидролиза, а именно введение в среду природных соединений, способных повысить стабильность ФП и, соответственно, увеличить выход продуктов гидролиза.

субтак называемые факторы страта Они были условно обозначены как d1-C7 и d1-C12.

Из литературных данных известно, что влияние АОБ на ферментативную активность может по-разному проявляться в зависимости от концентрации АОБ, а также в ряде случаев наблюдается эффект расширения или смещения температурного и рН оптимума действия фермента. На рис. 7 представлены данные по влиянию концентрации АОБ на скорость процесса.

r0, моль/л с опыты по предынкубации фермента и субстрата с АОБ. Опыты проводились при ранее подобранной оптимальной концентрации АОБ. После проведения концентрация АОБ, моль/л 104 представленных данных следуРис. 7. Зависимость начальной скорости гидро- ет, что при малом времени прелиза БСА трипсином от начальной концентра- дынкубации для каждого из ции факторов d1 в среде. 1- фактор d1-C7, 2 – АОБ наблюдается снижение фактор d1-C12.

Анализ представленных данных показывает,при его увеличении начальная скорость гидролиза снижается, а в дальнейшем происходит ее повышение до достижения некого постоянного значения, в случае АОБ d1-C7 происходит ее увеличение по сравнению с контролем в 4 раза, а в случае АОБ d1-C12 – уменьшение в раза.

По результатам обработки экспериментальных данных было установлено, что с позиций формальной кинетики процесс ферментативного гидролиза в присутствии АОБ может быть описан вышеустановленными схемами превращений (1) и (2), дополненными уравнениями, учитывающими образование интермедиатов АОБ с ферментом и субстратом:

E + D ED Е + D; S + D SD; ED+P0EDP0 P1+ED EDP где: D, ED, DPo, DP1, P1D, EDP0, EDP1, – соответственно концентрации АОБ, интермедиатов фермента с АОБ, субстрата с АОБ, тройного интермедиата субстрата и фермента с АОБ. Остальные обозначения аналогичны схеме (1).

r0, моль/л с, Рис. 8. Зависимость начальной скорости Рис. 9. Зависимость начальной скорости гидролиза БСА трипсином от времени гидролиза БСА трипсином от времени предынкубации факторов d1 с фермент- предынкубации субстрата с АОБ.

Обозначения: 1- фактор d1-C7; 2 – фактор тор d1-C12.

d1-C12.

В табл. 3 приведены оптимальные параметры гидролиза БСА трипсином в присутствии АОБ. Видно, что введение АОБ в среду гидролиза позволяет сократить норму расхода ФП и время процесса в 2 раза.

Полученные на модельной системе закономерности были применены к экстракции белков из биомассы дрожжей и бактерий протосубтилином Г3х и последующего гидролиза белков в составе экстракта ФС ПЖ КРС. Кроме того, была исследована возможность повышения эффективности данных процессов с помощью АОБ. Эксперименты проводились по вышеописанной схеме. На основе полученных данных было установлено, что процессы гидролиза микробных белков подчиняются вышеприведенным кинетическим схемам для модельной системы и различаются только значениями параметров (см. табл. 4), а также тем, что ФС ПЖ КРС подвергаются ингибирования продуктами гидролиза по уравнению:

Е + Р EPн/а (5), где: Ки - константа ингибирования, EPн/а – концентрация неактивного комплекса фермент-продукт.

Результаты исследований по влиянию АОБ на ферментативный гидролиз микробных белков обобщены в табл. 5.

Значения констант и энергий активации отдельных стадий процесса гидролиза белковых веществ дрожжей, бактерий и кератинов под действием протосубтилина и ФС ПЖ КРС А) под действием протосубтилина Г3х Е, кДж/моль К1 = 0,037 ± 0,002 л/г, К2 = 0,018 ± 0,003 л/г Е, кДж/моль К1 = 0,53 ± 0,04 л/моль, К2 = 0,26 ± 0,03 л/моль Б) под действием ФС ПЖ КРС Е, кДж/моль Ka, л/моль К1d = 47,6±5,6 л/моль, К2d = 32,0±5,6 л/моль, Киd = 350±40 л/моль Е, кДж/моль Ka, л/моль К1 = 0,24± 0,02 л/моль, К2= 0,16±0,01 л/моль, Ки = 0,58±0,06 л/моль Оптимальные условия гидролиза комплексных субстратов техническими ферментными препаратами А) в отсутствии интенсифицирующих факторов Наименование ферментативного процесса Условия гидролиза Экстракция белковых веществ из биомас- без тосубтилином Г3х Экстракция белковых веществ из биомас- без сы бактерий Brevibacterium glutamicum протосубтилином Г3х Гидролиз белковых веществ дрожжей Sac- без charomyces cerevisiae ФС ПЖ КРС Гидролиз белковых веществ бактерий Bre- без vibacterium glutamicum ФС ПЖ КРС Анализ полученных данных показал, что применение АОБ d1-C7 позволяет сократить норму расхода протосубтилина Г3х в 1,25 раза и, соответственно, во столько же раз сокращается время ферментолиза. Для достижения выхода аминного азота 50% необходим дополнительный гидролиз микробных белков ФС ПЖ КРС. В этом случае целесообразно использовать АОБ d1-C12, который более эффективен в гидрофобной среде вследствие большей гидрофобности его углеводородного радикала. При этом происходит повышение температурного оптимума действия фермента до 60 - 65оС, а время процесса и норма расхода ФП сокращаются в 2 раза.

Полученный ферментолизат далее перерабатывался по ранее предложенной схеме для дрожжей р. Candida maltosa (рис. 10): отделение взвешанных частиц путем мембранной очистки с использованием полых волокон ВПУ-15 ПА; ионообменная очистка на катионите КУ-2х8 в статических условиях с элюцией смеси аминокислот и низших пептидов 3%-ным раствором аммиака. Применение этих стадий позволяет повысить степень гидролиза белковых веществ на 10% и снизить содержание примесей углеводов в гидролизате в 1,7 раза.

Готовый концентрат выдерживали при температуре 4-6оС в течение 8-10 ч с целью осаждения минеральных примесей в виде хлорида аммония. Выпавший осадок отделяли фильтрованием. Очищенный препарат смеси аминокислот и низших пептидов высушивали в распылительной сушилке до остаточной влажности не более 7%. Проведенные технико-экономические расчеты показали, что из 1 т дрожжей можно получить 53,5 кг гидролизата в год. Его себестоимость составляет около 600 руб/т, а предотвращенный экологический ущерб при переработке 1000 тонн дрожжевой биомассы в год составляет не менее 1,5 млн. руб.

Экстракция белковых веществ протосубтилином Г3х из микробной биомассы в присутствии АОБ d1-C Гидролиз микробных белков ФС ПЖ КРС в присутствии АОБ d1-C Разделение микробной биомассы и раствора гидролизата фильтрованием Дополнительное осветление гидролизата ультрафильтрацией Выделение компонетов гидролизата ионным обменов в статических Вакуум-выпаривание элюата, содержащего смесь низших пептидов и аминокислот Распылительная сушка сконцентрованного элюата Рис. 10. Принципиальная схема получения белковых гидролизатов из микробной биомассы 3.2. Получение панкреатического гидролизата дрожжевой РНК Микробная биомасса содержит до 11% нуклеиновых кислот и может служить сырьем для получения микробной РНК, на основе которой возможно получение деринатов, представляющих собой смесь олигонуклеотидов. В частности, к таким деринатам относится панкреатический гидролизат РНК, который находит применение в медицине для лечения широкого круга заболеваний.

Объектом исследований данного этапа работы явилась РНК, выделенная из биомассы дрожжей p. Saccharomyces cerevisiae по ранее разработанной технологии [Волкова, 1996]. В качестве ФП была выбрана панкреатическая рибонуклеаза (РНК-аза) с активностью 14000 ед./мг.

Исследования кинетики гидролиза дрожжевой РНК панкреатической РНКазой и влияния АОБ на его эффективность проводились аналогично вышеописанным исследованиям по гидролизу микробных белков.

Было установлено, что в отличие от гидролиза микробных белков, в данном случае процесс может быть описан в одну стадию, а фермент подвергается как термоинактивации, так и ингибированию продуктами гидролиза (олигонуклеотидами):

Причем, согласно результатам расчетов с использованием схемы (6), вклад термоинактивации в общую инактивацию фермента не превышает 20%. Это объясняется высокой стабильностью данного фермента.

В результате обработки экспериментальных данных была доказана адекватность предложенной схемы, ее параметры приведены в табл. 7. Таким образом, можно сделать вывод о том, что ферментативный гидролиз и белков, и нуклеиновых кислот может быть описан единой кинетической схемой, в которой различаются только численные значения параметров и число лимитирующих стадий.

Значения эффективных констант и энергий активации отдельных стадий процесса ферментативного гидролиза дрожжевой РНК панкреатической РНК-азой А) в отсутствии АОБ Б) в присутствии АОБ d1-C7/ d1-C Путь Е, кДж/моль 30±2/10±1 (1,58 ± 0,21)·10-4/(1,77 ± 0,23)·10-4 450 ± 50/751,1 ± 82, 22±2/20±1 (7,90 ± 1,03)·10-5/(4,42 ± 0,57)·10-4 (6,67 ± 0,67)·10-4/(6,5 ± 0,7)·10- 20±1/13±1 (1,58 ± 0,21)·10-4/(2,74 ± 0,36)·10-4 100 ± 11/50,1 ± 5, K1d 25±2/23±2 (4,51 ± 0,59)·10-5/(2,56± 0,32)·10-4 0,67 ± 0, 07/0,64 ± 0, 35±3/44±5 (8,20 ± 1,07)·10-5/(3,07 ± 0,40)·10-5 (0,43 ± 0,05)/ (8,0 ± 1,0)·10- k2d kинd 46±4/42±4 (3,07 ± 0,40)·10-5/(2,75 ± 0,32)·10-4 (8,3 ± 1,0)·10-4/0,25 ± 0, K1d = 0,50 ± 0,04 л/моль, K’1d=0,42 ± 0,03 л/моль, Kиd=0,47 ± 0,04 л/моль Полученные кинетические схемы были использованы для подбора оптимальных условий гидролиза дрожжевой РНК, как в отсутствии, так и в присутствии интенсифицирующих факторов. Результаты расчетов приведены в табл. 8.

Условия ферментативного гидролиза дрожжевой РНК, для повышения эффективобеспечивающие степень гидролиза не менее 95% ности данного процесса цеНорма Вре Опти- Опти- Тип АОБ, его лесообразно использовать расхода мя маль- мальное концентрация, г/л, АОБ d1-C7, что приводит к фермен- гид- ная значе- мольное соотно- сокращению времени прота, % от ро- тем- ние рН шение АОБ: ферцесса и нормы расхода ФП страта гидранее полученными данныроли- 0,7 7 65±2ферментативного гидролиза был получен гидролизат, содерВ результате жащий не менее 70% олигонуклеотидов. Отделение продуктов гидролиза от ВМФ рибонуклеотидов осуществляли ультрафильтрацией на мембране УАМ-100. Ее применение позволяет сконцентрировать раствор в три раза и провести 2-х кратную промывку водой.

Выход продукта на стадии составляет 65%. Согласно литературным данным предлагается выделять олигонуклеотиды осаждением из водно-спиртового раствора. Однако предварительные исследования показали, что в этом случае степень осаждения продуктов гидролиза не превышает 80%. Это связано с дополнительным гидролизом РНК примесными РНК-азами в процессе ультрафильтрации, что приводит к увеличению выхода спирторастворимой фракции. Снижения ее выхода можно добиться двумя способами: 1) ведением процесса в стерильных условиях, однако, это приведет к значительному возрастанию энергозатрат; 2) введением в гидролизат на стадии ультрафильтрации ингибитора нуклеаз. Нами был выбран второй способ. В качестве ингибитора нуклеаз использовали миндальную кислоту, которая является медицинским препаратом и, следовательно, не может ухудшить качества гидролизата Исследования влияния концентрации миндальной кислоты на выход спирторастворимой фракции показало, что при ее добавлении в гидролизат в концентрации 0,115 г/л образование спирторастворимой фракции минимально, и выход олигонуклеотидов на стадии осаждения составляет не менее 95%. Осаждение смеси олигонуклеотидов из водно-спиртового раствора проводили при объемном соотношении спирт:вода 10:1 при температуре 4 – 6оС в течение 4 часов. Полученный осадок отделяли центрифугированием и высушивали в вакуум-сушильном шкафу при температуре не выше 60оС до остаточной влажности 5 – 6%.

Гидролиз дрожжевой РНК панкреатической РНК-азой в присутствии Отделение НМФ НКгидролизата ультрафильтрацией Осаждение НМФ НК гидролизата 10-кратным объемом этилового спирта Медицинская форма препарата панкреатического гидролизата Рис. 11. Принципиальная схема получения панкреатического гидролизата РНК.

Для получения лекарственной формы полученную суспензию растворяли в 0.65% растворе хлорида натрия до концентрации нуклеиновых компонентов 35 г/л, проводили стерилизующую фильтрацию через фильтр с диаметром пор 200, разливали в ампулы и стерилизовали в течение 30 – 35 мин при температуре 120оС.

Результаты испытаний, проведенных в соответствии с требованиями ВФС, показали, что полученный гидролизат не обладает токсичностью и апирогенностью.

Принципиальная схема получения панкреатического гидролизата приведена на рис. 11.

Технико-экономическая оценка разработанной технологии показала, что себестоимость панкреатического гидролизата РНК при мощности произодства кг/год составляет 190 тыс. руб/кг, что ниже, чем по известным технологиям в 1, раза.

3.3. Получение ферментативных гидролизатов на основе животного сырья В качестве сырья были выбраны отходы мясоперерабатывающих производств: кератинсодержащее сырье (на примере рого-копытного) и жиросодержащие отходы. Такой выбор обусловлен тем, что вышеперечисленные отходы являются наиболее крупнотоннажными и трудноутилизируемыми на мясокомбинатах.

Так, на мясокомбинатах средней мощности образуется до 560 т/год кератинсодержащих отходов и до 10 тыс. т/год жиросодержащих.

3.3.1 Получение ферментативных гидролизатов белковой природы из животного сырья (на примере кератинсодержащего) Кератинсодержащее сырье содержит до 85% сырого протеина, поэтому может быть переработано в белковый гидролизат. Характерной особенностью такого гидролизата является высокое содержание цистина и цистеина (до 11%). В связи с этим его можно использовать для балансировки аминокислотного состава белковых гидролизатов микробного происхождения, бедных серосодержащими аминокислотами. Однако более перспективным представляется получение на основе гидролизата кератинов препарата таурина — 2-аминосульфокислоты, находящего широкое применение в медицине и кормопроизводстве. Поэтому в данной работе были разработаны научные основы технологии получения таурина из кератинсодержащего сырья.

Первой стадией переработки кератинсодержащего сырья является экстракция кератинов водно-щелочными растворами, поскольку, как показали предварительные исследования, в кислой среде растворения кератинов не происходит. В качестве экстрагента был выбран раствор гидроксида натрия. На рис. 12 приведены типичные кривые экстракции кератинов, а также расходования щелочи в данном процессе. Исследования по влиянию начальной концентрации кератинов и щелочи в среде, а также температуры, показали, что процесс экстракции кератинов подчиняется уравнению первого порядка по кератинам. Кроме того, как показали результаты расчетов и экспериментов, расход щелочи в данном процессе также происходит по уравнению первого порядка, что может быть выражено следующей схемой последовательно-параллельных превращений:

Кинетика процесса подчиняется уравнению Аррениуса и специфического кислотно-основного катализа. В результате обработки экспериментальных данных была доказана справедливость схемы (7), и найдены значения ее параметров, которые представлены в табл. 9.

Значения параметров процесса экстракции кератинов водно-щелочным раствором Путь Е, кДж/ Кb, л/моль На основе разработанной кинетической схемы были предложены оптимальные тура 90оС, концентрация гидроксида натрия 0,2 моль/л; начальная концентра- Рис. 12. Кривые расходования гидроция кератинов в суспензии — 10%, ксида натрия (5) и накопления белковых время экстракции — 1 ч. При данных веществ: ВМФ (1), НМФ (2), аминного условиях степень экстракции кератинов азота (3), а также их сумма (4) в процессоставляла 95-97%, а соотношение ВМФ се щелочной экстракции кератинов.

и НМФ белковых веществ в экстракте — 3:2, причем степень деструкции аминокислот, прежде всего, цистина и аргинина, не превышала 5 — 7%, что контролировалось по накоплению в растворе свободных сероводорода и аммиака. Для получения таурина необходимо, чтобы не менее 70% белковых веществ в экстракте было представлено свободными аминокислотами. Поэтому полученный экстракт должен быть подвергнут дополнительной обработке с целью глубокого гидролиза белка.

Для этого было исследовано два варианта обработки: 1) проведение экстракции в более жестких условиях, что привело бы к гидролизу ВМФ кератинов до НМФ; 2) ферментативный гидролиз ВМФ белков в составе экстракта до пептидов и свободных аминокислот.

Что касается первого варианта, то на основе разработанной кинетической схемы были подобраны оптимальные условия экстракции кератинов, обеспечивающие 95%-ный выход НМФ белков. Ими оказались: температура 150оС, концентрация щелочи — 0,25 моль/л, время экстракции — 60-90 мин. Данные условия экстракции были проверены экспериментально: состав экстракта соответствовал расчетному. Однако полученный раствор имел интенсивную окраску, что существенно осложнило бы его дальнейшую очистку. Поэтому от такого варианта мы были вынуждены отказаться.

Что касается второго варианта, то, прежде всего, необходимо было выбрать ФП для гидролиза кератинов. В литературе отмечается, что до настоящего времени не удалось подобрать эффективных протеаз и пептидаз, а использование специфических кератиназ приводит к существенному удорожанию процесса. Поэтому мы оценили возможности применения для гидролиза кератина протосубтилина Г3х и ферментных систем ПЖ КРС, т.е. тех же ФП, которые использовались для гидролиза микробных белков.

Результаты опытов по последовательной обработке кератинов протосубтилином Г3х и ФС ПЖ КРС, а также повышению эффективности гидролиза с помощью АОБ приведены в табл. 10.

Обработка соответствующих серий экспериментальных данных показала, что кинетическое описание процесса ферментативного гидролиза кератиновых белков, как в отсутствии, так и в присутствии АОБ, аналогично ранее установленному для микробных белков, что позволило рассчитать для этого случая параметры схем (1) – (4), а также оптимальные условия их проведения, которые оказались близки к ранее полученным для гидролиза дрожжевых белков.

Оптимальные условия гидролиза кератинов и трансформации цистина и цистеина в таурин техническими ферментными препаратами в отсутствии интенсифицирующих факторов Наименование ферментативного про- Нор- Время Темпера- рН Тип Из полученных данных следует, что последовательное применение протосубтилина Г3х и ФС ПЖ КРС позволяет получать гидролизаты кератинов со степенью гидролиза белка не менее 70% а содержание цистина и цистеина в них составляет, соответственно, 0,33 и 0,17 моль/л. Такой гидролизат в дальнейшем может быть использован для получения таурина.

Процесс получения таурина основывается на биотрансформации цистина и цистеина. В качестве ФП для этого целесообразно использовать ферментные системы клеток печени КРС (ФСКП КРС), которые можно брать непосредственно на том же мясокомбинате, где и исходное сырье. Поэтому на следующем этапе исследований был изучен процесс трансформации цистина и цистеина в таурин ФС КП.

Из литературы известно, что биохимическая схема этого процесса сложная и многостадийная (рис.13).

Поэтому на первом этапе работы были изучены количественные закономерности трансформации индивидуальных аминокислот: цистина и цистеина. В ходе исследований было установлено, что процесс трансформации как цистина, так и цистеина, в таурин может быть описан одностадийной схемой превращений Михаэлиса-Ментен, т.е. в данном процессе можно выделить одну лимитирующую стадию. Процесс трансформации осложнен термоинактивацией ФС КП и их ингибированием таурином.

Рис. 13. Схема биосинтеза таурина В результате обработки экспериментальных данных было достигнуто адекватное описание всего массива экспериментальных данных и рассчитаны параметры данной кинетической схемы, приведенные в табл.11.

Полученные для индивидуальных аминокислот (цистина и цистеина) закономерности были опробированы для трансформации тех же аминокислот в таурина в составе гидролизата кератинов. Было установлено, что полученные закономерности полностью применимы к данном объекту. Однако, поскольку трансформация цистина происходит в более жестких условиях, то процесс трансформации гидролизата кератинов следует проводить в условиях, оптимальных для цистина, а именно: температура 35-40оС, рН 1,5, концентрации ФС КП 12,8 г/л по СВ, концентрации d1-C12 0,013 г/л. Таким образом, при трехкратной загрузке ФП через каждые 2 ч процесса выход таурина составляет не менее 70% от содержания цистина и цистеина в гидролизате.

После отделения взвешенных фильтрованием был получен раствор, содержащий 0,07 моль/л таурина на фоне 0,40 моль/л других аминокислот и 0,25 моль/л минеральных примесей, прежде всего, хлорида натрия. В данной смеси таурин является единственной аминокислотой, содержащей SO3H-группу, поэтому для его выделения было предложено использовать метод ионообменной сорбции на анионите, а в целях сокращения объема сточных вод, ионный обмен проводить в статических условиях. Среди исследованных анионитов (АВ-17-2, АВ-17, ЭДЭ-10П) наибольшей емкостью по таурину (0,17 г/г смолы) обладает анионит АВ-17-2 в Сl--форме. На рис. 14 приведены кривые сорбции таурина на анионит при различных концентрциях смолы в суспензии. Видно, что оптимальная концентрация ионита, обеспечивающая 95%-ную сорбцию таурина, составляет 5%. Несорбированная фракция, содержащая аминокислоты, низшие пептиды и минеральные примеси после проведения обессоливания может быть использована для получения кормового продукта.

Элюцию таурина, как следует из рис.15, следует проводить 6%-ным раствором хлорида натрия, причем с целью концентрирования таурина элюат повторно ис пользовать на стадии десорбции не менее 3-х раз.

Значения параметров процесса трансформации L-цистина и L-цистеина в таурин А) в отсутствии АОБ Субстрат Стадия трансформации субстрата Стадия инактивации фермента Б) в присутствии АОБ Путь (7,8± 1,0)·10-2 (1,3±0,2)·10-3 16,9±1,2 (2,9±0,4)·10-1 (6,7±0,5)·10- (3,7± 0,5)·10-2 (1,1±0,1)·10-2 21,8±1,5 (3,2±0,4)·10-1 (2,2± 0,2)·10- (3,8± 0,4)·10-2 (4,6±0,5)·10-2 23,2±2,2 (7,2± 0,7)·10-2 (1,7± 0,2) ·10- (4,7± 0,5)·10-4 0,015± 0,002 22,4±2,2 (2,9±0,3)·10-4 (4,7± 0,5)·10- kинd 20± К1d = 0,28±0,03 л/моль, Киd = 0,42±0,04 л/моль, К2d = 0,16±0,02 л/моль (2,6± 0,3)·10-2 (1,0±0,1)·10-1 21,9±1,5 (1,6±0,2)·10-1 (1,7±0,2)·10- (3,6± 0,5)·10-2 (6,7±0,7)·10-4 9,4±0,7 (9,0±0,1)·10-1 (1,0± 0,1)·10- (2,7±0,4)·10-2 (9,0±0,1)·10-1 13,9±1,0 (4,8±0,6)·10-1 (8,4± 0,9)·10- (2,8±0,3)·10-2 (3,1± 0,3)·10-2 15,4±1,6 (3,8±0,4)·10-2 (7,1± 0,7)·10- (2,7±0,3)·10-4 (2,8±0,2)·10-4 22,7±2,3 (2,7±0,3)·10-4 (5,5± 0,6)·10- kинd 24± K1d = 0,43±0,04 л/моль, Киd = 0,82±0,08 л/моль, К’1d = 0,23±0,02 л/моль Элюат, полученный на стадии ионного обмена, содержал 97 г/л таурина и г/л хлорида натрия. Его направляли на стадию кристаллизации, которую проводили в течение 3 ч при температуре 4-6оС. Степень осаждения таурина составила 90%. Полученный осадок в расчете на СВ содержал 62% основного вещества. С целью повышения качества конечного продукта проводили его перекристаллизацию из водно-спиртового раствора. Для этого осадок таурина растворяли в воде до концентрации основного вещества не менее 100 г/л, охлаждали до температуры 4оС и добавляли 10-ти кратный объем этилового спирта. Степень осаждения таурина составила 95%. Для достижения содержания основного вещества 96% необходимо стадию перекристаллизации проводить дважды. Влажный осадок на заключительной стадии технологического процесса высушивается в вакуум-сушильном шкафу при температуре не выше 70оС.

Принципиальная схема получения таурина приведена на рис. 16.

таурина на анионит АВ-17-2 из водного %-ного содержания анионита в суспензии.

Экстракция белковых веществ водно-щелочным раствором из кератинсодержащеГидролизат кератинов го сырья, гидролиз растворенных кератинов протосубтилином Г3х в присутствии Гидролиз кератиновых белков ФС ПЖ КРС в присутствии АОБ d1-C Трансформация цистина и цистеина в таурин в составе гидролизата ФС КП Осаждение из водного раствора и переосажденние из водно-спиртового раствора Рис. 16. Принципиальная схема получения таурина из кератинсодержащего сырья.

3.4. Получение гидролизатов на основе жиросодержащих отходов мясоперерабатывающей промышленности Другим крупнотоннажным отходом мясоперерабатывающих производств являются жиросодержащие отходы. Усредненный состав жировых отходов представлен в табл. 12, из которой следует, что жировые отходы представляют собой ценное сырье для получения жирных кислот.

Состав жировых отходов, образующихся на Можайском жирных кислот достигамясокомбинате ется при гидролизе этих Наименование показателя, размерность Значение отходов липазой. Поэтому показатель преломления при 60оС 1,4556 был исследован процесс Согласно вышеприведенной схеме исследований (рис.1), на первом этапе были изучены закономерности гидролиза жиров панкреатической липазой на модельном субстрате – оливковом масле. Предварительные исследования показали, что максимальная степень гидролиза масла при однократной загрузке ФП не превышает 25%. Было сделано предположение, что одной из причин столь низкого выхода продуктов гидролиза является неустойчивость эмульсии оливкового масла в воде. С целью повышения устойчивости эмульсии было предложено ввести стадию предварительной обработки субстрата ультразвуком. Было установлено, что при частоте 20 кГц и времени обработки эмульсии в течение 5 – 7 мин размер капель масла снижается с 15 – 16 до 2 – 3 мкм. При этом степень гидролиза оливкового масла панкреатической липазой возрастает до 51% (рис.17, табл. 13).

Исследование количественных закономерностей данного процесса показало, что он может быть описан одностадийной схемой ферментативных превращений с учетом термоинактивации фермента и его ингибированием продуктами гидролиза.

Параметры данной схемы превращений приведены в табл. 11. Анализ полученных результатов показал, что для обеспечения 95%-ной степени гидролиза оливкового масла панкретической липазой гидролиз следует проводить при оптимальных температурах и рН среды (см. табл. 14) в течение 6 ч. При этом норма расхода ФП составляет не менее 6% от массы субстрата. В связи с этим дальнейшие исследования были направлены на повышение эффективности данного процесса путем введения АОБ. Исследования по повышению эффективности гидролиза оливкового масла панкреатической липазой за счет введения в среду гидролиза АОБ проводились вышеописанным способом, их результаты приведены в табл. 15.

Рис. 17. Влияние времени обработки олив- ПЖ КРС и ФСКП КРС высокой гидрокового масла ультразвуком при частоте 20 фобностью среды. При этом норма кГц на выход продуктов его гидролиза пан- расхода ФП и время ферментолиза Значения эффективных констант и энергий активации процесса гидролиза оливкового масла панкреатической липазой. А) в отсутствии АОБ К1 = 140 ± 38 л/моль, Ки = 536 ± 51 л/моль Б) в присутствии АОБ d1-C7/ d1-C Путь Е, кДж/моль Ка, л/моль (1,56 ± 0,12)·10-5/(1,05 ± 0,1)·10-5 (3,72 ± 0,41) 10-3/4,02 ±0,43)·10- ks 28±2/25± (2,50 ± 0,20)·10-5/(1,28 ± 0,10)·10-5 (0,10 ± 0,01) 10-4/0,23 ± 0, kd 18± 2/25± (2,80 ± 0,30)·10-5/(2,81± 0,32)·10-5 (9,80 ± 0,10) 10-5/(9,2 ± 1,0) ·10- kинd 49±4/52± kd 19±2/19± К1d = 99 ± 10 л/моль/140 ± 12 л/моль К2d = 48 ± 5 л/моль/67 ± 6 л/моль, Kиd = 420 ± л/моль/280 ± 28 л/моль Подобранные на модельной системе оптимальные условия гидролиза жиров оказались оптимальными и для гидролиза жировых отходов.

Таким образом, были предложены пути утилизации двух крупнотоннажных отходов мясоперерабатывающих производств животного происхождения: кератин- и жиросодержащих Эколого-экономическая оценка разработанных технологий показала, что предотвращенный ущерб в данном случае составляет 1,37 млн. руб/год хода ФП, ч 3.5. Получение ферментативных гидролизатов на основе растительного сырья В качестве сырья была выбрана пивная дробина – отход пивоваренного производства. На пивоваренном заводе средней мощности образуется до 40 тыс. т/год пивной дробины. Ее состав приведен в табл.1. Углеводы дробины в среднем представлены на 20% крахмалом, на 80% - целлюлозой. Поэтому для полного гидролиза углеводной фракции дробины необходимо провести ее обработку как целлюлазами, так и амилазами. В качестве целлюлаз был выбран комплексный ферментный препарат целловиридин Г3х, а в качестве амилаз: панкреатическая -амилаза, расщепляющая 1,4-гликозидные связи, и глюкоамилаза Asp. awamori, расщепляющая также и 1,6-гликозидные связи.

На первом этапе исследований были проведены эксперименты по гидролизу вышеуказанными ФП модельных субстратов: целлюлозы и крахмала. Было установлено, что процесс гидролиза во всех случаях может быть описан одностадийной схемой ферментативных превращений, причем амилаза и глюкоамилаза в ходе гидролиза подвергаются только термоинактивации, а целловиридин помимо этого ингибированию конечным продуктом. Проведенная стандартная обработка экспериментальных данных позволила установить параметры кинетической схемы (табл.

16), а также рассчитать и в дальнейшем экспериментально проверить оптимальные условия гидролиза (табл. 17). Анализируя данные табл. 16, можно сделать вывод о том, что полный гидролиз полисахаридов возможен только при высоких (до 16%) нормах расхода ФП при общей продолжительности гидролиза до 16.

В связи с этим поиск путей повышения эффективности данного процесса очень важен. Аналогично ранее проведенным исследованиям для других ФП была изучена возможность применения АОБ для этой цели. Результаты исследований приведены в табл. 17. Из нее следует, что введение в среду ферментолиза АОБ позволяет существенно повысить скорость гидролиза. Как и следовало ожидать, наиболее эффективным для гидрофильной среды оказался АОБ d1-C7, применение которого позволяет повысить норму расхода ФП в 8 раз и во столько же раз сократить время гидролиза.

Полученные оптимальные условия были апробированы для гидролиза крахмала и целлюлозы в составе пивной дробины. Предварительные исследования показали, что для достижения 95%-ного расщепления углеводов в присутствии АОБ необходимо увеличить норму расхода каждого и ФП до 6%, а время гидролиза до 6 ч, что в три раза выше, чем для гидролиза очищенных субстратов. Причиной этого может быть высокая гетерогенность субстрата, наличие в нем белка, что затрудняет доступ молекул фермента к субстрату.

Значения эффективных констант и энергий активации процесса гидролиза крахмала:

А) -амилазой в отсутствии АОБ Б) -амилазой в присутствии АОБ d1-C7/d1-C 44 ± 3/18±1 (1,01 ± 0,13)·10-6/(5,37 ± 0,70)· 0- ka 87 ±6/31±2 (1,45 ± 0,19)·10 /(7,56 ± 0,98)· 15 ± 1/13±1 (1,66 ± 0,22)·10-4/(1,77 ± 0,23)·10-4 106,8 ± 11,8/72,5 ± 8, 32± 2/53±4 (1,37 ± 0,08)·10-3/(1,47 ± 0,19)·10-4 0,45 ± 0,05/0,67 ±0, k2d k’2d 28± 2/50±4 (1,37 ± 0,08)·10-3/(1,47 ± 0,19)·10-4 0,52 ± 0,05/0,30 ± 0, kинd 34± 3/37±4 (1,50 ± 0,09)·10-6/(1,50 ± 0,20)·10-6 0,063 ± 0,006/0,059 ± 0, К’1d = 0,80 ± 0,07 л/моль/0,70 ± 0,06 л/моль, К’2d = 1,05 ± 0,09 моль/л/0,87 ± 0,08 моль/л В) глюкоамилазой в отсутствии АОБ Г) глюкоамилазой в присуствии АОБ Путь Е, кДж/моль Ка, л/моль (7,12 ± 0,93)·10-5/(1,00 ± 0,13)·10-4 (2,0 ± 0,2)·10-3/(2,7 ± 0,3) ·10- k1d 45± 3/33± k2d 35±4/19± (1,26 ± 0,16) ·10-4/(9,50 ± 1,24)·10-6 (1,4 ± 0,1)·10-4/(4,3 ±0,4)·10- kинd 16±1/35 ± К1d = 1,5 ± 0,2 л/моль/1,2 ± 0,1 л/моль, К1d = 2,30 ± 0,23 л/моль/2,73 ± 0,27 л/моль Д) целлюлозы целловиридином Г3х в отсуствии АОБ Путь Е, кДж/моль К1 = 6,0 ± 0,5 л/моль, Ки = 18,1 ± 1,7 л/моль Е) целлюлозы целловиридином Г3х в присутствии АОБ Путь Е, кДж/моль kd 11±1/13 ±1 (2,32 ± 0,30)·10 /(1,74 ± 0,18)· K1d = 2,5 ± 0,2 л/моль/0,0031 ± 0,0002, Киd = 0,85 ± 0,06 л/моль/ 0,82 ± 0,06 л/моль Оптимальные условия гидролиза углеводных субстратов техническими ферментными препаратами Наименование ферментативного процесса Условия гидролиза С целью снижения гетерогенности субстрата и реализации комплексной переработки пивной дробины было решено на первом этапе проводить экстракцию из нее белковых веществ с получением в конечном итоге изолята ВМФ белка.

По аналогии с кератинсодержащим сырьем экстракцию белка проводили водно-щелочными растворами. Кинетические исследования показали, что процесс может быть описан той же схемой превращений. Однако, в отличие от кератинов, в данном случае не наблюдалось расходования щелочи в ходе экстракции. Это позволило учитывать в схеме превращений (7) только первый порядок по белку. Рассчитанные кинетические параметры приведены в табл. 18, на рис. 18 – кривые экстракции белка из пивной дробины в оптимальных условиях. Видно, что выход ВМФ белка не превышает 20%. В более жестких условиях экстракции выход снижается за счет увеличения скорости гидролиза ВМФ до пептидов и аминокислот.

Это заставило нас искать другие пути повышения выхода ВМФ. В качестве такого приема была выбрана обработка пивной дробины ультразвуком при комнатной температуре и частоте 20 кГц. Влияние времени ультразвуковой обработки на выход ВМФ белковых веществ показано на рис. 19, из которого следует, что оптимальное время обработки дробины ультразвуком составляет 15 мин. При этом выход ВМФ белков в ходе последующей водно-щелочной экстракции составляет 80 – 83%.

После проведения водно-щелочной экстракции пивную дробину отделяли фильтрованием, а из раствора осаждали «глобулиновую» фракцию белковых веществ в ИЭТ (рН 4,2-4,7). Степень осаждения белка составила 76% от содержания ВМФ белковых веществ в растворе, а содержание основного вещества 43% в расчете на СВ, а после переосаждения в тех же условиях увеличивалось до 83%.

Влажный осадок обезвоживали путем обработки одним объемом этилового спирта и сушили под вакуумом при температуре 60оС. Результаты проверки препарата на струю токсичность показали ее отсутствие.

Значения параметров процесса экстракции 0, белков пивной дробины водно-щелочным раствором 0,1 полученные количественные закономерности гидролиза крахмала и целлювремя, мин лозы соответственно амилазами и целловиридином были использованы для Рис.19. Влияние времени предваритель- оптимизации процесса гидролиза пивной ультразвуковой обработки на выход ной дробины после извлечения из нее ВМФ белковых веществ при последую- белковых веществ.

щей щелочной экстракции.

Для оптимизации процесса гидролиза углеводов пивной дробины необходимо было изучить влияние на данный процесс следующих факторов: последовательность обработки дробины ФП; возможность параллельной обработки несколькими ФП; способ последовательной обработки: внесение каждого следующего ФП непосредственно в гидролизат, либо предварительное отделение гидролизата, полученного на предыдущем этапе, фильтрованием, необходимость ультразвуковой обработки.

Результаты исследований показали, что на на первом этапе необходимо вносить в среду гидролиза амилазы. При этом степень конверсии субстрата при последующем гидролизе его целловиридином повышается на 15 – 20%. Это связано, вероятно, с тем, что гидролиз крахмала приводит к «разрыхлению» пивной дробины и за счет этого увеличвается поверхность взаимодействия целловиридина с клетчаткой. Последовательность внесения амилаз не оказывает влияния на выход продуктов гидролиза. Что касается отделения гидролизата от биомассы пивной дробины, то, как показали эксперименты, суммарная степень гидролиза субстрата практически не меняется. Однако конечная концентрация глюкозы в гидролизате не превышает 8 – 10 г/л, тогда как в первом варианте она составляет 30 – 35 г/л. В этом случае не требуется предварительного концентрирования гидролизата перед его использованием для культивирования микроорганизмов. Это исключает дополнительные энергозатраты и деструкцию углеводов при повышенных температурах.

Таким образом, вариант последовательного внесения ФП без отделения гидролизата на каждом этапе, безусловно, является предпочтительным. Предварительная ультразвуковая обработка также увеличивает степень конверсии углеводов пивной дробины. Кроме того, как было показано выше, она повышает выход белковой фракции. Таким образом, на основании проведенных исследований была предложена принципиальная схема переработки пивной дробины, представленная на рис.

20.

Отделение экстракта ВМФ белка фильтрованием Осаждение белковых веществ из Очистка белкового изолята переосаждением при рН 4,5 Отделение водорастворимой углеводной фракции фильтрованием Изолят глобулиновой фракции с содержанием основного ве- Раствор углеводной фракции, Рис. 20. Принципиальная схема переработки пивной дробины.

3.6. Общие подходы к переработке отходов пищевой и микробиологической промышленности с получением ферментативных гидролизатов белковой, углеводной, липидной и нуклеотидной природы На основе проведенных исследований по переработке отходов различного происхождения были выявлены общие закономерности ферментативного гидролиза и пути повышения его эффективности:

1) кинетические закономерности ферментативного гидролиза биополимеров как в индивидуальном виде, так и в составе природных субстанций могут быть описаны уравнением Михаэлиса-Ментен и отличаться лишь количеством лимитирующих стадий, а также наличием факторов, инактивирующих фермент и численными значениями параметров;

2) повысить эффективность ферментативных процессов можно за счет введения в среду гидролиза АОБ: в гидрофильной среде: d1-C7, в гидрофобной – d1-C12. Кинетическое описание процесса в этом случае также оказалось однотипным;

3) другим важным фактором, повышающим эффективность процесса гидролиза, является предобработка субстрата. Она может быть осуществлена путем обработки субстрата ультразвуком, либо, что более перспективно, путем химической обработки, что позволяет реализовать в ряде случаев комплексную переработку сырья;

4) стадии выделения и очистки гидролизата могут быть основаны на методах ультрафильтрации, ионного обмена и осаждения. Таким образом, предлагаемые схемы выделения не предусматривают применения дорогостоящих реагентов, а также предполагают минимальное использование органических растворителей. Это позволяет получать очищенный препарат в одну – две стадии, что способствует снижению его себестоимости.

На заключительном этапе исследований представлялось актуальным объяснить наблюдаемые общие закономерности повышения эффективности ферментативного гидролиза с помощью АОБ. Для этого были выполнены физико-химические исследования на модельных субстратах и высокоочищенных ФП.

3.7. Изучение физико-химических аспектов взаимодействия АОБ с гидролитическими ферментами и их субстратами.

Для выявления возможных механизмов взаимодействия АОБ с ферментами на начальном этапе работы были выполнены квантово-химические расчеты с использованием полуэмпирических методов.

Модели кристаллической структуры ферментов были получены из RCSB PDB (Research Collaboratore for structural Bioinformatic Protein Data Bank) под управлением Rutgers, the State University of New Jersey и San Diego Super Computer Center (SDSC) and Shaggs School of Phormacy and Pharmaceutical Science, а структуры АОБ были смоделированы с помощью пакета программ HyperChem 7.

В результате конформационного анализа d1-C7 в программе MULTIGEN было получено 8 конформеров, а d1-C12 – 148 конформеров. Каждый конформер был прооптимизирован в программе Hyperchem полуэмпирическим методом АМ 1 путем Single Point. В результате для каждого фактора была получена величина энергии связи, пропорциональная внутренней энергии соединения, минимальное значение которой отвечает наиболее устойчивой конформации. Эта величина для АОБ d1-C7 составляет (-431) кДж/моль, а для АОБ d1-C12 – (- 767) кДж/моль.

С помощью метода МО по величине энергии низшей вакантной молекулярной орбитали (НМВО) было установлено, что исследуемые АОБ проявляют нуклеофильные свойства. В молекулах АОБ имеются области положительного и отрицательного распределения электростатического потенциала.

Для того чтобы осуществить компьютерное моделирование взаимодействия АОБ с ферментами и субстратами в программе Hyperchem 7 была создана рабочая область, куда помещали высокомолекулярное соединение (фермент или субстрат), затем туда же вводили структуру одного из d1-факторов. Расчеты проводились при введении в рабочую область от 3 до 10 молекул АОБ на одну молекулу фермента, что соответствовало ранее установленному оптимальному мольному соотношению АОБ:фермент.

Исходя из строения ферментов, для каждого из них были выбраны аминокислоты, расположенные вблизи активного центра, но не входящие в его состав, с которыми возможны взаимодействия АОБ. На основе анализа химического строения молекул АОБ, ферментов и субстратов было сделано предположение, что наиболее вероятным типом взаимодействия между ними является образование водородных связей и гидрофобные взаимодействия. В табл. 19 приведены наиболее вероятные взаимодействия АОБ с аминокислотами ферментов, которые выбирались исходя из минимальной энергии связи и длины не более 3 – известной из литературы максимально возможной длины водородных связей.

Анализ данных табл. 19 подтверждает, что взаимодействие АОБ с ферментами осуществляется за счет слабых взаимодействий, прежде всего образования водородных связей. В результате происходит стабилизация пространственной структуры фермента вследствие снижения величины свободной энергии. В рассматриваемых случаях происходит, главным образом, образуются так называемые высокобарьерные водородные связи с энергией 2 – 15 кДж/моль.

Наиболее вероятные взаимодействия АОБ с гидролитическими ферментами Фермент / АОБ Аминокислота в составе фермента, тип взаимодействия Панкреатическая рибонуклеаза/d1-C Панкреатическая рибонуклеаза/ d1-C Трипсин / d1-C Трипсин / d1-C Липаза / d1-C Липаза / d1-C Следует отметить, что такой тип взаимодействия наблюдался, главным образом, для АОБ d1-C7 и тех ферментативных процессов, где гидролиз происходит в гидрофильной среде (все рассматриваемые случаи за исключением системы оливковое масло – панкреатическая липаза). Что касается АОБ d1-C12, то, как видно из табл. 19, в гидрофильной среде он в меньшей степени склонен к образованию водородных связей и гораздо более активен в гидрофобной среде (оливковое масло).

Помимо высокобарьерных водородных связей при взаимодействии АОБ с ферментами наблюдается образование низкобарьерных водородных связей с энергией более 80 кДж/моль. Такие взаимодействия наблюдаются между АОБ и ферментами в гидрофобной среде, а также между АОБ и аминокислотами сложного строения, например, аргинином или гистидином.

Поскольку, как следует из полученных результатов, на стабильность фермента оказывает влияние гидрофильность среды, то можно сделать вывод о том, что при взаимодействии АОБ с ферментами также имеют место гидрофобные взаимодействия. Вблизи гидрофобных углеводородных радикалов АОБ формируется слой структурированной воды. Молекулы воды, расположенные в непосредственной близости от молекул неполярных соединений, ограничиваются в своей возможной ориентации, что приводит к образованию оболочки или слоя из высокоупорядоченных молекул воды вокруг растворенного неполярного соединения. Для подтверждения наличия гидрофобных взаимодействий были проведены расчеты термодинамических функций состояния для исследованных ферментных систем. С помощью программы Hyperchem 7, используя параметрическую модель 3 (Метод РМ 3) находили исходные и конечные теплоты образования АОБ. На основе полученных данных с использованием закона Гесса были рассчитаны энтальпии химических реакций взаимодействия АОБ с ферментами. Таким же образом были рассчитаны энергия Гиббса и энтропия для этих реакций. Результаты расчетов приведены в табл. 20. Для сравнения там же приведены термодинамические функции состояния исследуемых ферментативных реакций в отсутствии АОБ. Из представленных данных следует, что в случае АОБ d1-C7, когда процесс происходит в гидрофильной среде, наблюдается повышение энтропии системы и снижение энергии Гиббса. Такая закономерность свидетельствует о повышении стабильности системы вследствие снижения ее гидрофобности. Оно происходит за счет «слипания»

гидрофобных углеводородных радикалов АОБ, что приводит к вытеснению структурированной воды и, как следствие, ее разупорядоченности.

Термодинамические функции состояния реакций ферментативного гидролиза модельных субстратов высокоочищенными препаратами гидролаз Модельная система фермент- субстрат Термодинамические функции состояния РНК масло РНК масло В случае АОБ d1-C12, а также гидролиза оливкового масла панкреатической липазой наблюдается противоположная закономерность, объясняемая увеличением гидрофобности системы.

Аналогичные расчеты были проведены для установления возможных типов взаимодействия АОБ с молекулами субстратов, в результате чего было установлено, что образование комплекса АОБ с такими субстратами как РНК и БСА связано с образованием водородных связей, а для крахмала и оливкового масла – гидрофобных взаимодействий.

После выяснения возможных типов взаимодействия АОБ с субстратами и ферментами мы перешли к доказательству наличия данных взаимодействий методом спектроскопии в ультрафиолетовой области. На рис. 21 приведены спектры поглощения d1-C7, d1-C12, РНК-азы, трипсина, БСА и дрожжевой РНК. Из представленных данных следует, что указанные вещества имеют близкие значения максимумов поглощения.

На рис. 22 – 23 приведены данные по изменению спектров поглощения в случае предынкубации БСА и трипсина с d1-C7 в течение различного времени. Из данных рисунков видно, с увеличением времени предынкубации наблюдается снижение величины поглощения на 20 – 40%, что, согласно, литературным данным, связано с образованием водородных связей.

Кроме того, с увеличением времени предынкубации АОБ наблюдается смещение максимума поглощения в сторону больших длин волн. Аналогичные зависимости были получены для всех исследованных в работе индивидуальных ферментов и субстратов.

Согласно литературным данным, исследования водородных связей проводят методом ИК-спектроскопии. Было установлено, что наиболее характерными полосами поглощения на ИК-спектрах изучаемых ферментов, АоБ и субстратов являются полосы, отвечающие ОН-группе, углеводородным радикалам, бензольному кольцу, -NH2-группе, карбоксильной группе.

Рис. 21. Спектры поглощения в ультра- Рис. 22. Влияние времени предынкубафиолетовой области спектра: 1 – БСА, 2 – ции d1-C12 с трипсином на спектр потрипсина, 3 – дрожжевой РНК, 4 – d1-C7, глощения трипсина. Время предынкубаd1-C12, 6 – панкреатической РНК-азы ции: 1 – 0 мин, 2 – 5 мин, 3 – 10 мин, 4 – Различия в ИК-спектрах обусловлены аминокислотным составом исследуемых ферментов Так, более высокое содержание в панкреатической РНК-азе Sсодержащих аминокислот приводит к появлению полосы поглощения 2600 – см-1, отвечающее SH-группе, а высокое содержание пролина в трипсине – к появлению полос поглощения 3500 – 3300 и 1650 – 1550 см-1, отвечающей иминам. На рис. 24 (а и б) представлены ИК-спектры для смеси БСА - трипсин полученные при времени предынкубации 0 – 2 мин и 20 – 25 мин. Для исследуемых объектов наибольший интерес представляет полоса поглощения в интервале 3200 – 3400 см-1, отвечающая ОН-группе.

Как видно из рис. 24, в начальные моменты взаимодействия АОБ с ферментами эта полоса сильная и узкая, а после взаимодействия происходит заметное расширение этой полосы до частоты 3600 см-1. Согласно литературным данным Рис. 23. Влияние времени предынкубации d1-C12 с БСА на спектр поглощения БСА.

Время предынкубации: 1 – 0 мин, 2 – мин, 3 – 10 мин, 4 – 15 мин, 5 – 20, мин.

Рис. 24. ИК-спектры интермедиата АОБ d1-C7 – трипсин при времени предынкубации: а) 0 – 2 мин, б) 20 – 25 мин

ВЫВОДЫ

1. Разработаны новые принципы интенсификации ферментативных процессов с участием промышленных гидролаз, основанные на введении в среду гидролиза природных стабилизаторов ферментов – микробных ауторегуляторных факторов d1, относящихся к классу алкилоксибензолов.

2. С использованием кинетического метода исследований установлены количественные закономерности процесса гидролиза белковых, липидных, углеводных и нуклеотидных субстратов высокоочищенными препаратами гидролаз. Установлено, что процесс гидролиза может быть описан в виде одно- или двухстадийной ферментативной реакции с использованием уравнения Михаэлиса-Ментен и осложнен инактивацией свободного фермента по уравнению первого порядка, а также в случае панкреатических липазы и РНК-азы ингибированием фермента продуктами гидролиза.

3. Предложенная кинетическая схема может служить основой для разработки алгоритма управления ферментативными процессами в производственных условиях. На ее основе установлено, что для достижения степени гидролиза субстратов не менее 90% норма расхода ферментов составляет 10 - 16%, а время гидролиза достигает 18 ч.

4. На примере высокоочищенных препаратов гидролаз показана эффективность применения АОБ для интенсификации ферментативного гидролиза. Показано, что в гидрофильных средах целесообразнее использовать АОБ d1-C7, а в гидрофобных - d1-C12. Установлено, что применение АОБ в количестве 0.01 – 0.1% от массы фермента позволяет сократить норму расхода последнего и время процесса в 2 – 9 раз.

5. На основе кинетического метода исследований показано, что в ходе на ферментативного гидролиза происходит образование промежуточных интермедиатов АОБ с ферментом и субстратом. С использованием квантово-химических и физико-химических методов исследований установлено, что взаимодействие АОБ с ферментом и субстратом происходит за счет образования водородных связей между гидроксильными группами АОБ и атомами азота, кислорода и серы, входящими в состав высокомолекулярных соединений (ферментов и субстратов), а также гидрофобных взаимодействий.

6. Показано, что вышеустановленные кинетические схемы полностью применимы к гидролизу природных субстратов препаратами технических гидролаз, а также к ферментам других классов, например, оксидазам печени быка, осуществляющим трансформацию цистина и цистеина в таурин. На основе полученных закономерностей предложены пути интенсификации с помощью АОБ гидролиза микробных и кератиновых белков протосубтилином Г3х, пивной дробины целловиридином Г3х, жиросодержащих отходов мясоперерабатывающей промышленности панкреатической липазой, дрожжевой РНК панкреатической РНКазой, позволяющие сократить норму расхода фермента и время гидролиза в 1, 7. Разработаны основы технологии получения белковых гидролизатов с различной степенью гидролиза на основе дрожжевых, бактериальных и кератиновых белков с выходом 20-25% от содержания белка в сырье, включающие стадии ферментативного гидролиза техническими ферментами протосубтилином Г3х, ферментными системами поджелудочной железы быка, осветления гидролизата ультрафильтрацией, ионообменной очистки на катионите КУ-2х8. Предложены кинетические схемы каждой стадии, позволившие установить оптимальные условия их проведения.

8. Разработаны основы технологии получения препарата таурина пищевого назначения с выходом 28% от содержания цистина в сырье на основе гидролизата кератинов путем трансформации серосодержащих аминокислот (цистина и цистеина) ферментными системами клеток печени быка. Подобраны оптимальные условия проведения стадий выделения и очистки таурина – ионного обмена и осаждения из водного и водно-спиртовых растворов.

9. Разработаны основы технологии переработки пивной дробины с получением белкового изолята с выходом 30% от содержания белка в сырье, и водорастворимой углеводной фракции с концентрацией РВ 30 г/л.

10. Проведена технико-экономическая оценка разработанных технологий в сравнении с базовыми, не предполагающими использования АОБ. Установлено, что применение последних позволяет снизить себестоимость продукции в 1,2 – 5, раз при сохранении ее качества за счет снижения норм расхода фермента и сокращения длительности технологического цикла в 1,3 -2,0 раза, что повышает эффективность работы оборудования.

Список публикаций по теме диссертации По теме диссертации опубликовано 60 работ, основными из которых являются следующие:

1. Красноштанова, А. А. Кислотный гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов. Количественные закономерности процесса. 1. Исследование модельной системы альбумин - серная кислота [Текст] / А. А. Красноштанова, И. А.

Крылов, М. Н. Манаков // Биотехнология. – М., 1996. – № 3. – с. 39 – 44. – ISSN 0234Красноштанова, А. А. Кислотный гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов. Количественные закономерности процесса. 2. Кинетика гидролиза белковых фракций дрожжей и бактерий [Текст] / А. А. Красноштанова, И. А.

Крылов, Б. С. Карпо, М. Н. Манаков // Биотехнология. – М., 1996. – №3. – с. 45 – 49. – 3. Красноштанова, А. А. Кислотный гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов. Количественные закономерности процесса. 3. Кинетика кислотной экстракции белковых веществ из клеток дрожжей и бактерий [Текст] / А. А.

Красноштанова, И. А. Крылов, М. Н. Манаков // Биотехнология. – М., 1996. – №3. – с.

50 – 55.– ISSN 0234-2758.

4. Красноштанова, А. А. Ферментативный гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов. Количественные закономерности процесса. 1. Кинетика гидролиза белковых фракций дрожжей протосубтилином [Текст] / А. А. Красноштанова, И. А. Крылов, М. Н. Манаков // Биотехнология. – М., 1998. – №6. – с. 50 – 5. Красноштанова, А. А. Ферментативный гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов. Количественные закономерности процесса. 2. Кинетика гидролиза белковых фракций дрожжей и бактерий протосубтилином [Текст] / А.А.

Красноштанова, И. А. Крылов, М. Н. Манаков // Биотехнология. – М., 1998. – №6. – с.

6. Красноштанова, А. А. Ферментативный гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов. Количественные закономерности процесса. 3. Гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов ферментными системами поджелудочной железы [Текст] / А. А. Красноштанова, И. А. Крылов, М.

Н. Манаков // Биотехнология. – М., 1998. – №6. – с. 63 – 68. – ISSN 0234-2758.

7. Красноштанова, А. А. Трансформация L-цистина и L-цистеина в таурин под действием ферментных систем клеток печени [Текст] / А. В. Соболева, А. А. Красноштанова, И. А. Крылов //Прикладная биохимия и микробиология. – М., 2004. –Т. 40., №3 – с.

8. Красноштанова, А. А. Трансформация L-цистина и L-цистеина в составе белкового гидролизата кератинов в таурин под действием ферментных систем клеток печени [Текст] / А. В. Соболева, А. А. Красноштанова, И. А. Крылов // Химическая технология. – М., 2004.–№ 11. – с. 18–22.

9. Красноштанова, А. А. Количественные закономерности процесса растворения природных кератинов [Текст] / А.В. Соболева, А. А. Красноштанова, И. А. Крылов // Химическая технология. – М., 2004. – № 10. – с. 6–10.

10. Красноштанова, А. А. Разработка ресурсосберегающей технологии получения рибонуклеазы из поджелудочной железы КРС [] / М. М. Баурина, А. А. Красноштанова, И.

А. Крылов // Химическая технология. – М., 2007. – Т.8, № 4. – с. 185 – 190.

11. Дудникова, Е. А. Выделение -амилазы из биомассы поджелудочной железы крупного рогатого скота [Текст] / Е. А. Дудникова, А. А. Красноштанова, И. А. Крылов // Химическая технология. – М., 2008. – Т. 9, № 4. – с. 182 – 188.

12. Красноштанова, А. А. Интенсификация ферментативных процессов гидролиза биополимеров [Текст] / А. А. Красноштанова, Т. А. Рукинова, Е. А. Кашкина, М. М. Баурина, И. А. Крылов, Г. И. Эль-Регистан // Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья. – М., 2000. – № 6. – с. 59-60.

13. Красноштанова, А. А. Способ получения и характеристика иммунокорректора нуклеинового ряда [Текст] / М. М. Баурина, А. А. Красноштанова, М. Е. Шабанова, И. А.

Крылов, Ю. М. Краснопольский // Нейроиммунология. – СПб., 2003. – Т.1, № 2. – с.

14. Красноштанова, А. А. Способ усиления пролиферантной активности костного мозга [Текст] / М. Е. Шабанова, В. В. Казаньев, М. М. Баурина, А. А. Красноштанова, И. А.

Крылов // Патогенез. – М., 2006. – Т.4., №1. – с. 71.

15. Krasnoshtanova, A. A. Transformation L-cystin and L-cystein into taurin with enzymatic system of bovine liver cells [Text] / A. V. Soboleva, A. A. Krasnoshtanova, I. A. Krylov // Industrial Application of Biotechnology. – New York, Nova Science Publisher, 2003. – с.

121– 130. – ISBN 1-60021-039-2.

16. Krasnoshtanova, А. А. Development of Resource-Saving Technology of Bovine Pancreatic Ribonuclease [Text] / M. M. Baurina, A. A. Krasnoshtanova, I. A. Krylov // Industrial Application of Biotechnology. – New York, Nova Science Publisher, 2005. – с. 55– 61. – ISBN 1-60021-039-2.

17. Krasnoshtanova, А. А. Elaborating Bases of Technology of Isolation of Amylase, Lipase and a Complex of Proteases from Cattle Pancreas [Text] / E. A. Dudnikova, A. A. Krasnoshtanova, I A. Krylov // Industrial Application of biotechnology. – New York, Nova Science Publisher, 2006. – с. 28 – 37. – ISBN 1-60021-039-2.

18. Красноштанова, А. А. Современные подходы к созданию экологических производств на основе комплексной переработки отходов пищевой и микробиологической промышленности, использующих современные достижения химии и биотехнологии [Тезисы] / Рукинова Т.А., Красноштанова А.А., Крылов И.А. // Тез. докл. IV Междунар.

конгресса «Окружающая среда для нас и будущих поколений: экология, бизнес, экологическое образование». – Самара-Астрахань-Самара, сентябрь 1999. –с.52.

19. Красноштанова, А. А. Интенсификация ферментативных процессов переработки отходов пивоваренной и мясоперерабатывающей промышленности с использованием ауторегуляторных факторов d микроорганизмов [Тезисы] / Крылов И.А, Красноштанова А.А, Рукинова Т.А. // Тез. докл. V Межд. конгресса "Окружающая среда для нас и будущих поколений: экология, бизнес, экологическое образование". – СамараАстрахань-Самара, сентябрь 2000. – с.74.

20. Красноштанова, А. А. Стабилизация индивидуальных ферментов и ферментных систем алкилоксибензолами [Тезисы] / Г. И. Эль-Регистан, Т. А. Карпекина, И.

Ю.Степаненко, Е. И. Крылова, Е. Ф. Шаненко, И. А. Крылов, А. А. Красноштанова, М. М. Баурина, Ж. Будран // Сборник трудов I Международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». – М., 2002. – с. 195-196.

21. Красноштанова, А. А. Гидролиз дрожжевой РНК под действием панкреатической рибонуклеазы. Количественные закономерности процесса [Тезисы] / М. М. Баурина, А.

А. Красноштанова, И. А. Крылов // Материалы научно-технической конференции «Технологии живых систем». – М., МГУПБ, 2003 г.

22. Красноштанова, А. А. Применение лекарственного препарата Энкад в качестве средства, стимулирующего гемопоэтическую функцию костного мозга [Тезисы] / М. Е.

Шабанова, М. М. Баурина, А. А. Красноштанова, И. А. Крылов // Сборник трудов (тезисов доклада) Международной конференции «Биотехнология и медицина». – М., 2006. – с. 142-143.

23. Основы биотехнологии [Текст]: учебное пособие для вузов / И. А. Крылов, А. А.

Красноштанова, Е. С. Бабусенко.– М.: РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2001 г. – с. 84; см. – 200 экз. – ISBN 5-7237-0270-X.

24. Общая биотехнология. Лабораторный практикум [Текст]: учебное пособие для вузов / А. А. Красноштанова, И. В. Шакир, Е. В. Парфенова, Н. А. Суясов, Е. С. Бабусенко, В.

Д. Смирнова. – М.: РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2008. – с. 120; 22 см. – 150 экз. – ISBN 978-5-7237-0682- 25. Комплексная переработка биомассы промышленных микроорганизмов [Текст]: учебное пособие для вузов / И. А. Крылов, А. А. Красноштанова, И. И. Гусева. – М.:

РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2001 г. – с. 84; 22 см. – 200 экз. – ISBN 5-7237-0327-7.

26. Красноштанова, А. А. Комплексная переработка биомассы промышленных микроорганизмов / И. А. Крылов, А. А.Красноштанова, И. И. Гусева // Биотехнология биологически активных веществ. Учебное пособие для студентов высших учебных заведений [Текст]; под ред. д.б.н. проф. МГУПП И. М. Грачёвой и д.б.н. проф. МГУПП Л.

А. Ивановой. – М.: Издательство НПО «Элевар», 2006. – с. 391 – 417.

27. Пат. 2095478 С1 Российская Федерация, МПК6 С 25 С 1/20. Способ извлечения золота из отходов [Текст] / Красноштанова А.А., Крылов И.А., Богдановская В.А., Тарасевич М.Р., Манаков М.Н.; заявитель и патентообладатель Российский химикотехнологический университет им. Д.И. Менделеева. – № 96108195/02; заявл.

25.04.1996; опубл. 10.11.1997. – 5 с.

28. Пат. 2115751 С1 Российская Федерация, МПК6 С 22 В 11/00, 7/00, 3/18. Способ извлечения драгоценных металлов [Текст] / Красноштанова А.А., Крылов И.А., Богдановская В.А., Тарасевич М.Р., Манаков М.Н.; заявитель и патентообладатель Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева. – № 97110752/02; заявл.

26.06.1997; опубл. 20.07.1998. – 4 с.

29. Пат. 2179579 С2 Российская Федерация, МПК7 С 12 Р 1/00. Способ получения низкомолекулярных фракций биологически активных веществ из клеточных биополимеров [Текст] / Красноштанова А.А., Крылов И.А., Баурина М. М., Кухаренко А. А., ЭльРегистан Г. И., Рукинова Т.А., Шабанова М.Е.; заявитель и патентообладатель Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева. – № 2000104372/13; заявл. 24.02.2000; опубл. 20.02.2002. – 4 с.

30. Пат. 2180918 C1 Российская Федерация, МПК7 С12 N 9/22. Способ получения панкреатической рибонуклеазы [Текст] / Красноштанова А. А., Баурина М. М., Кашкина Е. А., Крылов И. А.; заявитель и патентообладатель Российский химикотехнологический университет им. Д.И. Менделеева. – № 2000116984/13; заявл.

30.06.2000; опубл. 27.03.2002. – 4 с.

31. Пат. 2249040 С2 Российская Федерация, МПК7 С 12 Р 13/04, С 12 N 9/64. Способ получения таурина [Текст] / Красноштанова А.А., Соболева А.В., Крылов И.А.; патентообладатель Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева. – № 2003112648/13; заявл. 05.05.2003; опубл. 27.03.2005 Бюл. № 9. – 5 с.

32. Пат. 2274658 С2 Российская федерация, МПК С12 Р 19/34 (2006.01). Способ получения панкреатического гидролизата нуклеиновой кислоты [Текст] / Красноштанова А.А., Баурина М.М., Крылов И.А., Шабанова М.Е.; патентообладатель Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева. – № 2004102936/13; заявл. 03.02.2004; опубл. 20.04.2006 Бюл. № 11. – 5 с.

Список сокращений БСА – бычий сывороточный альбумин, АОБ – алкилоксибензол, СВ – сухое вещество, ФС ПЖ – ферментные системы поджелудочной железы, ФС КП – ферментные системы клеток печени, ФП – ферментный препарат, ИЭТ - изоэлектрическая точка, ФМФ - высокомолекулярная фракция, НМФ – низкомолекулярная фракция, НК - нуклеиновые кислоты, МО – молекулярная орбиталь, ДНБМ – денуклеинизированная биомасса.



 
Похожие работы:

«Малярчук Анастасия Александровна. Использование биологического ресурса энтомопатогенного Малярчук Анастасия Александровна   ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО РЕСУРСА ЭНТОМОПАТОГЕННОГО ГРИБА METARHIZIUM ANISOPLIAE(METCH.) SOR. ДЛЯ РЕГУЛЯЦИИ ЧИСЛЕННОСТИ КОЛОРАДСКОГО ЖУКА 03.00.32 – биологические ресурсы АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2009   Работа выполнена на кафедре биологической защиты растений в ФГОУ ВПО Новосибирский государственный...»

«Башков Александр Степанович – доктор сельскохозяйственных наук, профессор кафедры агрохимии и почвоведения МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ИЖЕВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ Научная библиотека Справочно-библиографический отдел Башков Александр Степанович Биобиблиографический указатель научных и методических работ за 1967–2012 гг. 2-е издание,...»

«Утвержден и введен в действие Постановлением Госстандарта СССР от 3 августа 1989 г. N 2518 МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ КРАСКИ ВОДНО-ДИСПЕРСИОННЫЕ ТЕХНИЧЕСКИЕ УСЛОВИЯ Water-dispersion paints. Specifications ГОСТ 28196- (в ред. Изменения N 1, утв. в июне 1992 г.) Группа Л МКС 87. ОКП Дата введения 1 июля 1990 года ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ 1. Разработан и внесен Министерством химической промышленности СССР. 2. Утвержден и введен в действие Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ “УТВЕРЖДАЮ” Проректор по учебной работе ВолГМУ профессор В.Б.Мандриков “ 19” мая 2007 г. РАБОЧАЯ ПРОГРАММА УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЫ ВНУТРЕННИЕ БОЛЕЗНИ Для специальности: 060112 – Медицинская биохимия Факультет: медико - биологический Кафедра: внутренних болезней педиатрического и стоматологического факультетов Курс – IV,V Семестр – VIII, IX, X Форма обучения - очная Лекции – 88 часов...»

«МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ ГРОДНЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ Кафедра биологической химии В. В. Лелевич С.С. Маглыш БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХИМИЯ тесты для студентов медико-психологического факультета Гродно 2013 УДК ББК Рекомендовано Центральным научно-методическим советом УО ГрГМУ (протокол №. от. 200. г.). Авторы: зав. каф. биологической химии, проф., д.м.н. В.В. Лелевич; доц. каф. биологической химии, к.б.н. С.С. Маглыш Рецензент: зав....»

«СОЦИАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ ема алкоголизма и, шире, алкогольного поведения людей может служить Т хорошей иллюстрацией идей феноменологов, описывающих функции и соотношение обыденных и научных теорий. Алкоголизм – с одной сто роны, предмет анализа многих экспертов: химиков, биологов, психологов, вра чей, криминологов, социологов и проч., а с другой – тема повседневного теоре тизирования “человека с улицы”. Р.М. Фрумкина в рецензии на книгу Дж. Цалле ра “Происхождение и природа общественного мнения”...»

«1 Г. С. Медведев, В. И. Тобиас, А. Ф. Емельянов, А. П. Расницын, В. А. Рихтер, С. В. Кононова, С. А. Белокобыльский Памяти М. А. Козлова (1936-2006) [G. S. Medvedev, V. I. Tobias, A. F. Emeljanov, A. P. Rasnitsyn, V. A. Richter, S. V. Kononova, S. A. Belokobylskij. To the memory of M. A. Kozlov (1936-2006)] 11 сентября 2006 г. ушел из жизни главный научный сотрудник Зоологического института РАН, доктор биологических наук, профессор Михаил Алексеевич Козлов. Оборвалась жизнь талантливого,...»

«Ж. Аграрная Россия, 2010,№3 ПИТАТЕЛЬНЫЕ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ПЛОДОВ РЯБИНЫ (SORBUS L.) В УСЛОВИЯХ СЕВЕРО-ЗАПАДНОЙ ЗОНЫ САДОВОДСТВА РОССИИ. Стрельцина С.А., Бурмистров Л.А., Никитина Е.В. Изучены плоды 18 образцов рябины (Sorbus L.) репродуцированных на Павловской опытной станции ВИР им. Н.И. Вавилова. Определяли содержание сухих веществ, сахаров, свободных титруемых кислот, сорбита, аскорбиновой кислоты, каротиноидов, хлорофилла, пектиновых веществ и различных групп биофлавоноидов....»

«МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТ имени М.В. Ломоносова ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ БАКИНСКИЙ ФИЛИАЛ А.А. Абрамов, Г.А. Бадун Методическое руководство к курсу Основы радиохимии и радиоэкологии МОСКВА - БАКУ 2011 Абрамов А.А., Бадун Г.А. Методическое руководство к курсу Основы радиохимии и радиоэкологии. Баку: Филиал Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, 2011 Утверждено учебно-методической комиссией Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова в качестве учебного пособия ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«*О СОКЕ РОСТКОВ ПШЕНИЦЫ и О ХЛОРОФИЛЛЕ* Целительная сила зеленых растений известна с древних времен. Все млекопитающие во время болезни придерживаются зеленой диеты. Это объясняется содержанием в растениях большого количества хлорофилла – зеленой крови мира растений, которая выполняет роль протеина. Хлорофилл - это основа всего растительного мира, он является самым первым продуктом солнечного света и в нём содержится больше световой энергии, чем в каком-либо другом элементе. Хлорофилл...»

«ВІСНИК ДОНЕЦЬКОГО НАЦІОНАЛЬНОГО УНІВЕРСИТЕТУ, Сер. А: Природничі науки, 2011, № 1 УДК 631.811.98:504.43 ВЛИЯНИЕ БУРОУГОЛЬНЫХ ГУМИНОВЫХ УДОБРЕНИЙ НА СНИЖЕНИЕ СТРЕССОВОЙ РЕАКЦИИ У РАСТЕНИЙ FESTUCA PRATENSIS HUDS. И. А. Рыктор, Ю. Н. Зубкова, А. В. Бутюгин Изучены адаптивне реакции овсяницы луговой в зависимости от состава грунтосмесей породы Авдеевского коксохимического завода, породы террикона и буроугольных органо-минеральных удобрений. Установлено существование корреляционных связей изменения...»

«Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный университет технологии и дизайна СТЕПАНОВА АННА БОРИСОВНА ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ЭКСПЛУАТАЦИИ НА МЕХАНИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПАРААРАМИДНЫХ НИТЕЙ Специальность 05.19.01 – Материаловедение производств текстильной и легкой промышленности ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: кандидат технических наук, доцент Лебедева Г. Г....»

«Учебно-методическое обеспечение для подготовки кадров по программам высшего профессионального образования для тематического направления ННС Нанобиотехнологии _ Учебно-методическое обеспечение для подготовки магистров по программам высшего профессионального образования направления подготовки Нанотехнология с профилем подготовки Нанобиотехнологии И.И. Олейникова УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДЛЯ МАГИСТРОВ ПО ДИСЦИПЛИНЕ БИОХИМИЯ УДК 577 ББК 28.072 О 53 О 53 Олейникова, И.И. Биохимия [текст]:...»

«Сергей Гомонов, Василий Шахов Будущее. Биохимик Алан Палладас изобретает вещество метаморфозы, и за ним начинают охотиться те, кто жаждет воспользоваться изобретением в политических целях. Подосланный киллер вступает в сговор с ученым, которого должен убить. Кто бы мог догадаться, что эти двое изменят судьбу всего мира – мира Эпохи Лицедеев?. Сергей Гомонов, Василий Шахов Тень Уробороса (Лицедеи) Второй роман из цикла Оритан. В память о забытом.. Фантастика, мистика, приключения 2 Тень...»

«ИНСТИТУТ ГЕОХИМИИ И АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. В.И. Вернадского РАН Лоренц Кирилл Александрович ПЕТРОЛОГИЯ МЕТЕОРИТНЫХ БРЕКЧИЙ ГРУППЫ HED И ПРОЦЕССЫ ПРЕОБРАЗОВАНИЯ ПОВЕРХНОСТНОГО СЛОЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВАННОГО АСТЕРОИДА диссертация на соискание ученой степени кандидата геолого-минералогических наук Научный руководитель: доктор геолого-минералогических наук М.А. Назаров Специальность 25-00-09 – геохимия, геохимические методы поиска полезных ископаемых Москва. 2009 г. 2 Содержание Введение... Цели и...»

«И.Рудаков доктор медицинских наук директор по науке А.Голубков кандидат химических наук главный технолог Е.Аксенова начальник отдела развития БИБЛИОТЕКА ДИСТРИБЬЮТОРА ПРАКТИЧЕСКОЕ РУКОВОДСТВО Биологически активные добавки кПРОДУКЦИИ СПРАВОЧНИК ПО пище (БАД) От авторов Задача настоящего руководства – представить читателю в компактном и удобном для использования виде современные сведения о биологически активных добавках (БАД) к пище, а также описания и рекомендации к применению БАД MIRRA. Раздел...»

«Н.В. Логинова ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ ПРОГРАММЫ РАЗДЕЛОВ ОБЩАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ И НЕОРГАНИЧЕСКИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА 1-31 05 01 Химия (по направлениям) Направление специальности 1-31 05 01-03 Химия (фармацевтическая деятельность) ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА Дисциплина фармацевтическая химия является одной из основных в комплексе химических и медико-биологических дисциплин, призванных обеспечить подготовку специалистов-химиков в области изыскания и исследования лекарственных средств. В...»

«Министерство здравоохранения Российской Федерации Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования ИРКУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ (ГБОУ ВПО ИГМУ Минздрава России) СИСТЕМА МЕНЕДЖМЕНТА КАЧЕСТВА АННОТАЦИИ К РАБОЧИМ ПРОГРАММАМ ДИСЦИПЛИН ОСНОВНЫХ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫХ ПРОГРАММ ПО НАПРАВЛЕНИЮ ПОДГОТОВКИ (СПЕЦИАЛЬНОСТИ) МЕДИЦИНСКАЯ БИОХИМИЯ СМК – ООП – 2013 Иркутск, 2013 Министерство здравоохранения Российской Федерации Государственное бюджетное...»

«Секция Геология 1 СЕКЦИЯ ГЕОЛОГИЯ ПОДСЕКЦИЯ ГЕОЛОГИЯ И ГЕОХИМИЯ ГОРЮЧИХ ПОЛЕЗНЫХ ИСКОПАЕМЫХ Особенности углеводородного состава биомаркеров нафтидов куонамской свиты Алексеев А.Г.1 Заведующий лабораторией кафедры высокомолекулярных соединений и органической химии ГОУ ВПО Якутский государственный университет им. М.К. Аммосова, Якутск, Россия E–mail: alexalekseev@rambler.ru Закономерности накопления органического вещества в бассейнах реки Оленек были изучены геологами и геохимиками СНИИГГиМСа. В...»

«ГЕОЛОГИЯ И ГЕОХИМИЯ НЕФТИ И ГАЗА ИССЛЕДОВАНИЯ БИТУМОВ В РАЗРЕЗАХ ПАРАМЕТРИЧЕСКИХ СКВАЖИН Аникеенко О.М. ПГНИУ, г. Пермь, Россия, E-mail: lelishna25@gmail.com Статья посвящена проблемам исследования битумов в разрезах параметрических скважин. Установлено высокое содержание битумов на больших глубинах. Рассмотрены структура и текстура битумов в разрезе Аракаевской скважины в широком интервале глубин. RESEARCH OF BITUMEN IN CUTS PARAMETRIC WELLS Anikeenko O.M. PSNRU, Perm, Russia, E-mail:...»






 
© 2014 www.kniga.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Книги, пособия, учебники, издания, публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.