WWW.KNIGA.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Книги, пособия, учебники, издания, публикации

 

Pages:   || 2 |

«(51) Int. Cl. C07K 14/325 (2006.01) (45) Дата публикации и выдачи патента C12N 15/82 (2006.01) 2013.12.30 (21) Номер заявки 200802018 (22) Дата подачи заявки 2007.03.16 ...»

-- [ Страница 1 ] --

019029 B1

Евразийское

(19) (11) (13)

патентное

ведомство

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ

(12)

(51) Int. Cl. C07K 14/325 (2006.01) (45) Дата публикации и выдачи патента C12N 15/82 (2006.01) 2013.12.30 (21) Номер заявки 200802018 (22) Дата подачи заявки 2007.03.16

ХИМЕРНЫЕ ГЕНЫ, КОДИРУЮЩИЕ ИНСЕКТИЦИДНЫЕ БЕЛКИ BACILLUS

(54)

THURINGIENSIS, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

(56) TANG WEI ET AL.: "Development of Insectresistant transgenic indica rice with a synthetic Cry1C* (32) 2006.03. gene" MOLECULAR BREEDING, vol. 18, no. 1, (33) EP; US August 2006 (2006-08), pages 1-10, XP (43) 2009.04.28 ISSN: 1380-3743 the whole document (86) PCT/EP2007/002342 WO-A- CAO J. ET AL.: "Broccoli plants with (87) WO 2007/107302 2007.09. pyramided Cry1Ac and Cry1C Bt genes control (71)(73) Заявитель и патентовладелец:

diamondback moths resistant to Cry1A and Cry1C БАЙЕР КРОПСАЙЕНС Н.В. (BE) proteins"

THEORETICAL AND APPLIED

(72) Изобретатель:

GENETICS, vol. 105, no. 2-3, August 2002 (2002-08), Ван Ри Йерун, Мелеватер Франк, Ван pages 258-264, XP002442157 ISSN: 0040-5752 the Элдик Гербен (BE) whole document EP-A- (74) B Представитель:

SCHUNMANN PETRA H. D. ET AL.: "A Медведев В.Н. (RU) suite of novel promoters and terminators for plant biotechnology."

FUNCTIONAL PLANT BIOLOGY, vol. 30, no. 4, 2003, pages 443-452, XP009086620 ISSN:

1445-4408 the whole document US-A1- Изобретение относится к последовательностям химерных генов, кодирующих инсектицидные (57) белки, продуцируемые штаммами Bacillus thuringiensis. Конкретно, предлагаются химерные гены, кодирующие белок Cry1С, белок Cry1B или белок Cry1D, которые применяются для защиты растений от повреждений насекомыми. Изобретение также относится к растительным клеткам или растениям, включающим такие гены, и способам их получения или применения, а также B растительным клеткам или растениям, включающим один из указанных химерных генов и по меньшей мере еще один из указанных химерных генов.

Введение Изобретение относится к последовательностям новых генов, кодирующих инсектицидные белки, продуцируемые штаммами Bacillus thuringiensis. Конкретно, предлагаются новые химерные гены, кодирующие белок Cry1C, которые применяются для защиты растений от повреждений насекомыми. Также сюда включены растительные клетки или растения, включающие такие гены, и сюда включены способы их получения или применения, а также сюда включены растительные клетки или растения, включающие такой химерный ген cry1C и по меньшей мере еще один ген, кодирующий инсектицидный белок, такой как одна из новых последовательностей генов, кодирующих белок Cry1B или белок Cry1D.

Уровень техники Штамм и белки, выделенные из Bacillus thuringiensls (обозначен здесь как "Bt"), хорошо известны благодаря их специфичной токсичности к насекомым-вредителям, и их использовали почти столетие назад для борьбы с насекомыми-вредителями. Сейчас доступны некоторые трансгенные виды растений, экспрессирующие Bt-белки, и они успешно ограничивают повреждения насекомыми на растениях.

Несмотря на выделение достаточного количества инсектицидных Bt-белков, только несколько Btбелков экспрессировали в трансгенных растениях, которые были коммерциализированы, и только в некоторых сельскохозяйственных культурах. Большинство коммерциализированных трансгенных Btрастений принадлежит к крупным полевым сельскохозяйственным культурам, таким как кукуруза и хлопок. В меньших товарных сельскохозяйственных культурах, таких как овощи, только несколько видов растений были трансформированы Bt-генами, для того чтобы предоставить им устойчивость к основным насекомым-вредителям в виде чешуекрылых, но в настоящее время не регулируется производство, и отсутствуют на рынке овощные культуры Bt-растений или семена, устойчивые к чешуекрылым. Zhao et al.

(2003) описали трансгенные растения брокколи, экспрессирующие Cry1Ac или Cry1C Bt-токсины, а также растения, полученные путем скрещивания между этими растениями, так чтобы оба токсина - Cry1Ac и Cry1C экспрессировались в одном и том же растении, но эти растения не были коммерциализированы.

NewLeaf ™ картофель, включающий ген cry3A, активный к жесткокрылым, был кратковременно коммерциализирован в Северной Америке, но удален с рынка в 2001 году.

В настоящем изобретение предлагаются новые гены, кодирующие белки Cry1C типа из Bt-белков, которые идеальны для объединения с генами, кодирующими белки Cry1B или Cry1D типа Bt-белков.

ДНК последовательности генов cry1C, cry1B или cry1D по изобретению и ДНК последовательности модифицированного транспортного пептида по изобретению (продемонстрированы в приложенном списке последовательностей) представляют собой синтетические гены, не обнаруженные в природе, и отличные от любой известной ДНК последовательности. Действительно, любая из ДНК последовательностей из SEQ ID No. 1, 3, 10, 14 или 16 демонстрирует по большей части 76,6% идентичности последовательности с известными родственными ДНК последовательностями.

В настоящем изобретении предлагается применение в растениях для борьбы с насекомыми нескольких новых генов, выделенных из Bt. Конкретно, такие гены применяют в овощных культурах сельскохозяйственных растений, конкретно, в растениях вида Brassicaceae, таких как цветная капуста, капуста, китайская капуста, репа, горчица, масличная культура рапса, кормовая капуста, брокколи, брюссельская капуста, горчичный шпинат и им подобные. Конкретно, в одном воплощении этого изобретения следующие растения вида Brassica защищают от насекомых с помощью новых генов по настоящему изобретению: В. carinata, В. elongata, В. fruticulosa, В. juncea, В. napus, В. narinosa, В. nigra, В. oleracea, В.

perviridis, В. rapa, В. rupestris, В. septiceps, В. tournefortii и им подобные, конкретно растения вида Brassica oleraceae или Brassica napus. Растения или семена, включающие по меньшей мере один из новых генов по изобретению, могут быть получены путем трансформации растительных клеток и получения растений или их семян, включающих гены по изобретению. Также сюда включены растения или семена, полученные путем скрещивания с трансформированным растением, содержащим, по меньшей мере, один из генов по изобретению, и с помощью применения обычных стадий разведения. Обычно любой вид растения, который следует защитить от вида насекомых, которые уничтожаются или контролируются с помощью Bt-белков, кодируемых новыми генами по этому изобретению, может быть трансформирован генами по изобретению для получения трансгенных растений и семян с повышенной устойчивостью к таким насекомым.

В одном воплощении, в настоящем изобретении также предлагается комбинация технологий, позволяющих получать наиболее оптимальный продукт с точки зрения управления устойчивостью. Действительно, в одном воплощении этого изобретения, растения по изобретению продуцируют по меньшей мере 2 различных Bt-белка, и такие белки кодируются генами cry по изобретению, имеющим высокий уровень экспрессии, которые были стабильно интегрированы, предпочтительно, в единственный локус генома растения. В одном воплощении изобретения по меньшей мере 2 таких Bt-гена включают ген cry1C и cry1B, cry1C и ген cry1D или комбинацию генов cry1C, cry1B и cry1D по этому изобретению. В воплощении изобретения маркерный ген, позволяющий быструю идентификацию трансгенных растений, предпочтительно ген устойчивости к гербициду, локализован в том же растении, конкретно, в том же локусе генома растения, что и ген cry по изобретению. В воплощении этого изобретения, маркерный ген В изобретении также предлагаются новые гены cry1B и cry1D, конкретно химерные гены cry1B или cry1D, которые могут экспрессироваться в растениях с высоким уровнем экспрессии, такие гены, как cry1B1 и cry1B2, и гены cry1D1 и cry1D2. Также здесь предлагаются растительные клетки, растения или семена, включающие любые из этих генов, и способы их получения или применения индивидуально или в комбинации.

Также в настоящем изобретении предлагаются новые гены, кодирующие инсектицидный белок, включающий функциональный интрон растения в их кодирующей последовательности. Также присутствие интрона служит гарантией, что экспрессия гена не приводит к получению функционального белка, когда ген находится в такой среде, где интрон не может быть сплайсирован, в такой среде, как бактерия или другой прокариотический организм. Присутствие этого интрона в последовательности гена также дает возможность гену экспрессироваться с получением высокого уровня в растениях.

Также сюда включены варианты белка Cry1C по изобретению, включающие последовательность из SEQ ID No. 2 от положения аминокислоты 29 до положения аминокислоты до положения аминокислоты 627, но где одна, некоторые или все из следующих аминокислот в следующих положениях заменены по сравнению с положениями в SEQ ID No. 2: аминокислота в положении 125 представляет собой Аланиин, аминокислота в положении 184 представляет собой Валин, аминокислота в положении 295 представляет собой Аргинин, аминокислота в положении 454 представляет собой Аспарагиновую кислоту или аминокислота в положении 593 представляет собой Аргинин. Также здесь предлагаются варианты белка Cry1B по изобретению, включающие последовательность из SEQ ID No. 11 от положения аминокислоты 31 до положения аминокислоты 64 8, но где аминокислота в положении 151 в SEQ ID No.11 представляет собой Тирозин или аминокислота в положении 353 в SEQ ID No. 11 представляет собой Аргинин, или белок, где аминокислота в положении 151 в SEQ ID No.11 представляет собой Тирозин и аминокислота в положении 353 в SEQ ID No. 11 представляет собой Аргинин.

Также в это изобретение включена новая последовательность ДНК, кодирующая транспортный пептид хлоропластов, конкретно ДНК, включающая последовательность из SEQ ID No. 16 от положения нуклеотида 7 до положения нуклеотида 371, конкретно последовательность из SEQ ID No. 16, а также такая последовательность ДНК из SEQ ID No.17, кодирующая вариант белка, такого как транспортный пептид хлоропластов, включающий последовательность из SEQ ID No. 17 от положения аминокислоты до положения аминокислоты 124, где аминокислота Cys в положении 55 заменена на Tyr и/или где аминокислота Gly добавлена после аминокислоты Gly в положение 51.

Конкретно, в настоящем изобретении предлагается химерный ген, включающий следующие функционально-связанные последовательности: а) область, кодирующая белок Cry1C, включающая последовательность ДНК из любой из последовательностей SEQ ID No. 1, 3, 4 или 6, или их варианта, и b) промоторную область, способную управлять экспрессией в растительных клетках. В одном воплощении такой промотор включает последовательность из SEQ ID No. 18 или 19. В другом воплощении химерный ген дополнительно включает 3'-область полиаденилирования и терминации транскрипции, конкретно, 3'область из гена, кодирующего НАДФ-зависимую малатдегидрогеназу из Flaveria bidentis. В другом воплощении химерный ген дополнительно включает расположенную между промотором и кодирующей областью лидерную последовательность гена Е1, специфичного для тапетума, из Oryza sativa.

В настоящем изобретении также предлагается последовательность ДНК, включающая любой из вышеуказанных химерных генов, которая дополнительно включает второй химерный ген, причем указанный второй химерный ген включает следующие функционально-связанные последовательности: а) вторую область, кодирующую белок Cry1B, включающую последовательность ДНК из SEQ ID No. 8 или 10, и b) вторую промоторную область, способную управлять экспрессией в растительных клетках; или предлагается последовательность ДНК, включающая любой из вышеуказанных химерных генов, которая дополнительно включает второй химерный ген, причем указанный второй химерный ген включает следующие функционально-связанные последовательности: а) область, кодирующую белок Cry1D, включающую последовательность ДНК из SEQ ID No. 12 или 14, и b) промоторную область, способную управлять экспрессией в растительных клетках. В одном воплощении предлагаются вышеуказанные последовательности ДНК, где указанная вторая промоторная область включает последовательность из SEQ ID No. 18 или 19 и отличается от указанной первой промоторной области; или где указанный второй химерный ген дополнительно включает 3'-область полиаденилирования и терминации транскрипции, конкретно, 3'-область из гена, кодирующего NADP-зависимую малатдегидрогеназу из Flaveria bidentis. В другом воплощении второй химерный ген в этих последовательностях ДНК дополнительно включает лидерную последовательность специфичного для тапетума гена Е1 из Oryza sativa, расположенную между промотором и кодирующей областью.

В настоящем изобретении также предлагаются вышеуказанные последовательности ДНК, дополнительно включающие третий химерный ген, причем указанный третий химерный ген включает следующие функционально-связанные последовательности: а) область, кодирующую белок Cry1D, включающую последовательность ДНК из SEQ ID No. 12 или 14, и b) промоторную область, способную управлять экспрессией в растениях.

Также в настоящее изобретение включены трансгенные растительная клетка или растение, включающие любые из вышеуказанных генов или последовательностей ДНК, стабильно инкорпорированных в их геном, предпочтительно, когда клетка или растение представляют собой растение или растительную клетку растения вида Brassica, конкретно вида Brassica oleraceae, более конкретно представляют собой капусту или цветную капусту.

Также в это изобретение включено применение любых из вышеуказанных химерных генов или последовательностей ДНК для борьбы с насекомыми-вредителями, чтобы получить растительные клетки, растения или семена с повышенной устойчивостью к насекомым; применение любых из вышеуказанных химерных генов или последовательностей ДНК для замедления или предотвращения развития устойчивости к инсектицидному белку, экспрессирующемуся в трансгенных растениях, у насекомых, которые пытаются кормиться такими растениями; или применение любых из вышеуказанных химерных генов или последовательностей ДНК для получения капусты, масличного рапса или цветной капусты, защищенных от Plutella xylostella.

Также сюда включены способы борьбы с насекомыми, включающие стадию посадки на плантации или посев в поле растений, включающих любые из вышеуказанных химерных генов или последовательностей ДНК; а также способы борьбы с насекомыми в растениях вида Brassica, включающие стадию экспрессии любых из вышеуказанных химерных генов или последовательностей ДНК в растениях; или способы получения растений или семян, устойчивых к насекомым, включающие стадии: а) получения растения, трансформированного геном по любому из пп.1-5 или последовательностью ДНК по любому из пп.6-12, и b) селекции потомства указанного растения или его семян, содержащих указанный ген или последовательность ДНК.

Также согласно этому изобретению предлагается химерный ген, включающий следующие функционально-связанные последовательности: а) первый фрагмент последовательности, кодирующей инсектицидный белок, b) интронную последовательность растения, с) второй фрагмент указанной кодирующей последовательности, d) промоторную область, способную управлять экспрессией в растительных клетках, и где инсектицидный белок не может быть получен из такого химерного гена в данной клеткехозяине, где интрон не сплайсирован; конкретно, такой химерный ген, где такой интрон представляет собой второй интрон гена ST-LS1 из Solanum tuberosum.

Дополнительно здесь также предлагается микроорганизм, включающий любые из вышеуказанных химерных генов или последовательностей ДНК, конкретно, такие организмы имеют происхождение из Escherichia, Bacillus or Agrobacterium.

Согласно этому изобретению "последовательность нуклеиновой кислоты" обозначает молекулу ДНК или РНК в одноцепочечной или двухцепочечной форме, предпочтительно молекулу ДНК. Используемый здесь термин "выделенная ДНК" обозначает последовательность ДНК, которая не является природной, или уже не встречается в окружающей среде, где она исходно присутствовала, например кодирующая последовательность ДНК, ассоциированная с другими регуляторными элементами в последовательности химерного гена, ДНК перенесенная в другую клетку-хозяин, такую как растительная клетка, или искусственная полученная синтетическим путем последовательность ДНК, имеющая отличную нуклеотидную последовательность по сравнению с любой природной последовательностью ДНК.

Согласно этому изобретению были сконструированы последовательности нуклеиновой кислоты, конкретно последовательности ДНК, кодирующие токсины Bt Cry или их варианты. Новые последовательности ДНК обозначены здесь, как сry1C1-4, сry1B1, сry1B2, сry1Dl и сry1D2, и кодируемые ими белки обозначены здесь, как белки Cry1C (например, Cry1C1, Cry1C3 и Cry1C4), Cry1B (например, Cry1Bl и Cry1В2) и белки Cry1D (например, Cry1Dl и Cry1D2). Также здесь предлагается новая последовательность ДНК, кодирующая модифицированный транспортный пептид хлоропластов, например, последовательность ДНК, включающая последовательность из SEQ ID No. 16 от положения нуклеотида 7 до положения нуклеотида 371, конкретно, последовательность из SEQ ID No. 16, которая предназначена для оптимальной экспрессии в растениях, конкретно, в овощах, таких как растения вида Brassicaceae plants, особенно, капуста и цветная капуста.

Согласно этому изобретению термин "белок Cry1C" обозначает любой инсектицидный белок, включающий кратчайший фрагмент аминокислотной последовательности из SEQ ID No. 2, который сохраняет инсектицидную активность (здесь и далее обозначается как "кратчайший токсический фрагмент"), конкретно, любой белок, включающий аминокислотную последовательность от положения аминокислоты 29 до положения аминокислоты 627 в SEQ ID No. 2, предпочтительно, любой инсектицидный белок, включающий аминокислотную последовательность из SEQ ID No. 2 от положения аминокислоты 3 до положения аминокислоты 627. Также сюда включен инсектицидный белок, включающий аминокислотную последовательность из SEQ ID No. 2 (также называемый здесь, как белок Cry1C1), из SEQ ID No.

5 (также называемый здесь, как белок Cry1С3) или SEQ ID No. 7 (также называемый здесь, как белок Cry1С4).

Белок Cry1C, включающий аминокислотную последовательность от положения аминокислоты -3до положения аминокислоты 627 в SEQ ID No. 2, сохраняет всю или почти всю инсектицидную активность цельного белка, какая производится в природе, и добавление белковых последовательностей в Nили С-концевой части не нарушает этой активности. Следовательно, в изобретении применяется и образует часть этого изобретения любой белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью, содержащей или включающей эту область. Эти белки включают инсектицидные гибридные или химерные белки, включающие кратчайший токсический белковый фрагмент из белка из SEQ ID No. 2. Также в это определение включены варианты белков, включающих аминокислотную последовательность от положения аминокислоты 29 до положения аминокислоты 627 в SEQ ID No. 2, такие как инсектицидные белки, включающие последовательность, имеющую на уровне аминокислотной последовательности идентичность последовательности с этой областью из SEQ ID No.2, по меньшей мере на 95%, конкретно по меньшей мере на 96, 97, 98 или на 99%, как определено с использованием глобального алгоритма сравнения Needleman-Wunsch в EMBOSS (Rice et al., 2000) с целью получить оптимальное сравнение по всей длине последовательностей использовали параметры по умолчанию (штраф за образование пробела 10, штраф за продолжение пробела 0,5; для сравнений аминокислотных последовательностей использовали матрицу EBLOSUM62), предпочтительно белки, имеющие несколько, предпочтительно 5-10, конкретно менее чем 5 вставок замен или делеций аминокислот без существенного изменения активности белка, предпочтительно без изменения инсектицидной активности белка. Предпочтительные варианты белка Cry1C по изобретению включают белок, включающий последовательность из SEQ ID No. 2 от положения аминокислоты 29 до положения аминокислоты 627, но где одна, несколько или все из следующих аминокислот в следующих положениях заменены по сравнению с положениями в SEQ ID No. 2:

аминокислота в положении 125 представляет собой Аланин, аминокислота в положении 184 представляет собой Валин, аминокислота в положении 295 представляет собой Аргинин, аминокислота в положении 454 представляет собой Аспарагиновую кислоту или аминокислота в положении 593 представляет собой Аргинин. Также сюда включены любые белковые варианты на основе белка Cry1C, гибриды или мутатны, сохраняющие, по существу, такую же инсектицидную активность, как и у определенного выше белка Cry1C по изобретению.

Используемая здесь терминология, где ДНК или белок "включают" определенную последовательность X, обозначает, что ДНК или белок включают или содержат, по меньшей мере, последовательность X, так чтобы можно было включить другие нуклеотидные или аминокислотные последовательности на 5'-конце (или N-конце) и/или 3'-конце (или С-конце), например (нуклеотидную последовательность), соответствующую белку маркера селекции, как описано в ЕР 0193259, (нуклеотидную последовательность) транспортного пептида и/или 5' или 3' лидерную последовательность.

Для целей этого изобретения термином "идентичность последовательности" двух родственных нуклеотидных или аминокислотных последовательностей, выраженная в процентах, обозначают количество положений в двух последовательностях с оптимальным сравнением, которые имеют идентичные остатки (100), деленное на количество сравниваемых положений. Пробел, т.е. положение при сравнении, где остаток присутствует водной последовательности, но отсутствует в другой, рассматривается как положение с неидентичными остатками. Сравнение двух последовательностей осуществляется с помощью алгоритма Needleman и Wunsch (Needleman and Wunsch 1970) в EMBOSS (Rice et al., 2000), с целью получить оптимальное сравнение по всей длине последовательностей использовали параметры по умолчанию (штраф за образование пробела 10, штраф за продолжение пробела 0,5).

Используемая здесь терминология "кратчайший токсический фрагмент" белка Cry по изобретению обозначает, что кратчайший фрагмент или часть белка Cry, сохраняющие инсектицидную активность, могут быть получены с помощью ферментативного гидролиза полноразмерного белка Cry, с использованием таких ферментов, как трипсин или химотрипсин, или терминология обозначает, что кратчайший фрагмент или часть белка Cry, сохраняющие инсектицидную активность, могут быть получены с помощью осуществления нуклеотидных делеций в последовательности ДНК, кодирующей белок Cry. Такой кратчайший токсический фрагмент также может быть получен путем обработки белка Cry с помощью желудочного сока насекомого, предпочтительно сока средней кишки, полученного от образцов насекомых, чувствительных к такому белку Cry (т.е., подверженных уничтожению или другому негативному воздействию на их рост, или питающихся этим белком).

Согласно этому изобретению термин "белок Cry1D" обозначает любой инсектицидный белок, включающий кратчайший токсический фрагмент аминокислотной последовательности из SEQ ID No. 15, конкретно, любой инсектицидный белок, включающий аминокислотную последовательность от положения аминокислоты 21 или 29 до положения аминокислоты 604 в SEQ ID No. 15, предпочтительно любой инсектицидный белок, включающий аминокислотную последовательность из SEQ ID No. 15 от положения аминокислоты 3 до положения аминокислоты 604. Также сюда включен инсектицидный белок, включающий аминокислотную последовательность из SEQ ID No. 13 (также называемый здесь, как белок Cry1D1) или из SEQ ID No. 15 (также называемый здесь, как белок Cry1D2). Белок Cry1D, включающий аминокислотную последовательность от положения аминокислоты 29 до положения аминокислоты 604 в SEQ ID No. 15 сохраняет всю или большую часть инсектицидной активности целого белка, какая производится в природе, и добавление белковых последовательностей в его N- или С-концевой части не -4нарушает этой активности. Следовательно, в изобретении применяется и образует часть этого изобретения любой белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью, содержащей или включающей эту область. Эти белки включают инсектицидные гибридные или химерные белки, включающие кратчайший токсический белковый фрагмент из белка из SEQ ID No. 15. Также в это определение включены варианты белков с отличной аминокислотной последовательностью от положения аминокислоты 29 до положения аминокислоты 604 в SEQ ID No. 15, такие как инсектицидные белки, включающие последовательность, имеющую на уровне аминокислотной последовательности идентичность последовательности с этой областью из SEQ ID No.15, по меньшей мере на 95%, конкретно по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98 или на 99%, как определено с использованием глобального алгоритма сравнения Needleman-Wunsch в EMBOSS (Rice et al., 2000) с целью получить оптимальное сравнение по всей длине последовательностей использовали параметры по умолчанию (штраф за образование пробела 10, штраф за продолжение пробела 0,5; для сравнений аминокислотных последовательностей использовали матрицу EBLOSUM62), предпочтительно белки, имеющие несколько, предпочтительно 5-10, конкретно менее чем 5 вставок замен или делеций аминокислот без существенного изменения активности белка, предпочтительно без изменения инсектицидной активности белка.

Согласно этому изобретению термин "белок Cry1B" обозначает любой инсектицидный белок, включающий кратчайший токсический фрагмент аминокислотной последовательности из SEQ ID No. 11, конкретно любой инсектицидный белок, включающий аминокислотную последовательность от положения аминокислоты 31 до положения аминокислоты 648 в SEQ ID No. 11, предпочтительно любой инсектицидный белок, включающий аминокислотную последовательность из SEQ ID No. 11 от положения аминокислоты 3 до положения аминокислоты 648. Также сюда включен инсектицидный белок, включающий аминокислотную последовательность из SEQ ID No. 11 или из SEQ ID No. 9. Белок Cry1B, включающий аминокислотную последовательность от положения аминокислоты 31 до положения аминокислоты 648 в SEQ ID No. 11, сохраняет всю или большую часть инсектицидной активности целого белка, какая производится в природе, и добавление белковых последовательностей в его N- или Сконцевой части не нарушает этой активности. Следовательно, в изобретении применяется и образует часть этого изобретения любой белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью, содержащей или включающей эту область. Эти белки включают инсектицидные гибридные или химерные белки, включающие кратчайший токсический белковый фрагмент из белка из SEQ ID No. 11. Также в это определение включены инсектицидные белки, включающие варианты аминокислотной последовательности от положения аминокислоты 31 до положения аминокислоты 648 в SEQ ID No. 11, такие как инсектицидные белки, включающие последовательность, имеющую на уровне аминокислотной последовательности идентичность последовательности с этой областью из SEQ ID No.11, по меньшей мере на 80%, конкретно по меньшей мере на 85, 90, 95, 96, 97, 98% или по меньшей мере на 99%, как определено с использованием глобального алгоритма сравнения Needleman-Wunsch в EMBOSS (Rice et al., 2000) с целью получить оптимальное сравнение по всей длине последовательностей использовали параметры по умолчанию (штраф за образование пробела 10, штраф за продолжение пробела 0,5; для сравнений аминокислотных последовательностей использовали матрицу EBLOSUM62), предпочтительно белки, имеющие несколько, предпочтительно 5-10, конкретно менее чем 5, вставок замен или делеций аминокислот без существенного изменения активности белка, предпочтительно, без изменения инсектицидной активности белка. Предпочтительные варианты белка Cry1B по изобретению включают инсектицидный белок, включающий последовательность из SEQ ID No. 11 от положения аминокислоты 31-648, но где аминокислота в положении 151 в SEQ ID No.11 представляет собой Тирозин, или аминокислота в положении 353 в SEQ ID No. 11 представляет собой Аргинин, или белок, где аминокислота в положении 151 в SEQ ID No. 11 представляет собой Тирозин, и аминокислота в положении 353 в SEQ ID No. 11 представляет собой Аргинин.

При использовании здесь термины ДНК или ген, как в "cry1C1-ДНК", обозначают любую последовательность ДНК, кодирующую белок Cry1C, Cry1B или белок Cry1D, соответственно, как определено выше. Эти термины включают определенные выше природные, искусственные или синтетические последовательности ДНК, кодирующие белки Cry1C, Cry1B или Cry1D, такие как любые из SEQ ID No. 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15. Также сюда включены последовательности ДНК, кодирующие инсектицидные белки, которые являются достаточно подобными любой из последовательностей ДНК из SEQ ID No. 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12 или 14, так что они могут гибридизоваться, (т.е. иметь способность) гибридизоваться с этими последовательностями ДНК при жестких условиях гибридизации. При использовании здесь, жесткие условия гибридизации конкретно обозначают следующие условия: иммобилизацию определенных последовательностей ДНК на фильтр и предгибридизацию фильтров в течение 1-2 ч или в растворе 50% формамида, 5% SSPE, 2 реагента Денхардт и в 0,1% SDS при 42°С, или в растворе 6SSC, 2 реагента Денхардт и в 0,1% SDS при 68°С. Затем непосредственно в предгибридизационный раствор добавляют меченный с помощью дигоксигенина или радиоактивно-меченый зонд, и проводят инкубацию в течение 16-24 ч при подходящей температуре, указанной выше. После инкубации фильты затем отмывают в течение 30 мин при комнатной температуре в растворе 2 SSC, 0,1% SDS с двумя последующими отмывками в течение -5мин каждая при 68°С в растворе 0,5SSC и 0,1% SDS. Радиоавтограф проявляют путем экспонирования фильтров в течение 24-48 ч на рентгеновскую пленку (Kodak XAR-2 или эквивалентной) при -70°С с усиливающим экраном. Конечно, эквивалентные условия и параметры могут использоваться в этом процессе с сохранением желаемых жестких условий гибридизации. Предпочтительные варианты последовательностей ДНК для cry1C, cry1B или cry1D по этому изобретению представляют собой последовательности ДНК, кодирующие варианты инсектицидного белка Cry1C, Cry1B или Cry1D, описанные выше.

Также, как здесь определено, сюда включены следующие последовательности в виде Cry1C-ДНК или гена: а) ДНК, включающая нуклеотидную последовательность из SEQ ID No. 1 от положения нуклеотида 85 до положения нуклеотида 2073, b) ДНК, включающая нуклеотидную последовательность из SEQ ID No. 3 от положения нуклеотида 85 до положения нуклеотида 2073, с) ДНК, включающая нуклеотидную последовательность из SEQ ID No. 1 от положения нуклеотида 85 до положения нуклеотида 2073, сшитую с последовательностью ДНК из SEQ ID No. 16, d) ДНК, включающая нуклеотидную последовательность из SEQ ID No. 4 от положения нуклеотида 7 до положения нуклеотида 2439, е) ДНК, включающая нуклеотидную последовательность из SEQ ID No. 3 от положения нуклеотида 85 до положения нуклеотида 2073, сшитую с последовательностью ДНК из SEQ ID No. 16, или f) ДНК, включающая нуклеотидную последовательность из SEQ ID No. 6 от положения нуклеотида 7 до положения нуклеотида 2439.

Также, как здесь определено, сюда включены следующие последовательности в виде Cry1D-ДНК или гена: а) ДНК, включающая нуклеотидную последовательность из SEQ ID No. 14 от положения нуклеотида 85 до положения нуклеотида 1812, или b) ДНК, включающая нуклеотидную последовательность из SEQ ID No. 12 от положения нуклеотида 7 до положения нуклеотида 2178.

Также, как здесь определено, сюда включены следующие последовательности в виде Cry1B-ДНК или гена: а) ДНК, включающая нуклеотидную последовательность из SEQ ID No. 8 от положения нуклеотида 7 до положения нуклеотида 2310, или b) ДНК, включающая нуклеотидную последовательность из SEQ ID No. 10 от положения нуклеотида 91 до положения нуклеотида 1944.

Последовательности ДНК генов Cry1C, Cry1B или Cry1D по изобретению (как продемонстрировано в списке последовательностей без последовательности транспортного пептида) демонстрируют по большей части только 76,6% идентичности последовательности с наиболее близкими известными ранее последовательностями ДНК, доступными в базах данных. Доступные базы данных последовательностей проверяли на последовательности с наиболее близкой идентичностью последовательностей с использованием хорошо известного алгоритма BLAST, и затем использовали глобальный алгоритм сравнения Needleman-Wunsch в EMBOSS (Rice et al., 2000) с целью обнаружения оптимального сравнения между наиболее близкими последовательностями и последовательностями по изобретению (рассматривая их полную длину и используя параметры по умолчанию - штраф за образование пробела 10, штраф за продолжение пробела 0,5). Для Cry1D-ДНК, фрагмент ранее известной последовательности ДНК (равной длины) был выбран с гарантией оптимального сравнения, но даже в таком случае идентичность с наиболее близкой последовательностью составила только 72,5% идентичности последовательности при сравнении с любыми известными последовательностями ДНК, приведенными в доступных базах данных.

Следовательно, также сюда включены следующие последовательности в виде генов cry1C, cry1B или cry1D, которые представляют собой последовательности ДНК, кодирующие инсектицидный белок, имеющий идентичность последовательности с любой из кодирующих последовательностей из SEQ ID No. 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12 или 14 или с последовательностями ДНК, кодирующими инсектицидный белок, который гибридизуется с любой из последовательностей из SEQ ID No. 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12 или 14 при жестких условиях гибридизации, предпочтительно жестко гибридизуется с той частью последовательности ДНК любой из последовательностей SEQ ID No. 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12 или 14, которая требуется для кодирования кратчайшего токсического белкового фрагмента белков по этому изобретению. Идентичности последовательностей ДНК, обозначенные здесь, рассчитывают с использованием глобального алгоритма сравнения Needleman-Wunsch в EMBOSS (Rice et al., 2000) с целью обнаружения оптимального сравнения по всей длине последовательностей, используя параметры по умолчанию (штраф за образование пробела 10, штраф за продолжение пробела 0,5; для сравнения последовательностей ДНК используют матрицу EDNAFULL), жесткие условия гибридизации определены выше.

При использовании здесь термин "инсектицидная активность" обозначает способность белка уничтожать насекомых, ингибировать их рост или вызывать уменьшение количества питания при проглатывании такого белка насекомыми, предпочтительно экспрессирующегося белка в рекомбинантном организме-хозяине, таком как растительная клетка. Понятно, что при использовании здесь активность по отношению к насекомым одного вида, предпочтительно к их личинкам, является достаточной для того, чтобы белок имел инсектицидную активность, хотя часто белки по изобретению оказывают влияние на насекомых других видов. Рекомбинантные организмы-хозяева, экспрессирующие по меньшей мере один из белков по изобретению - Cry1C, Cry1B или Cry1D, обычно создаются для определенного основного вида насекомого-вредителя, или их воздействие направлено на определенный основной вид насекомоговредителя для определенной сельскохозяйственной культуры или области, где такой вид насекомых является вредителем, например моль капустная для растения вида Brassica, но часто с другими насекомыми -6также можно бороться с помощью рекомбинантных организмов-хозяев по изобретению, таких как трансгенные растительные клетки или растения, например, могут служить иллюстрацией трансгенные растительные клетки растений по изобретению вида Brassica - цветной капусты или капусты или трансгенные растения по изобретению вида Brassica - цветная капуста или капуста, включающие ген cry1С и/или ген cry1B согласно изобретению.

При использовании здесь термины "количества для борьбы (с насекомыми)" белка или "борьба" с помощью белка или рекомбинантного организма-хозяина, экспрессирующего белок по изобретению, обозначают количество белка, которого достаточно для ограничения повреждения растению при поедании насекомыми такого растения, например, путем уничтожения насекомых или путем ингибирования развития насекомых, ингибирования их фертильности или роста таким образом, чтобы виды насекомых наносили меньшие повреждения растению. Это не означает, что обработка растений с помощью химических инсектицидов более не является необходимой (например, для контроля за видами насекомых, на которых белки по изобретению не оказывают влияния, таких как (дополнительные вторичные) насекомые-вредители вида жесткокрылых или двукрылых), но такая обработка с помощью химических инсектицидов насекомых, на которых направлено воздействие белков по изобретению, может быть существенно уменьшена или ее можно избежать, если получить приемлемую представленность трансгенных растений в поле и приемлемый выход трансгенных растений.

Согласно этому изобретению насекомые, чувствительные к новым белкам Cry по изобретению, контактируют с этими белками, представленными в количествах для борьбы с насекомыми, предпочтительно, в количествах, уничтожающих насекомое. В одном воплощении изобретения рекомбинантные организмы-хозяева по изобретению, такие как трансгенные растительные клетки или растения по изобретению, экспрессируют на высоком уровне белок или комбинацию белков по изобретению, так чтобы получить "высоко-дозовый" уровень. При использовании здесь термины" высокодозовый уровень", "устойчивость насекомого к высокой дозе" или "высокодозовая" экспрессия по отношению к рекомбинантной растительной клетке или растению обозначают концентрацию инсектицидного белка в растительной клетке или растении (измеренную с помощью метода ELISA в виде процента от общего растворимого белка, количество которого измеряют после экстракции растворимых белков в экстракционном буфере (например, в экстракционном буфере, описанном у Jansens et al., 1997) с использованием анализа по Бредфорду (Bradford) (Bio-Rad, Richmond, CA; Bradford, 1976)), причем инсектицидный белок уничтожает насекомое-мишень на стадии развития, на которой насекомое является существенно менее чувствительным, предпочтительно в 25-100 раз менее чувствительным к токсину, чем насекомое на первой личиночной стадии, и таким образом, можно ожидать гарантии полного уничтожения насекомого-мишени.

В одном воплощении это обозначает получение по меньшей мере 97%, предпочтительно по меньшей мере 99%, наиболее предпочтительно 100% смертности для четвертой личиночной стадии (для насекомых, имеющих 5 личиночных стадий) или для последней личиночной стадии (для насекомых, имеющих 4 личиночных стадии) насекомого-мишени по измерениям с помощью обычных инсектиционных биоанализов, предпочтительно биоанализов цельного растения через 10-14 дней после поглощения насекомым таких растительных клеток или растения с использованием обычных контролей. Существование одного вида насекомых-мишеней (т.е. вида насекомых, предпочтительно их личинок, которые могут вызывать существенные повреждения одному или разнообразным видам растений, и которые обычно представляют собой насекомых, для которых создано и разработано трансгенное Bt-растение), для которых трансформированные растительные клетки или растения согласно этому изобретению обеспечивают "высокодозовый" уровень инсектиционной устойчивости, который является достаточным для растения, созданного для получения "высокодозовой" экспрессии согласно этому изобретению. Предпочтительные насекомые для белков по этому изобретению представляют собой насекомых-вредителей растений, наносящих экономический вред.

При использовании здесь, термины "Cry1-белок/ДНК" или "Cry-белок/ДНК по этому изобретению", обозначают любой из белков Cry1C, Cry1B или Cry1D, или любую из последовательностей ДНК Cry1C, Cry1B или Cry1D, как здесь определено. При использовании здесь, Cry- или Cry1-белок может представлять собой полноразмерный белок, также называемый протоксином, или может представлять собой форму белка, усеченную настолько, чтобы сохранялась инсектицидная активность, или Cry- или Cry1-белок может представлять собой комбинацию различных белков, представленных в гибридном или сшитом белке. Термин "протоксин" обозначает полноразмерный инсектицидный кристаллический белок, поскольку он кодируется природной последовательностью Bt-ДНК, термин "токсин" обозначает его инсектицидный фрагмент, конкретно его кратчайший инсектицидный фрагмент, обычно с молекулярным весом, который находится в пределах примерно 50-65 кДа, конкретно, примерно 60 кДа, как определено с помощью SDS-PAGE-электрофореза путем использования обычного сравнения со стандартами молекулярного веса.

При использовании здесь термин "химерный ген" используется для обозначения гена или последовательности ДНК, включающих по меньшей мере два различных фрагмента ДНК (таких как промотор, 5'-нетранслируемый лидер, кодирующая область, интрон, 3'-нетранслируемая трейлерная последовательность и 3'-концевая область образования транскрипта и область полиаденилирования), которые не являются природно-ассоциированными друг с другом, или которые ведут происхождение из других источников. Обычно, при использовании здесь экспрессируемый в растении химерный ген представляет собой ген, включающий промоторную область, функционально-связанную с синтетической, искусственной кодирующей последовательностью, такой как любая из последовательностей генов сry1C, сry1B или сry1D no изобретению.

Последовательности ДНК, кодирующие белки Cry1 по изобретению, могут быть химически синтезированы с использованием обычных методов и могут быть вставлены в экспрессирующие векторы для продуцирования больших количеств белков Cry1. Белки Cry1 могут использоваться для получения специфичных моноклональных или поликлональных антител подходящим способом (Hofte et al., 1988) для разработки иммуноанализов (например, ELISA, Western-блотинг, покрытые антителами мерные стержни) для детекции присутствия или отсутствия этих белков в любом материале, таком как растительный материал.

Инструменты, разработанные для идентификации трансгенных растительных клеток, растений или растительных материалов, таких как листья или семена, включающие любые из генов сry1 по изобретению, интегрированных в их геном, или ДНК-содержащие продукты, которые включают или выделены из растительного материала, включающего ген сry1 по изобретению, основаны на определенных характеристиках последовательности новых генов по изобретению, таких как определенная рестрикционная карта геномной области, включающей интегрированный (чужеродный) ген сry1, молекулярные маркеры или последовательности чужеродной ДНК, интегрированные в геном растения.

Так как последовательность чужеродной ДНК, такой как последовательность генов сry1 по изобретению, является известной, то могут быть разработаны праймеры и зонды, которые специфично распознают эти последовательности в нуклеиновой кислоте (ДНК или РНК) образца с помощью молекулярнобиологического метода. Например, может быть разработан способ ПЦР для идентификации генов по изобретению в биологических образцах (таких как образцы растений, растительный материал или продукты, включающие растительный материал). Такой способ ПЦР основан по меньшей мере на двух специфичных "праймерах", например, один распознает последовательность внутри гена сry1, и другой распознает последовательность внутри ассоциированной последовательности транспортного пептида или внутри регуляторных областей, таких как промотор или 3'-концевая область химерного гена, включающих указанный ген сry1 по изобретению, или оба праймера специфично распознают последовательность гена сry1 по изобретению. Праймеры, предпочтительно, содержат последовательность размером между 15 и 35 нуклеотидами, которые при оптимизированных условиях ПЦР "специфично распознают" последовательность внутри химерного гена сry1 по изобретению, так что специфичный фрагмент ("интегрированный фрагмент" или дискриминирующий ампликон) амплифицируется из образца нуклеиновой кислоты, включающего ген сry1 по изобретению. Это означает, что при оптимизированных условиях ПЦР амплифицируется только интегрированный фрагмент-мишень и никакая другая последовательность в геноме растения или в чужеродной ДНК.

ПЦР-праймеры, подходящие для использования в изобретении, представляют собой олигонуклеотиды, размер которых находится в пределах от 17 нуклеотидов до примерно 200 нуклеотидов, включающих нуклеотидную последовательность, по меньшей мере, из 17 последовательно расположенных нуклеотидов, предпочтительно из 20 последовательно расположенных нуклеотидов, выбранных из последовательностей химерных генов сry1C, сry1B или сry1D, перенесенных в растительные клетки или растения по изобретению.

Конечно, размер праймеров может быть длиной более чем указанные 17 последовательно расположенных нуклеотидов, и может быть длиной, например, 20, 21, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200 нт или еще более. Праймеры могут полностью состоять из нуклеотидных последовательностей, выбранных из нуклеотидных последовательностей сry1. Однако нуклеотидная последовательность праймеров на их 5'-конце (т.е. вне области 3'-локализованных 17 последовательно расположенных нуклеотидов) является менее критичной. Таким образом, 5'-последовательность праймеров может состоять из нуклеотидной последовательности, выбранной из последовательности химерного гена сry1, по необходимости, но может содержать несколько (например, 1, 2, 5, 10) несоответствий. 5'-последовательность праймеров может почти полностью состоять из нуклеотидной последовательности, не связанной с генами сry1 по изобретению, такой как нуклеотидная последовательность, представляющая один или более сайтов распознавания ферментов рестрикции. Такие не связанные последовательности или фланкирующие последовательности ДНК, содержащие несоответствия, предпочтительно, должны быть не более чем 100 нуклеотидов, более предпочтительно, не более чем 50 нуклеотидов, или не более чем 25 нуклеотидов.

Кроме того, подходящие праймеры могут включать или состоять из нуклеотидной последовательности на их 3'-конце, охватывающей область соединения между геном сry1 по изобретению и ассоциированной последовательностью транспортного пептида или регуляторных элементов в последовательности химерного гена сry1, интегрированного в ДНК растения, такие как промоторная последовательность, лидерная последовательность, трейлерная последовательность или 3'-последовательность терминации транскрипции и последовательность полиаденилирования. Также будет сразу понятно специалисту в данной области, что выбранные подходящим образом пары ПЦР-праймеров также не будут включать При использовании здесь термин "праймер" охватывает любую нуклеиновую кислоту, которая способна инициировать синтез новой нуклеиновой кислоты в зависимом от матрицы процессе, таком как ПЦР. Обычно праймеры представляют собой олигонуклеотиды размером от 10 до 30 нуклеотидов, но могут применяться также более протяженные последовательности. Праймеры могут быть представлены в двухцепочечной форме, хотя одноцепочечная форма является предпочтительной. Зонды могут быть использованы в качестве праймеров, но в основном они создаются для связывания ДНК- или РНКмишени, и нет необходимости их использования в процессе амплификации.

При использовании здесь термин "распознающий" по отношению к специфичным праймерам обозначает тот факт, что специфичные праймеры специфично гибридизуются с последовательностью нуклеиновой кислоты в генах сry1 по изобретению при условиях стандартного протокола ПЦРидентификации, посредством чего специфичность определяется с помощью присутствия положительных и отрицательных контролей, что хорошо известно из уровня техники.

Также сюда включен набор реактивов для детекции генов сry1 по изобретению в биологическом материале, а также применение такого набора реактивов для скрининга биологического материала. При использовании здесь термин "набор реактивов" обозначает набор реагентов, предназначенных для целей осуществления идентификации генов сry1 по изобретению в биологических образцах. Более конкретно, предпочтительное воплощение набора реактивов включает по меньшей мере один или два специфичных праймера, как описано выше. Необязательно набор реактивов может дополнительно включать любой другой реагент, описанный здесь в протоколе ПЦР-идентификации. Альтернативно, согласно другому воплощению этого изобретения набор реактивов может включать специфичный зонд, как описано выше, который специфично гибридизуется с нуклеиновой кислотой биологических образцов, идентифицируя там присутствие генов сry1. Необязательно набор реактивов может дополнительно включать любой другой реагент (такой как, но не ограниченный ими, буфер для гибридизации, метку) для идентификации генов сry1 в биологических образцах с использованием специфичного зонда.

В уровне техники описаны стандартные протоколы ПЦР, такие как описанные в "PCR Applications Manual" (Roche Molecular Biochemicals, 2nd Edition, 1999). Оптимальные условия для ПЦР, включающие последовательность специфичных праймеров, определены в протоколе ПЦР-идентификации для каждого вида растения, содержащего ген. Однако понятно, что может быть необходимым изменять ряд параметров в протоколе ПЦР-идентификации к специфичным лабораторным условиям, и может быть необходима их небольшая модификация для получения сходных результатов. Например, при использовании другого метода получения ДНК может требоваться изменение, например, количества праймеров, полимеразы и используемых условий отжига. Подобным образом, выбор других праймеров может диктовать другие оптимальные условия для протокола ПЦР-идентификации. Однако эти изменения будут очевидны специалисту в данной области, и, кроме того, подробно описаны в использующихся в настоящее время руководствах по применению ПЦР, таких как цитированное выше.

Примеры подходящих комбинаций праймеров согласно изобретению представляют собой последовательности для гена сry1B по изобретению (последовательность 5' - 3'): Р1В227 (ТАС ТТС GAA CAG AAA GAA CGA GAA CGA G, SEQ ID No. 20) и Р1В228 (GTC CAG CGA AAG GAA CTC CAA GAA, SEQ ID No. 21), и для гена Cry1C по изобретению: Р1С247 (AAC CTT GAG GGA CTT GGA AAC, SEQ ID No. 22) и Р1С252 (AAG ATG AGG GTT TCT GAT AGC AG, SEQ ID No. 23). Следовательно, сюда включен любой ген, кодирующий инсектицидный белок Cry1B или Cry1C, и специфично распознаваемый этими праймерами, а также любой способ детекции таких генов с использованием таких или других специфичных праймеров.

Также для детекции последовательностей ДНК по этому изобретению могут быть созданы и включены сюда специфичные маркеры или зонды, относящиеся к любому из генов сry1C, сry1B или сry1D по изобретению. В одном воплощении этого изобретения специфичные маркеры, праймеры или меченные зонды не детектируют или распознают любое растение того же вида, представленное в качестве тестового растения, которое не содержит последовательности ДНК гена сry1 по изобретению, конкретно, такие маркеры, праймеры или меченные зонды не детектируют или распознают любое растение, экспрессирующее белок сry1C, сry1D или сry1B, где такое растение не содержит последовательности ДНК по изобретению (такую как ДНК сry1C, сry1D или сry1B, как здесь определено, например, ДНК, включающую последовательность любой из SEQ ID No. 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, или 14).

Последовательности ДНК по этому изобретению могут иметь небольшие модификации, чтобы предусмотреть присутствие более подходящих сайтов ферментов рестрикции, или для создания небольших изменений без изменения эффективности и предпочтительно без существенного изменения белка, который они кодируют. Действительно, хорошо известно, что из-за вырожденности генетического кода большинство аминокислотных кодонов может быть заменено на другие кодоны без изменения аминокислотной последовательности белка. Кроме того, некоторые аминокислоты могут быть заменены на другие эквивалентные аминокислоты без существенного изменения, предпочтительно, без изменения инсектицидной активности белка. Также маловероятно, что изменения в аминокислотной последовательности или композиции в областях молекулы, отличных от тех, что ответственны за связывание или Cry1-протоксина может быть удалена или заменена на другую аминокислотную последовательность без оказания влияния на инсектицидную активность белков Cry1 по изобретению). Эквиваленты последовательностей ДНК по изобретению включают последовательности ДНК, содержащие менее чем 20, предпочтительно 5-10 нуклеотидных отличий по сравнению с генами cry1 по этому изобретению, как здесь определено, но которые кодируют инсектицидный белок Cry1 по изобретению, как здесь определено.

Небольшие модификации в последовательностях ДНК, такие как описанные выше, могут быть осуществлены обычными способами, например с помощью ПЦР-опосредованного мутагенеза (Но et al.,1989, White et al., 1989). Более основательные модификации в последовательностях ДНК могут быть осуществлены обычными способами de novo синтеза ДНК желаемой кодирующей области с использованием доступных методов DNA.

При использовании здесь, термин "кодирующий" по отношению к гену, кодирующему белок, обозначает способность такого гена производить белок при транскрипции и трансляции кодирующей последовательности, содержащейся в таком гене в клетке-хозяине, которая является мишенью. Следовательно, химерный ген cry1C1 по изобретению кодирует белок Cry1C1 по изобретению, даже если этот ген содержит две кодирующие последовательности, прерванные некодирующей интронной последовательностью.

Термин "по существу, тот же" по отношению к аминокислотной последовательности белка Cry1 по изобретению обозначает, что этот белок включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности сравниваемого белка не более чем на 5%, предпочтительно не более чем на 2%; и по отношению к токсичности белка Cry, это обозначает, что в это понятие включают белок, чья величина LC50, полученная при тех же условиях биоанализа (предпочтительно, полученная в том же биоанализе с использованием насекомых из одной и той же популяции и с использованием подходящих контролей), отличается от соответствующей величины LC50 сравниваемого белка не более чем в 2 раза, предпочтительно не более чем на 50%.

При использовании здесь термин "микроорганизм" обозначает любой живой организм, который можно наблюдать только с помощью микроскопа, такой как бактерии, дрожжевые клетки, растительные клетки, вирусы, грибы. Этот термин включает все основные одноклеточные организмы с размерами ниже границ видимости, которые могут быть размножены и с которыми могут быть произведены манипуляции в лаборатории, обычно представляющие собой прокариотические или одноклеточные эукариотические формы жизни, включающие тканевые клеточные культуры и плазмиды.

Последовательности ДНК гена cry1 по изобретению, полученные из тотальной ДНК, могут быть лигированы в подходящие экспрессирующие векторы и трансформированы в подходящие клеткихозяева, которые могут быть затем скринированы с помощью обычных инструментов детекции на присутствие и экспрессию токсина.

Поиск в базах данных с использованием генов по этому изобретению выявляет, что последовательности ДНК по изобретению существенно отличаются от любых ранее описанных генов или последовательностей ДНК, кодирующих токсины с активностью против чешуекрылых (см., например, версию последовательностей ДНК, описанных в патентных заявках от 26.01.2006 (Geneseq выпуск 200602), Hofte and Whiteley, 1989; Crickmore et al., 1998; и обновление от 2.08.2005 вебсайта, соответствующего публикации Crickmore et al. (1998), который можно обнаружить по адресу: http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/ Neil Crickmore/Bt/ind ex.html).

Идентичность ближайшей последовательности на уровне ДНК (для всей длины последовательности по изобретению) в доступных базах данных последовательностей ДНК (доступных из патентной или научной литературы) составила 76,60% для ДНК cry1C из SEQ ID No. 1 или 3, и 73% для ДНК cry1B из SEQ ID No. 10, и 72,5% для ДНК cry1D из SEQ ID No. 14, при осуществлении сравнения с использованием определенных выше параметров по умолчанию Needleman-Wunsch в EMBOSS. Следовательно, исходя из того, что доступные базы данных последовательностей ДНК являются репрезентативными для всех известных последовательностей ДНК, последовательности ДНК по этому изобретению отличаются по нуклеотидной структуре по меньшей мере на 23% от установленной ранее последовательности ДНК.

Исходя из того, что ближайшие последовательности содержатся в доступных базах данных, это отражает отличие примерно в 485 нуклеотидов для нуклеотидной последовательности из SEQ ID No. 1 или 3, отличие примерно в 524 нуклеотидов для нуклеотидной последовательности из SEQ ID No. 10, и отличие примерно в 498 нуклеотидов для нуклеотидной последовательности из SEQ ID No. 14 с их соответствующими ближайшими опубликованными последовательностями ДНК. Это отличие будет еще более явным для последовательностей ДНК из SEQ ID No. 4, 6, 8 или 12, которые кодируют сшитый белок с транспортным пептидом. Также было обнаружено, что оптимизированная последовательность ДНК транспортного пептида хлоропластов по этому изобретению (SEQ ID No. 16), которая была адаптирована для экспрессии в растениях-мишенях по изобретению, имеет 76,1% идентичности последовательности (для соответствующей части равной длины с последовательностью SEQ ID No. 16) с ближайшими последовательностями ДНК, идентифицированными в доступных базах данных последовательностей ДНК, и, следовательно, обладает большим отличием.

- 10 С помощью терминов "инсектицидно эффективная часть (часть или фрагмент)" последовательностей ДНК, кодирующих белок Cry1, также обозначенных здесь, как "усеченный ген" или "усеченная последовательность ДНК", обозначается последовательность ДНК, кодирующая полипептид, который имеет меньше аминокислот, чем протоксиновая форма белка Cry1, но который еще остается инсектицидным.

С целью экспрессии всей последовательности ДНК или ее инсектицидно эффективной части, кодирующей белок Cry по этому изобретению, в рекомбинантном организме-хозяине, таком как Е. coli, в других Bt-штаммах или в растениях, могут быть введены подходящие сайты рестрикции, фланкирующие последовательность ДНК. Это может быть осуществлено с помощью сайт-направленного мутагенеза с использованием хорошо известных процедур (Stanssens et al., 1989; White et al., 1989). С целью получения повышенной экспрессии в растениях, гены cry1 по изобретению представлены в виде искусственных генов, где последовательность адаптировали для оптимальной экспрессии с помощью синтеза ДНК. В такой последовательности замена последовательностей ДНК, ингибирующих оптимальную экспрессию, достигается путем создания последовательностей ДНК, включающих кодоны, более предпочтительные для растений, предпочтительно для рода или вида растения-мишени.

Для получения повышенной экспрессии в растениях или для предотвращения экспрессии инсектицидного белка, когда он не присутствует в растительной клетке-хозяине (такого как в бактериальной клетке-хозяине), в одном воплощении изобретения характерный для растения интрон вставляют в химерные гены cry1 по изобретению, предпочтительно, в кодирующую область по меньшей мере одного из генов cry1 по изобретению. Может использоваться любой из известных характерных для растения интронов (например, Brown, 1986, Brown and Simpson, 1998, Brown et al., 1996) до тех пор, пока он является функционально-связанным с фрагментами кодирующей последовательности, так чтобы гарантировать корректный сплайсинг. Функциональная связь интрона и полученный в результате корректный сплайсинг обычно контролируется у вида растения-хозяина, которое является мишенью, или в его клетках, с помощью ОТ-ПЦР или с помощью Нозерн-блотинга, или с помощью любых других способов, известных из уровня техники. В одном воплощении интрон, характерный для гена двудольного растения используется в генах, которые должны экспрессироваться в клетках двудольного растения, и интрон, характерный для гена однодольного растения используется в генах, которые должны экспрессироваться в клетках однодольного растения. В одном воплощении, интрон по изобретению представляет собой второй интрон индуцируемого светом тканеспецифичного гена ST-LS1 из Solanum tuberosum (картофель), как описано у Eckes et al. (1986), например, нуклеотидная последовательность из SEQ ID No. 1, расположенная между нуклеотидами 672 и 862. В одном воплощении этого изобретения характерный для растения интрон вводят в любую последовательность, кодирующую инсектицидный Bt-белок, конкретно, интрон из SEQ ID No. 1, расположенный между положениями нуклеотидов 672 и 862, так чтобы он эффективно сплайсировался в растительных клетках. Эффективный сплайсинг в растительных клетках может быть измерен с использованием обычных методов, таких как ОТ-ПЦР, Нозерн-блотинг или детекция функционального белка, продуцируемого в растительных клетках. Конечно, для эффективного сплайсинга интроны необходимо вставить в корректное положение кодирующей последовательности, так чтобы были получены функциональные 5'- и 3'-сайты сплайсинга. Было обнаружено с помощью ОТ-ПЦР анализа, что каждый из двух генов cry по изобретению, продемонстрированных в SEQ ID No. 1 и 3, содержащих характерный для растения интрон в различных положениях, оба эффективно сплайсируются в растительных клетках Brassica oleraceae и производят мРНК, кодирующую ожидаемый белок Cry.

Согласно одному воплощению этого изобретения белки направляются во внутриклеточные органеллы, такие как пластиды, предпочтительно хлоропласты, митохондрии, или секретируются из клетки, что потенциально оптимизирует стабильность белка и/или экспрессию. Для этой цели, химерные гены по изобретению включают область, кодирующую сигнальный или направляющий пептид, связанный с областью, кодирующей белок Cry по изобретению. Особенно предпочтительные пептиды, включенные в белки по изобретению, представляют собой транспортные пептиды для направления в хлоропласты или другие пластиды, особенно дублированные области транспортных пептидов из генов растений, чей генный продукт направляется в пластиды, оптимизированный транспортный пептид, описанный у Lebrun et al. (1996), или Capellades et al. (US патент 5635618), транспортный пептид ферредоксинNADP+оксидоредуктазы из шпината (Oelmuller et al., 1993), транспортный пептид, описанный у Wong et al. (1992), и направляющие пептиды в опубликованной патентной заявке РСТ WO 00/26371. В одном воплощении изобретения транспортный пептид хлоропластов включает последовательность из SEQ ID No.

17 от положения аминокислоты 3 до положения аминокислоты 124 или ее варианты, такие как транспортный пептид хлоропластов, включающий последовательность из SEQ ID No. 17 от положения аминокислоты 3 до положения аминокислоты 124, где аминокислота Cys в положении 55 заменена на Tyr в SEQ ID No. 17 и/или где аминокислота Gly вставлена после аминокислоты Gly в положении 51 в SEQ ID No. 17. Также являются предпочтительными пептиды, являющиеся сигналами секреции белка, связанного с таким пептидом вне клетки, таким как сигнал секреции ингибитора протеиназы картофеля II (Keil et al., 1986), сигнал секреции гена альфа амилазы 3 риса (Sutliff et al., 1991) и сигнал секреции белка табака PR1 (Cornelissen et al., 1986).

Применяемые сигнальные пептиды согласно изобретению конкретно включают транспортный пептид хлоропластов (например, Van Den Broeck et al. (1985), или оптимизированный транспортный пептид хлоропластов патента US 5510471 и патента US 5635618, вызывающих транспорт белка в хлоропласты, секреторный сигнальный пептид или пептид, направляющий белок в другие пластиды, митохондрии, ЭР или другую органеллу. Сигнальные последовательности для направления белка во внутриклеточные органеллы или для секреции во внеклеточное пространство растительной клетки или к клеточной стенке обнаружены в природных направляемых к мишени или секретируемых белках, предпочтительно такие сигнальные последовательности, которые описаны в публикациях Klosgen et al. (1989), Klosgen and Weil (1991), Neuhaus & Rogers (1998), Bih et al. (1999), Morris et al. (1999), Hesse et al. (1989), Tavladoraki et al.

(1998), Terashima et al. (1999), Park et al. (1997), Shcherban et al. (1995), каждая из которых введена сюда с помощью ссылки, конкретно последовательности сигнальных пептидов направляемых к мишени или секретируемых белков растений вида Brassica, зерновых, хлопка или сои. Предпочтительная последовательность ДНК, кодирующая транспортный пептид по изобретению, представляет собой ДНК, включающая последовательность из SEQ ID No. 16 от положения нуклеотида 7 до положения нуклеотида 371, конкретно, последовательность из SEQ ID No. 16.

Кроме того, для любого насекомого-вредителя, выступающего в роли мишени, свойства связывания белков Cry по изобретению можно оценить с использованием методов, известных из уровня техники (например, Van Rie et al., 1990), для определения того, связываются ли белки Cry1 по изобретению с сайтами в средней кишке насекомого-мишени, которые не распознаются (или конкурируют за связывание) другими белками Cry или отличными от Cry. Связывание других Bt-токсинов с различными сайтами связывания у релевантных чувствительных насекомых, или других токсинов, выделенных из Bt-штаммов или других источников, (таких как VIP-токсины или ингибиторы протеиназ (кишечных) насекомых), с различным принципом действия, является также здесь очень важным для экспрессии в растении в дополнение к любому из генов cry1 для предотвращения или замедления развития устойчивости насекомого к инсектицидным токсинам, экспрессирующимся растением. Благодаря характеристикам новых генов cry1, они являются чрезвычайно полезными для трансформирования растений, например, однодольных, таких как зерновые или пшеница, или двудольных, таких как хлопок, соя или растения вида Brassica, для защиты этих растений от повреждения насекомыми.

Особенно для целей управления устойчивостью насекомых для определенного насекомоговредителя является предпочтительным объединять ген cry1C по этому изобретению с другим геном, кодирующим белок для борьбы с насекомыми, конкретно, кристаллический Bt-белок, который не распознает по меньшей мере один сайт связывания, распознаваемый таким белком Cry1C у насекомогомишени. Предпочтительные белки для борьбы с насекомыми для объединения с белками Cry1C по изобретению, конкретно, для одновременной экспрессии в растениях, предпочтительно в растениях вида Brassica, конкретно в капусте и цветной капусте, включают белок Cry1B по этому изобретению, белок VIP3Aa или его токсический фрагмент, как описано в публикациях Estruch et al., 1996 и в Патенте US 6291156, или инсектицидные белки из штаммов видов Xhenorhabdus, Serratia или Photorhabdus (например, Waterfield et al., 2001; ffrench-Constant and Bowen, 2000). В одном воплощении такую коэкспрессию получают путем трансформирования растения, уже экспрессирующего белок для борьбы с насекомыми, геном cry1 по изобретению, или путем скрещивания растений, трансформированных геном, кодирующим белок для борьбы с насекомыми, и растений, трансформированных геном cry1 по изобретению. Для растений вида Brassica, в качестве первого гена предпочтительно применяется ген cry1, и в качестве второго гена применяются гены, кодирующие белки Cry1B, Cry1D или VIP3Aa, или их варианты или производные. Способы получения экспрессии различных инсектицидных Bt-белков (или, подобным образом, для других белков для борьбы с насекомыми) в одном и том же растении с целью минимизировать или предотвратить развитие устойчивости к трансгенным устойчивым к насекомым растениям, описаны в патенте ЕР 0408403. В одном воплощении изобретения, ген cry1C по изобретению локализован в том же локусе, что и второй ген для борьбы за насекомыми, такой как ген cry1B или cry1D, в клетках трансгенного растения или в растениях по изобретению, так чтобы эти гены не сегрегировались в потомстве таких растительных клеток или растений.

Предпочтительно, в целях селекции, но также для повышения опций борьбы с сорняками, трансгенные растения по изобретению также трансформируются ДНК, кодирующей белок, инактивирующий гербициды широкого спектра действия, или трансформируются ДНК, кодирующей белок, который является вариантом белка-мишени для гербицида, но этот вариант белка является не чувствительным к такому гербициду, например, гербициду на основе глуфосината или глифосата.

Инсектицидно эффективный ген cry1, предпочтительно, химерный ген cry1, кодирующий инсектицидно эффективный участок протоксина Cry, может быть стабильно вставлен подходящим образом в ядерный геном растительной клетки, и трансформированная растительная клетка может применяться подходящим образом для получения трансформированного растения, которое является устойчивым к насекомым. В этом отношении, обезвреженная Ti-плазмида, содержащая инсектицидно эффективную часть гена cry1 в Agrobacterium, например, Agrobacterium tumefaciens, может применяться для трансформации растительной клетки, и после этого трансформированное растение может быть регенерировано из трансформированной растительной клетки с использованием процедур, описанных, например, в ЕР ("ЕР") 0242246 и в публикации De Block et al. (1989). Предпочтительные Ti-плазмидные векторы, каждый содержат инсектицидно эффективную часть гена cry, расположенную между пограничными последовательностями, или, по меньшей мере, локализованную слева от правой пограничной последовательности из Т-ДНК Ti-плазмиды. Конечно, другие типы векторов могут использоваться для трансформации растительной клетки с использованием процедур, таких как прямой перенос гена (как описано, например, в ЕР 0233247), опосредованная пыльцой трансформация (как описано, например, в ЕР 0270356, РСТ публикации WO 85/01856 и патенте US 4684611), трансформация, опосредрванная вирусной РНК растения (как описано, например, в ЕР 0067553 и патенте US 4407956), опосредованная липосомами трансформация (как описано, например, в US патенте 4536475), и другие способы, такие как способы трансформации определенных линий зерновых культур (например, US патент 6140553; Fromm et al., 1990;

Gordon-Kamm et al., 1990), и общий способ трансформирования однодольных растений (РСТ публикация WO 92/09696). Для трансформации хлопка особенно предпочтительным является способ, описанный в патентной публикации РСТ WO 00/71733. Для трансформации сои существует ссылка на способы, известные из уровня техники, например Hinchee et al. (1988) и Christou et al. (1990), или способ из WO 00/42207.

Также кроме трансформации ядерного генома в изобретение включена также трансформация плазмидного генома, предпочтительно, генома хлоропластов. Kota et al. (1999) описали способ экспрессии белка Cry2А в хлоропластах табака, и Lin et al. (2003) описали экспрессию гена cry1C в транспластомных растениях табака.

Полученное в результате трансформированное растение может использоваться в подходящей схеме разведения растения для получения большего количества трансформированных растений с одинаковыми характеристиками или для введения инсектицидно эффективной части гена в другие сорта тех же или родственных видов растений. Семена, которые получают из трансформированных растений, содержат инсектицидно эффективную часть гена cry в виде стабильной вставки в геном.

Инсектицидно эффективный ген cry1, предпочтительно, последовательность из SEQ ID No. 1, 3, или 6, вставляют в геном растительной клетки так, чтобы вставленный ген располагался ниже (т.е. 3') по отношению к промотору и под контролем промотора, который управляет экспрессией гена в растительной клетке (называемый здесь "способный к экспрессии в растении промотор"). Предпочтительно это выполняется путем вставки химерного гена cry1, включающего способный к экспрессии в растении промотор, в геном растительной клетки, конкретно, в ядерный или пластидный геном (например, хлоропластов). Предпочтительные способные к экспрессии в растении промоторы включают: основные сильные промоторы 35S ("35S-промоторы") вируса мозаики цветной капусты (CaMV) изолятов СМ 1841 (Gardner et al., 1981), CabbB-S (Franck et al., 1980) и CabbB-JI (Hull and Howell, 1987); 35S-промотор, описанный Odell et al. (1985), промоторы семейства убиквитина (например, убиквитиновый промотор маиса, описанные Christensen et al., 1992, см. также Cornejo et al., 1993), gos2-промотор (de Pater et al., 1992), emuпромотор (Last et al., 1990), актиновые промоторы из Arabidopsis, такие как промотор, описанный An et al. (1996), актиновые промоторы риса, такие как промотор, описанный Zhang et al. (1991); промоторы вируса мозаики жилки маниоки (WO 97/48819, Verdaguer et al. (1998)), серии промоторов pPLEX из Вируса Subterranean Clover Stunt (WO 96/06932), конкретно, дубликат промоторной области, выделенной из сегмента 4 или 7 вирусного генома subterranean clover stunt (обозначенные здесь как промоторы "S7S7" или "S4S4"), описанный у Boevink et al. (1995) или у Schunmann et al. (2003), промотор алкогольдегидрогеназы, например, pAdh1S (GenBank входные номера Х04049, Х00581), и TR1'-промотор, и TR2'промотор ("TR1'-промотор" и "TR2'-промотор", соответственно), которые направляют экспрессию генов 1' и 2', соответственно, из Т-ДНК (Velten et al., 1984). Альтернативно может использоваться промотор, который не является конститутивным, но скорее является специфичным для одной или более тканей или органов растения (например, листьев и/или корней), посредством чего вставленная часть гена cry экспрессируется только в клетках специфичной ткани (ей) или специфичного органа(ов). Например, инсектицидно эффективная часть гена cry может селективно экспрессироваться в листьях растения (например, кукурузы, хлопка) путем расположения инсектицидно эффективной части гена под контроль светоиндуцируемого промотора, такого как промотор малой субъединицы собственного гена растения рибулоза-1,5-бифосфат карбоксилазы или промотор гена из другого растения, такого как горох, как описано в Патенте US 5254799. Другая альтернатива использование промотора, чья экспрессия является индуцируемой, предпочтительно путем скарификации, такой как при кормлении насекомого, например, MPIпромотора, описанного у Cordera et al. (1994), или TR2'-промотора или промотора маннопин-синтазы из Agrobacterium (Velten et al., 1984), или промотора, индуцируемого химическими факторами.

Инсектицидно эффективная часть гена cry предпочтительно вставляют в геном растения так, чтобы вставленная часть гена располагалась выше (т.е. 5') подходящих 3'-концевых сигналов регуляции транскрипции (т.е. сигналы образования транскрипта и полиаденилирования). Предпочтительно, это выполняют путем вставки химерного гена cry1 в геном растительной клетки. Предпочтительные сигналы полиаденилирования и образования транскрипта включают такие сигналы из 3'-не транслируемой области гена, кодирующего НАДФ-зависимую малатдегидрогеназу из Flaveria bidentis (Marshall et al., 1996), из из T-DNA (Velten and Schell, 1985), которые действуют в качестве 3'-нетранслируемых последовательностей ДНК в трансформированных растительных клетках.

В одном воплощении этого изобретения по меньшей мере один из генов по изобретению, предпочтительно по меньшей мере 2 гена трансформируются в растения, выбранные из группы, состоящей из:

кукурузы, хлопка, кресса водяного, хрена, васаби, руколы, кресса, редиса, канолы, сои, овощных культур, растений вида Cruciferae, растений вида Brassicaceae, таких как цветная капуста, капуста, китайская капуста, репа, горчица, масличная культура рапса, кормовая капуста, брокколи, брюссельская капуста, горчичный шпинат и им подобных. Конкретно, в одном воплощении этого изобретения следующие растения вида Brassica защищают от насекомых с помощью генов по этому изобретению: В. carinata, В.

elongata, В. fruticulosa, В. juncea, В. napus, В. narinosa, В. hirta, В. rosularis, В. nigra, В. oleracea, В. perviridis, В. rapa, В. rupestris, В. septiceps, В. tournefortii и им подобные, конкретно, растения вида Brassica oleraceae (такие подвиды, как botrytis и capitata) или растения вида Brassica napus, а также растения следующего рода: Raphanus (такого как R. sativus), Armoracia (такого как A. rusticana), Wasabia (такого как W. japonica), Eruca (такого как Е. vesicaria), Nastrurtium (такого как N. officinale), и Lepidium (такого как L. sativum).

Изобретение включает вышеперечисленные растения вида Brassica, трансформированные по меньшей мере одним или двумя генами по изобретению, такими как гены cry1B и cry1C по изобретению, а также растения, полученные после скрещивания или бридинга с родственными растениями (включающими растения или родственные виды растений), которые содержат гены по изобретению. Такое скрещивание или бридинг могут быть осуществлены с использованием традиционных методов бридинга, известных из уровня техники, но могут также включать работу in vitro, такую как освобождение зародыша, слияние протопластов и подобные. Следовательно, изобретение также относится к растениям вида Brassicaceae, таким как В. napus, В. rapa, В. juncea или В. carinata, которые содержат ген или гены по изобретению, такие как гены cry1B и cry1C по изобретению, полученные из скрещиваний с трансформированным растением В. oleracea или его потомком, или с растениями В. oleracea, которые содержат ген или гены по изобретению, такие как гены cry1B и cry1C по изобретению, полученные из скрещиваний с трансформированным растением В. napus, и изобретение относится к применениям таких растений.

Трансформация растительных клеток также может использоваться для получения белков по изобретению в больших количествах в культурах растительных клеток, например, для получения белка Cry1, который затем может применяться в зерновых культурах после корректного включения в состав. Когда здесь делается ссылка на трансгенную растительную клетку, то этим обозначают растительную клетку (или также растительный протопласт), как таковой, в выделенном виде или в тканевой культуре, или обозначают растительную клетку (или протопласт), содержащуюся в растении или в дифференцированном органе или ткани, и обе возможности конкретно сюда включены.

Следовательно, ссылка на растительную клетку в описании формулы изобретения не предназначена для обозначения только выделенных клеток в культуре, но обозначает любую растительную клетку, где бы она ни была локализована, или в каком бы типе растительной ткани или органа не присутствовала.

Все или часть генов cry1 по изобретению, кодирующих белок, направленный против чешуекрылых, также могут использоваться для трансформации бактерий, таких как В. thuringiensis, которые обладают инсектицидной активностью против чешуекрылых или против жесткокрылых. Таким образом, может продуцироваться трансформированный Bt-штамм, который применяется для борьбы с широким спектром насекомых-вредителей в виде чешуекрылых и жесткокрылых или для дополнительной борьбы с насекомыми-вредителями в виде чешуекрылых. Трансформация бактерий, таких как бактерии рода Pseudomonas, Agrobacterium, Bacillus или Escherichia, генами cry1 по изобретению, введенными в подходящий носитель для клонирования, может проводиться подходящим способом, предпочтительно с использованием подходящих методов электропорации, как описано в публикации Mahillon et al. (1989) и в Патентной публикации РСТ WO 90/06999.

Трансформированные штаммы вида Bacillus, содержащие ген cry по этому изобретению, могут быть обработаны ферментами с помощью подходящих методов (Dulmage, 1981; Bernhard and Utz, 1993) для обеспечения высокого выхода продукта в клетках. В подходящих условиях, которые хорошо известны (Dulmage, 1981), каждый из этих штаммов спорулирует с получением кристаллических белков, содержащих высокий выход протоксина Cry.

Инсектицидная, конкретно, направленная против чешуекрылых композиция по этому изобретению может быть включена в состав подходящим способом с использованием микроорганизмов, трансформированных геном cry, или, предпочтительно, его соответствующими белками Cry, или протоксином Cry, токсином или инсектицидно эффективной частью протоксина в качестве активного ингредиента, вместе с подходящими носителями, разбавителями, эмульгаторами и/или дисперсантами (например, как описано в публикации Bernhard and Utz, 1993). Эта инсектицидная композиция может быть включена в состав в виде порошка смачивающегося, пилюль, гранул или пылеобразного вещества, или в виде жидкого состава с водными или неводными растворителями, представленного в виде пенки, геля, суспензии, концентрата и т.д.

включать применение (например, распыление) инсектицидного количества белков Cry или клетокхозяев, трансформированных геном cry по этому изобретению, в локусе, который необходимо защитить.

Локус, который необходимо защитить, может включать, например, место обитания насекомыхвредителей или растущую растительность, или область, где растительность должна расти.

В одном воплощении этого изобретения насекомые, против которых могут применяться гены cry или белки Cry1 по изобретению, включают насекомых, выбранных из группы, состоящей из: Plutella xylostella, Spodoptera exigua, Spodoptera littoralis, Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Heliothis virescens, Mamestra brassicae, Pieris brassicae, Manduca sexta, Choristoneura fumiferana, Choristoneura occidentalis, Choristoneura rosaceana, Pandemis pyrusana, Platynota stultana, Lymantria dispar, Orgyia leucostigma, Malacosoma disstria, Lambina fiscellaria, Chilo suppressalis, Chilo partellus, Scirpophaga incertulas, Argyrotaenia citrana, Artogeia rapa, Chrysomela scripta, Ostrinia nubilalis, Pseudoplusia includens, и Thaumetopoea pityocampa. В одном воплощении Plutella xylostella (моль капустная) является предпочтительным насекомымвредителем, которое является мишенью. Это представленный во всем мире вид, который вызывает огромные потери в некоторых крестоцветных растениях, конкретно в растениях вида Brassicacaea. Белки Cry1C, Cry1B и Cry1D, кодируемые генами по этому изобретению, конкретно применяются для борьбы с этим насекомым, например, путем экспрессии генов по изобретению в клетках растения.

С такими насекомыми можно бороться путем посадки на плантации или выращивании в поле растений, включающих любой из генов cry1C по изобретению, или путем сохранения присутствия белка Cry1C, как определено здесь, в растениях или на растениях, осаждаемых такими насекомыми (например, путем посева или посадки на плантацию растения вида Brassica, такого как капуста или цветная капуста, трансформированного геном cry1C1 или cry1С2 по этому изобретению, или путем распыления композиции, содержащей белок Cry1C по этому изобретению). Изобретение также относится к применению генов cry1 по этому изобретению, по меньшей мере, генов cry1C1 или cry1С2 в растениях для их защиты от чешуекрылых насекомых-вредителей, предпочтительно, в комбинации с геном cry1B или cry1D по этому изобретению.

В настоящем изобретении также предлагается модифицированная последовательность, кодирующая транспортный пептид хлоропластов. Такая кодирующая последовательность содержит применяемые кодоны, адаптированные для высокой экспрессии в растениях, конкретно в растениях вида Brassicaceae, таких как Brassica oleracea или Brassica napus, особенно в капусте, цветной капусте или масличном рапсе (каноле). В одном воплощении изобретения модифицированный транспортный пептид включает нуклеотидную последовательность из SEQ ID No. 16 от положения нуклеотида 7 до положения нуклеотида 371, конкретно, последовательность из SEQ ID No. 16. Также в изобретение включены растительные клетки, растения или семена, включающие последовательность, кодирующую модифицированный транспортный пептид по изобретению, а также применение этой последовательности, кодирующей транспортный пептид для направления любого белка в хлоропласты, конкретно в хлоропласты овощных растительных культур, конкретно растений вида Brassica.

Эти и/или другие воплощения этого изобретения отражаются в содержании формулы изобретения, которая образует часть описания изобретения.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, которые не рассматриваются как ограничение изобретения или правовой охраны. Если не оговорено иначе, все методы рекомбинантной ДНК проводили согласно стандартным протоколам, как описано в публикации Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY и в публикации Ausubel et al. Volumes 1, 2 (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Стандартные материалы и методы для молекулярной работы с растениями описаны в публикации Plant Molecular Biology Labfax (1993) by R.D.D. Croy published by BIOS Scientific Publications Ltd (UK) and Blackwell Scientific Publications, UK.

Далее следует прилагаемый список последовательностей, обозначенных в примерах, формуле изобретения и в описании изобретения.

SEQ ID No.1: оптимизированная последовательность, кодирующая Cry1C1, включающая интрон в положении 672.

SEQ ID No.2: аминокислотная последовательность белка Cry1C1, кодируемого SEQ ID No. 1.

SEQ ID No.3: оптимизированная последовательность, кодирующая Cry1С2, включающая интрон в положении 489.

SEQ ID No.4: оптимизированная последовательность, кодирующая Cry1С3, включающая последовательность из SEQ ID No. 1 и SEQ ID No. 16, кодирующая белок, сшитый с транспортным пептидом.

SEQ ID No.5: белок Cry1C3, кодируемый SEQ ID No. 4.

SEQ ID No.6: оптимизированная последовательность, кодирующая Cry1С4, включающая последовательность из SEQ ID No. 3 и SEQ ID No. 16, кодирующая белок, сшитый с транспортным пептидом.

SEQ ID No.7: белок Cry1C4, кодируемый SEQ ID No. 6.

SEQ ID No.8: оптимизированная последовательность, кодирующая Cry1B1, включающая последовательность, кодирующую транспортный пептид.

SEQ ID No.9: белок Cry1Bl, кодируемый последовательностью из SEQ ID No. 8.

SEQ ID No.10: оптимизированная последовательность, кодирующая Cry1B2.

SEQ ID No.11: белок Cry1B2, кодируемый последовательностью из SEQ ID No. 10.

SEQ ID No.12: оптимизированная последовательность, кодирующая Cry1Dl, включающая последовательность, кодирующую транспортный пептид.

SEQ ID No.13: белок Cry1Dl, кодируемый последовательностью из SEQ ID No.12.

SEQ ID No.14: оптимизированная последовательность, кодирующая Cry1D2.

SEQ ID No.15: белок Cry1D2, кодируемый последовательностью из SEQ ID No. 14.

SEQ ID No.16: последовательность, кодирующая оптимизированный транспортный пептид хлоропластов.

SEQ ID No.17: транспортный пептид хлоропластов, кодируемый последовательностью из SEQ ID No. 16.

SEQ ID No.18: дублированная промоторная последовательность (S7S7) вируса S7 subterranean clover stunt.

SEQ ID No.19: дублированная промоторная последовательность (S4S4) вируса S4 subterranean clover stunt.

SEQ ID No. 20: праймер Р1В227 гена cry1B.

SEQ ID No. 21: праймер Р1В228 гена cry1B.

SEQ ID No. 22: праймер Р1С247 гена cry1C.

SEQ ID No. 23: праймер Р1С252 гена cry1C.

1. Конструкция химерных генов и трансформация векторов.

Некоторые гены cry1 были созданы и собраны с использованием комбинации технологий получения генов с оптимальной представленностью в растительных клетках.

cry1C1-ДНК, которая была создана для оптимальной экспрессии в растительных клетках, представлена в последовательности SEQ ID No. 1. Эта последовательность ДНК кодирует инсектицидный белок Cry1C1 по изобретению (SEQ ID No. 2). Для трансформации растений первый химерный ген (химерный ген cry1C1) конструируют с включением следующих функционально-связанных элементов (5'-3'): промотора, включающего дублированную промоторную область, выделенную сегмента 7 вирусного генома subterranean clover stunt (S7S7-промотор, Boevink et al., 1995, SEQ ID No. 18), лидерную последовательность из специфичного для тапетума гена E1 (GE1) из Oryza sativa (Michiels et al., 1992), последовательность cry1C1-ДНК, включающую второй интрон из свето-индуцируемого тканеспецифичного гена STLS1 из Solanum tuberosum (Eckes et al., 1986) в положении 672 (SEQ ID No. 1), и последовательность, включающую 3'-не транслируемую область гена НАДФ-зависимой малатдегидрогеназы из Flaveria bidentis (3' Mel, Marshall et al., 1996).

Был создан подобный химерный ген cry1C, где ST-LS1 интрон 2 находился в положении 489 cry1CДНК (т.е. cry1С2-ДНК), который представлял собой химерный ген cry1С2, сконструированный подругому точно такой же химерный ген cry1C1.

Для точного направления белка Cry1C в отношении хлоропластов клетки сконструированы варианты химерных генов cry1C1 и cry1С2, которые включают модифицированную последовательность, кодирующую оптимизированный транспортный пептид (SEQ ID No.16), как описано в публикации Lebrun et al. (1996), функционально-связанный с кодирующей областью cry1C так, чтобы сшитый белок транспортного пептида экспрессировался в растительных клетках. Это химерные гены cry1С3 и cry1С4, включающие последовательности, кодирующие Cry1С3 и Cry1С4, соответственно, каждая из которых содержит последовательность модифицированного транспортного пептида хлоропластов из SEQ ID No.16.



Pages:   || 2 |
Похожие работы:

«РЕШЕНИЯ ГОРОДСКОГО СОВЕТА  ГОРОДСКОЙ СОВЕТ НОВОСИБИРСКА РЕШЕНИЕ г. Новосибирск От 26.02.2007 № 522 Об отмене отдельных положений решения городского Совета Новосибирска от 30.06.2006 № 302 О внесении изменений в Положение о застройке города Новосибирска, принятое решением городского Совета от 09.04.2003 № 241 (в редакции решений городского Совета от 26.05.2004 № 396, от 27.10.2004 № 483, от 01.02.2006 № 183) В соответствии с Федеральным законом Об общих принципах организации местного...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Амурский государственный университет Кафедра китаеведения УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДИСЦИПЛИНЫ ПРАКТИЧЕСКИЙ КУРС ВОСТОЧНОГО ЯЗЫКА Основной образовательной программы по направлению подготовки бакалавра 032000.62 Зарубежное регионоведение Благовещенск 2012 УМКД разработан Калитой Е.В., старший преподаватель Рассмотрен и рекомендован на...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ НЕФТИ И ГАЗА ИМЕНИ И.М. ГУБКИНА АННОТАЦИЯ ОСНОВНАЯ ОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ ПРОГРАММА ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ Направление подготовки (специальность) 130102 ТЕХНОЛОГИЯ ГЕОЛОГИЧЕСКОЙ РАЗВЕДКИ Специализация СЕЙСМОРАЗВЕДКА Квалификация выпускника СПЕЦИАЛИСТ Нормативный срок обучения 5 лет Форма обучения ОЧНАЯ МОСКВА, 2013 г. Назначение ООП ВПО ООП ВПО представляет собой систему документов,...»

«ПРОЕКТ PDF-ПОЭЗИЯ PEREMENY.RU. Книга Десятая МИХАИЛ ПОБИРСКИЙ Небо Peremeny.Ru 2011 на рынке купили огромную мясорубку, железную мясорубку, никелевую мололи маковые головки, опиумные головки красного мака мололи потом кололи вены, вены кололи, мне хочется радиорубку построить с антеннами потом покататься на тракторе, синем тракторе по янтарному полю, боли тревожили молоденьких хиппушек, смешных, с хаератничками и как есть я же лежал где-то рядом, мирно смотрел на звезды и пел нудную песнь о...»

«Ело Ринпоче Комментарий к практике осуществления безмятежности Улан-Удэ, Издательство дацана Ринпоче Багша, 2010. ISBN 978-5-902493-09-9 Ответственный за выпуск геше-лхарамба Тензин Лама. Это произведение распространяется на условиях Creative Commons AttributionNonCommercial-NoDerivs 3.0 License. Источник: http://yelo-rinpoche.ru/ Аннотация Данная книга представляет собой расшифровку аудиозаписи Комментария к практике осуществления безмятежности, данного досточтимым Ело Ринпоче летом 2009 года...»

«Борис Левин Что? Где? Когда? для чайников Как придумать вопрос, который попадет в телепередачу и поставит в тупик всех элитарных знатоков Как самому стать элитарным знатоком Как провести мероприятие, которое поднимет вас в глазах окружающих Как организовать популярный клуб Как разнообразить свой досуг и досуг своих друзей Сведения об авторе Борис Левин родился в I960 году. С 1988 года - в движении знатоков. В 1989 году принимал участие в создании Международной Ассоциации Клубов Что? Где?...»

«Издание 1 страница 1 из 32 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 Общие положения..3 2 Характеристика профессиональной деятельности выпускника ООП ВПО по направлению подготовки магистров 280100 Природообуйстройство и водопользование.3 3 Требования к результатам освоения основной образовательной программы по направлению подготовки магистров 280100 Природообуйстройство и водопользование.4 4 Документы, регламентирующие содержание и организацию образовательного процесса при реализации ООП ВПО по направлению подготовки...»

«Аукционный дом КАБИНЕТЪ 80 Фойницкий И. Мошенничество по русскому праву. СПб., типография товарищества Общественная польза, 1871. Формат издания: 23 х 15,5 см. VIII, 289 с. Экземпляр в владельческом полукожаном переплете. Потертости крышек и корешка. На титульном листе и в тексте плохо читаемые штампы армянской библиотеки. Некоторые страницы неразрезаны. 35 000 – 43 000 руб. Лесков Н. (Стебницкий). Соборяне. Старгородская хроника. Посвящается графу Алексею Константиновичу Толстому. М., В...»

«База нормативной документации: www.complexdoc.ru КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПО ГЕОЛОГИИ И ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НЕДР ИНСТРУКЦИЯ ПО СОСТАВЛЕНИЮ ПРОЕКТОВ И СМЕТ НА ГЕОЛОГОРАЗВЕДОЧНЫЕ РАБОТЫ Содержание 1. ВВЕДЕНИЕ 2. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ 3. ГЕОЛОГИЧЕСКОЕ ЗАДАНИЕ 4. МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ПРОЕКТА 5. ПРОИЗВОДСТВЕННАЯ ЧАСТЬ ПРОЕКТА 6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТОИМОСТИ И СОСТАВЛЕНИЕ СМЕТ НА ГЕОЛОГОРАЗВЕДОЧНЫЕ РАБОТЫ 6.1. Общие положения 6.2. Основные расходы 6.3. Накладные расходы 6.4. Плановые накопления 6.5....»

«“Ибо только Я знаю, какие намерения имею о вас, говорит Господь, намерения во благо, а не на зло, чтобы дать вам будущность и надежду” (Библия, книга пророка Иеремии, 29 глава, 11 стих) № 2 (87) ФЕВРАЛЬ ИЗДАНИЕ КАВКАЗСКОГО СОЮЗА ЦЕРКВИ ХРИСТИАН АДВЕНТИСТОВ СЕДЬМОГО ДНЯ КАК НИКОГДА РАНЬШЕ. 2014 год во Всемирной Церкви Адвентистов седьмого дня – год литературного евангелизма. книгах, не пойдут по ложным путям. (Вестники надежды, стр.130 ориг.) приведу один из таких опытов, которым поделился олесь...»

«CBD Distr. GENERAL UNEP/CBD/WG-ABS/7/6 8 January 2009 RUSSIAN ORIGINAL: ENGLISH СПЕЦИАЛЬНАЯ РАБОЧАЯ ГРУППА ОТКРЫТОГО СОСТАВА ПО ДОСТУПУ К ГЕНЕТИЧЕСКИМ РЕСУРСАМ И СОВМЕСТНОМУ ИСПОЛЬЗОВАНИЮ ВЫГОД Седьмое совещание Париж, 2-8 апреля 2009 года ОБОБЩЕНИЕ ВСЕХ ПРОЧИХ МНЕНИЙ И СВЕДЕНИЙ, ПРЕДСТАВЛЕННЫХ СТОРОНАМИ, ПРАВИТЕЛЬСТВАМИ, МЕЖДУНАРОДНЫМИ ОРГАНИЗАЦИЯМИ, КОРЕННЫМИ И МЕСТНЫМИ ОБЩИНАМИ И СООТВЕТСТВУЮЩИМИ СУБЪЕКТАМИ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ В ОТНОШЕНИИ ОСНОВНЫХ КОМПОНЕНТОВ МЕЖДУНАРОДНОГО РЕЖИМА РЕГУЛИРОВАНИЯ...»

«В. С. Зубарева, М. Л. Лурье (Санкт-Петербург) Весьегонские рассказы об отце Сергии Успенском как провинциальный текст По сохранившимся в архиве епархиальным документам можно в общих чертах восстановить небогатую событиями биограф и ю отца Сергия, священника села Федорково Весьегонского уезда Тверской губернии. С е р г е й Григорьевич Успенский родился 2 сентября 1 8 6 7 г. в семье дьякона Никольского погоста Никольской волости Весьегонского уезда. Тринадцати лет поступил в Т в е р с к у ю...»

«РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Южный Научный Центр RUSSIAN ACADEMY OF SCIENCES Southern Scientic Centre CAUCASIAN ENTOMOLOGICAL BULLETIN Том 6. Вып. 1 Vol. 6. No. 1 Ростов-на-Дону 2010 Кавказский энтомол. бюллетень 6(1): 6370 © CAUCASIAN ENTOMOLOGICAL BULL. 2010 К познанию фауны сетчатокрылых (Neuroptera) Северо-Западного Кавказа Contribution to the knowledge of the Neuroptera fauna of the North-Western Caucasus В.Н. Макаркин1, В.И. Щуров2 V.N. Makarkin1, V.I. Shchurov Биолого-почвенный институт...»

«Преподобный Элвуд Скотт Рай, святой город и слава трона (сокращенная версия). 1 В начале 20-го века Бог дал Сенеке Соди славное (Второзаконие 33:27). Он должен преобразовать твоих переживание пребывания сорока дней на небесах. Эта книга врагов в твоих друзей, и ангелы, которые так верно охраняли изменит вашу жизнь и даст вам надежду, поможет вам мое смертное тело, будут охранять твою душу. Он пожал отложить в сторону все проблемы и акцентировать внимание мою руку, снова и снова поцеловал меня,...»

«Ключевые ботанические территории Мурманской области и подходы к их выделению1 Константинова Н.А., Костина В.А., Королева Н.Е., Белкина О.А., Мелехин А.В. Полярно-альпийский ботанический сад-институт (ПАБСИ) КНЦ РАН, 184256 Кировск, Мурманской обл. e-mail: nadya50@list.ru Введение Ключевая ботаническая территория (КБТ) – это природный или полуприродный участок с высоким ботаническим разнообразием и (или) участок, который по оценке экспертов, поддерживает уникальное сообщество редких,...»

«Приложение CERD/C/EST/8-9 Международная конвенция Distr.: General о ликвидации всех форм 3 November 2009 Russian расовой дискриминации Original: English Комитет по ликвидации расовой дискриминации Доклады, представляемые государствамиучастниками в соответствии со статьей 9 Конвенции Восьмой и девятый периодические доклады, подлежавшие представлению в 2008 году Эстония* ** [24 июля 2009 года] * В настоящем документе содержатся восьмой и девятый периодические доклады Эстонии, подлежавшие...»

«27 Город не даст кануть в небытие баскетбольному Спартаку Казино массово 10 сдают по почте ВАЛЮТА ЕЖЕДНЕВНОЕ 29 МАЯ ИЗДАНИЕ ЧЕТВЕРГ 1$ – 34.49 руб. ПРАВИТЕЛЬСТВА tС +9. + ФОТО: TREND 1€ – 47.02 руб. САНКТ-ПЕТЕРБУРГА ВЕТЕР 5-7 М/С, В №345(830) ШАЙТЕ СЛУ НА M 24 ПИТЕР.FM РА Отдых ДИ 100.9 F в Тунисе О привел В 8.0 0, КИЙ ТЕРБУРГС к трагедии ПЕ. ДНЕВНИК 0,. 0,. Как.0 0, 14.0 0, прикинуться ветошью Историческая любовь к колбасе ФОТО: TREND ФО О: ВМЕСТО ПРОТЕСТА ФОТО: FREEIMAGES.COM...»

«Райнер Вагнер Практическая книга Краткая библейская школа Введение в Библию для церкви Предисловие 3 Урок 1 Введение в Обзор Библии 4 Урок 2 Библия 9 Урок 3 Деление Библии 13 Урок 4 Путь к первоначальному тексту 17 Урок 5 Книга Бытие 21 Урок 6 Книга Исход 28 Урок 7 Книга Левит 33 Урок 8 Книга Числа 40 Урок 9 Книга Второзаконие 45 Урок 10 Книга Иисуса Навина 49 Урок 11 Книга Судей 53 Урок 12 Книга Руфь 58 Урок 13 1-я книга Царств 61 Урок 14 2-я Книга Царств 65 Урок 15 3-я Книга Царств 68 Урок 16...»

«В течение первых трех лет жизни у ребенка самый высокий потенциал к обучению. Поэтому не ждите. Версия для пап ! * Масару Ибука После трех уже поздно Каждая мама желает видеть своего ребенка смышленым и творческим, открытым и уверенным в себе. Но, к сожалению, не каждая знает, как поспособствовать бережному развитию интеллекта своего малыша. Книга Масару Ибуки После трех уже поздно рассказывает о необходимости и важности раннего развития детей. Ведь первые три года жизни — неповторимый период в...»

«ПЕРЕВЕРНИТЕ ТЕПЕРЬ С ТЕЛЕПРОГРАММОЙ 23 СТРАНИЦУ ря екаб1 ГАЗЕТА д 201 ВНУТРИ близкие новости мегаполиса КРУПНЕЙШАЯ ГАЗЕТА МОСКВЫ СТРОГИНО, КРЫЛАТСКОЕ, КУНЦЕВО, МОЖАЙСКИЙ, ФИЛИ + КУТУЗОВСКИЙ ПРОСПЕКТ РЕКЛАМА ТЕПЕРЬ С ТЕЛЕПРОГРАММОЙ ТЕПЕРЬ ТЕЛЕПРОГРАММОЙ ПЕ П РЬ ЕЛ ПРОГРАММОЙ ПЕР МР — близкие новости мегаполиса КРУПНЕЙШАЯ ГАЗЕТА МОСКВЫ СТРОГИНО, КРЫЛАТСКОЕ, КУНЦЕВО, МОЖАЙСКИЙ, ФИЛИ 23 декабря 2011 г. + КУТУЗОВСКИЙ ПРОСПЕКТ СООБЩАЙТЕ НОВОСТИ ПО ТЕЛ. 925-55- ООБЩАЙТЕ WWW.MR-MSK.RU РАСПРОСТРАНЯЕТСЯ...»




 
© 2014 www.kniga.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Книги, пособия, учебники, издания, публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.