WWW.KNIGA.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Книги, пособия, учебники, издания, публикации

 

Pages:   || 2 |

«Перекрестная ссылка на родственные заявки По этой заявке испрашивается приоритет предварительных заявок на выдачу патента США № 60/448823, поданной 19 февраля 2003 г., и ...»

-- [ Страница 1 ] --

010159

Перекрестная ссылка на родственные заявки

По этой заявке испрашивается приоритет предварительных заявок на выдачу патента США №

60/448823, поданной 19 февраля 2003 г., и 60/448853, поданной 19 февраля 2003 г., содержания которых

полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к способам и композициям для профилактики или лечения боли у пациента введением комбинации антагониста фактора роста нервов и НСПВС.

Предшествующий уровень техники В настоящее время для облегчения боли рекомендуется ряд способов лечения, предусматривающих введение нестероидных противовоспалительных средств (НСПВС). Было показано, что введение НСПВС проявляет свойства облегчения боли. Однако известны недостатки лечения НСПВС, включающие нежелательные побочные эффекты, такие как раздражение желудочно-кишечного тракта и почек и токсическое действие на печень. Более того, НСПВС не могут достичь адекватного облегчения боли даже в их максимальных терапевтически допустимых дозах при некоторых болезненных состояниях.

Фактор роста нервов (NGF) представлял собой первый идентифицированный нейротропин, и его роль в развитии и выживании и периферических, и центральных нейронов была достаточно охарактеризована. Было показано, что NGF представляет собой решающий фактор выживания и поддержания при развитии периферических симпатических и эмбриональных сенсорных нейронов и холинергических нейронов основания переднего мозга (Smeyne, et al., Nature 368:246-249 (1994); Creowley, et al., Cell 76:1001-1011 (1994)). NGF оказывает стимулирующую регуляцию на экспрессию нейропептидов в сенсорных нейронах (Lindsay, et al., Nature 337:362-364 (1989)), и его активность опосредована через 2 различных рецептора, связанных с мембраной, рецептор TrkA тирозинкиназы и рецептор р75, который структурно связан с другими членами семейства рецепторов фактора опухолевого некроза (Chao, et al., Science 232:518-521 (1986)).

В дополнение к его воздействиям на нервную систему, NGF все больше вовлекался в процессы вне нервной системы. Например, было показано, что экзогенно введенный NGF усиливает проницаемость сосудов (Otten, et al., Eur. J. Pharmacol. 106:199-201 (1984)), усиливает Т- и В-клеточные иммунные ответы (Otten, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10059-10063 (1989)), вызывает дифференцировку лимфоцитов и пролиферацию тучных клеток и вызывает высвобождение растворимых биологических сигналов из тучных клеток (Matsuda, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:6508-6512 (1988); Pearce, et al., J.Physiol 372:379-393 (1986); Bischoff, et al., Blood 79:2662-2669 (1992); Horigome, et al., J. Biol Chem. 268:14881NGF продуцируется рядом типов клеток, включая тучные клетки (Leon, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 91:3739-3743 (1994)), В-лимфоциты (Torcia, et al., Cell 85:345-356 (1996), кератиноциты (Di Macro, et al., J. Biol. Chem. 268:22838-22846)), гладкомышечные клетки (Ueyama, et al., J. Hypertens. 11:1061- (1993)), фибробласты (Lindholm, et al., Eur. J. Neurosci. 2:795-801 (1990)), бронхиальные эпителиальные клетки (Kassel, et al., Clin. Exp. Allergy 31:1432-40 (2001)), почечные мезангиальные клетки (Steiner, et al., Am. J. Physiol. 261:F792-798 (1991)) и трубочки скелетных мышц (Schwartz, et al., J. Photochem. Photobiol.

В 66:195-200 (2002)). Рецепторы NGF были обнаружены на различных типах клеток вне нервной системы. Например, TrkA был обнаружен на моноцитах, Т- и В-лимфоцитах и тучных клетках человека.

Связь между повышенными уровнями NGF и различными воспалительными состояниями наблюдалась у пациентов, а также в нескольких экспериментальных моделях на животных. Эти воспалительные состояния включают системную красную волчанку (Bracci-Laudiero, et al., Neuroreport 4:563-565 (1993)), рассеянный склероз (Bracci-Laudiero, et al., Neurisci. Lett. 147:9-12 (1992)), псориаз (Raychaudhuri, et al., Acta Derm. L'enereol. 78:84-86 (1998)), артрит (Falcimi, et al., Ann. Rheum. Dis. 55:745-748 (1996)), интерстициальный цистит (Okragly, et al., J. Urology 161:438-441 (1999)) и астму (Braun, et al., Eur. J Immunol.

28:3240-3251 (1998)).

Согласованно повышенный уровень NGF в периферических тканях связан с гиперальгезией и воспалением, и он наблюдался при ряде форм артрита. Синовиальная оболочка пациентов, пораженных ревматоидным артритом, экспрессирует высокие уровни NGF в то время, как сообщалось, что в невоспаленной синовиальной оболочке NGF не выявляется (Aloe, et al., Arch. Rheum. 35:351-355 (1992)). Аналогичные результаты наблюдались у крыс с экспериментально вызванным ревматоидным артритом (Aloe, et al., Clin. Exp. Rgeumatol. 10:203-204 (1992)). Сообщалось о повышенных уровнях NGF у трансгенных мышей с артритом наряду с увеличением количества тучных клеток (Aloe, et al., Int. J. Tissue ReactionsExp. Clin. Aspects 15:139-143 (1993)).

Существуют 2 общие категории лекарственной терапии для лечения боли, причем каждая действует посредством различных механизмов и оказывает различные эффекты, и они обе имеют недостатки. Первая категория включает нестероидные противовоспалительные средства (НСПВС), которые используются для лечения незначительной боли, но терапевтическое применение которых ограничено нежелательными воздействиями на желудочно-кишечный тракт, такими как эрозия слизистой оболочки желудка, образование пептической язвы или воспаление 12-перстной кишки и толстой кишки и токсическое действие на почки при длительном применении. Вторая категория включает опиоидные анальгетики, такие -1как морфин, которые применяются для лечения боли от умеренной до сильной, но терапевтическое применение которых ограничено ввиду нежелательных эффектов, таких как запор, тошнота и рвота, угнетение дыхания, психические нарушения, почечная колика, устойчивость к длительному применению и риск развития зависимости.

Очевидно, что существует необходимость в улучшенном лечении боли, которое обеспечивает улучшенную терапевтическую выгоду (например, сниженную силу и/или частоту боли) и/или снижает частоту возникновения нежелательных побочных эффектов, вызванных многими современными схемами лечения.

Все приведенные в настоящем описании ссылки, включая патентные заявки и публикации, полностью включены в качестве ссылки.

Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение основано на открытии того, что антагонисты NGF эффективны при лечении боли в сочетании с НСПВС. Такая терапия приводит к неожиданно усиленному лечению боли. Кроме того, такая терапия в целом обеспечивает возможность применения сниженной дозировки НСПВС для получения такого же количества уменьшения боли и/или других форм усиления лечения боли НСПВС.

В первом аспекте настоящее изобретение характеризует способ лечения (или в других вариантах осуществления профилактики) боли, включающий введение некоторого количества антагониста фактора роста нервов и некоторого количества НСПВС так, что в сочетании они обеспечивают эффективное облегчение боли. Относительные количества и соотношения антагониста NGF и НСПВС могут варьироваться. В некоторых вариантах осуществления вводится количество антагониста NGF, достаточное для того, чтобы обеспечить возможность снижения обычной дозы НСПВС, требуемой для получения такой же степени эффекта облегчения боли. В некоторых вариантах осуществления вводится количество антагониста NGF, достаточное для того, чтобы обеспечить возможность снижения обычной дозы НСПВС, требуемой для получения такой же степени эффекта облегчения боли по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80%, или по меньшей мере примерно на 90%, или более. Это уменьшение может отражаться с точки зрения количества, введенного в данное введение, и/или количестве, введенном в течение данного периода времени (сниженная частота).

В другом аспекте изобретение характеризует слособы усиления лечения боли НСПВС, предусматривающие введение эффективного количества НСПВС в сочетании с эффективным количеством антагониста NGF. Используемый в настоящем описании термин «введение в сочетании» включает одновременное введение и/или введение в различное время. Введение в сочетании также охватывает введение в виде совместной композиции (т.е. антагонист NGF и НСПВС присутствуют (комбинируются) в одной и той же композиции) и/или введение в виде отдельных композиций. Используемый в настоящем описании термин «введение в сочетании» охватывает любое обстоятельство, при котором НСПВС и антагонист NGF вводятся в эффективном количестве индивидууму. Как далее обсуждается в настоящем описании, понятно, что антагонист NGF и НСПВС могут вводиться с различной частотой и/или интервалами введения. Например, антитело против NGF можно вводить 1 раз/нед., тогда как НСПВС можно вводить чаще.

Понятно, что антагонист NGF и НСПВС могут вводиться одним и тем же путем введения или различными путями введения, и что различные схемы введения могут изменяться в течение хода введения (введений). Введение может происходить перед началом боли.

В другом аспекте изобретение предоставляет способы снижения частоты возникновения боли, облегчения боли, уменьшения боли и/или задержки развития или прогрессирования боли у индивидуума, причем указанные способы предусматривают введение эффективного количества антагониста NGF в сочетании с эффективным количеством НСПВС.

Способы изобретения подходят для лечения или профилактики любой боли любой этиологии, включая боль, при которой в целом назначается применение НСПВС. В некоторых вариантах осуществления боль представляет собой послеоперационную боль. В некоторых вариантах осуществления боль представляет собой боль, связанную с ожогом. В других вариантах осуществления боль представляет собой боль, связанную с ревматоидным артритом. В других вариантах осуществления боль представляет собой боль, связанную с остеоартритом.

Антагонист NGF, подходящий для применения в способах изобретения, представляет собой любое средство, которое может прямо или косвенно привести к сниженной биологической активности NGF. В некоторых вариантах осуществления антагонист NGF связывает (физически взаимодействует с) NGF (например, антитело), связывается с рецептором NGF (таким как рецептор trkA и/или р75) и/или снижает (тормозит и/или блокирует) нисходящую передачу сигналов от рецепторов NGF (например, ингибиторы передачи сигналов киназы или другой нисходящей передачи сигналов, вызванной NGF, в клеткемишени). В других вариантах осуществления антагонист NGF ингибирует (снижает) синтез и/или высвобождение NGF. В других вариантах осуществления антагонист NGF уменьшает экспрессию или функцию рецепторов NGF TrkA и/или р75. В другом варианте осуществления антагонист NGF представляет -2собой антагонист NGF, который не является иммуноадгезином TrkA (т.е. является отличным от иммуноадгезина TrkA). В некоторых вариантах осуществления антагонист NGF выбран из любого одного или более из следующих: антитело против NGF, антисмысловая молекула, направленная на нуклеиновую кислоту, кодирующую NGF (включая антисмысловую молекулу, направленную на нуклеиновую кислоту, кодирующую NGF), антисмысловая молекула, направленная на рецепторы NGF (такие как TrkA и/или р75), вещество, ингибирующее NGF, структурный аналог NGF, доминантно-негативная мутация рецептора TrkA и/или р75, которая связывает NGF, антитело против TrkA, антитело против р75 и ингибитор киназы. В некоторых вариантах осуществления антагонист NGF (такой как антитело против NGF) связывает NGF (такой как hNGF) и значительно не связывается с родственными нейротропинами, такими как NT-3, NT-4/5 и/или BDNF. В другом варианте осуществления антагонист NGF представляет собой антитело против NGF. В еще одних вариантах осуществления антитело против NGF специфически связывается с NGF. В еще одних вариантах осуществления антитело против NGF распознает человеческий NGF. В еще одних вариантах осуществления антитело против NGF специфически связывает человеческий NGF. В еще одних вариантах осуществления антитело специфически связывает тот же эпитоп NGF, что и антитело, выбранное из одного или более из следующих: Mab 911, Mab 912 и Mab 938 (см.

Hongo, et al., Hybridoma 19:215-227 (2000)). В еще одних вариантах осуществления антитело против NGF гуманизировано (включая гуманизированное Mab 911, такое как антитело Е3, описанное в настоящем описании). В еще одних вариантах осуществления антитело против NGF представляет собой антитело Е (как описано в настоящем описании). В других вариантах осуществления антитело против NGF включает один или более CDR антитела Е3 (например, 1, 2, 3, 4, 5 или, в некоторых вариантах осуществления, все 6 CRD из Е3). В других вариантах осуществления антитело против NGF является человеческим. В еще одних вариантах осуществления антитело против NGF включает аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, показанную в табл. 1 (SEQ ID NO:1), и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, показанную в табл. 2 (SEQ ID NO:2). В еще одних вариантах осуществления антитело против NGF включает аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, показанную в табл. 1 (SEQ ID NO:1). В еще одних вариантах осуществления антитело против NGF включает аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, показанную в табл. 2 (SEQ ID NO:2). В еще одних вариантах осуществления антитело включает модифицированную константную область, такую как константная область, которая является иммунологически инертной, например, не запускает лизис, опосредованный комплементом, или не стимулирует антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC). В других вариантах осуществления константная область модифицирована, как описано в Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; заявке РСТ № PCT/GB99/01441; и/или в заявке на патент Великобритании № 9809951.8.

В некоторых вариантах осуществления антагонист NGF связывается с молекулой NGF. В еще одних вариантах осуществления антагонист NGF представляет собой антитело, которое специфически связывается с NGF. Однако антагонист NGF может альтернативно связываться с рецептором TrkA. Антагонист NGF может представлять собой моноклональное антитело против человеческого NGF (анти-hNGF), которое способно связывать hNGF и эффективно ингибировать связывание hNGF с человеческим TrkA (hTrkA).

Аффинитет связывания антитела против NGF с NGF (таким как hNGF) может составлять от примерно 0,10 до примерно 0,30 нМ, от примерно 0,15 до примерно 0,75 нМ и от примерно 0,18 до примерно 0,72 нМ. В одном варианте осуществления аффинитет связывания составляет примерно 2 и 22 пкМ. В некоторых вариантах осуществления аффинитет связывания составляет примерно 10 нМ. В других вариантах осуществления аффинитет связывания составляет менее чем примерно 10 нМ. В других вариантах осуществления аффинитет связывания составляет примерно 0,1 или примерно 0,07 нМ. В других вариантах осуществления аффинитет связывания составляет менее примерно 0,1 или менее примерно 0,07 нМ.

В других вариантах осуществления аффинитет связывания составляет примерно 100, примерно 50, примерно 10, примерно 1 нМ, примерно 500, примерно 100 или примерно от 50 до любого из примерно пкМ, примерно 5, примерно 10, примерно 15, примерно 20, примерно 40 или примерно 50 пкМ. В некоторых вариантах осуществления аффинитет связывания составляет любую величину из примерно нМ, примерно 50, примерно 10, примерно 1 нМ, примерно 500, примерно 100 или примерно 50 пкМ или менее примерно 50 пкМ. В некоторых вариантах осуществления аффинитет связывания составляет менее, чем любая величина из 100 нМ, примерно 50, примерно 10, примерно 1 нМ, примерно 500, примерно 100 или примерно 50 пкМ. В еще одних вариантах осуществления аффинитет связывания составляет примерно 2, примерно 5, примерно 10, примерно 15, примерно 20, примерно 40 или более примерно пкМ. Как хорошо известно в данной области, аффинитет связывания может быть выражен в виде KD или константы диссоциации, и увеличенный аффинитет связывания соответствует сниженной KD. Аффинитет связывания мышиного моноклонального антитела 911 против NGF (Hongo et al., Hybridoma 19:215с человеческим NGF составляет примерно 10 нМ, а аффинитет связывания гуманизированного антитела против NGF E3 (описанного в настоящем описании) с человеческим NGF составляет примерно 0,07 нМ.

В случаях, когда антагонист NGF представляет собой антитело, антитело может представлять собой Fab', F(ab')2, Fv, диател, одноцепочечных молекул антитела и мультиспецифических антител, образованных из фрагментов антитела, и одноцепочечной молкулы Fv (scFv).

НСПВС может представлять собой любое нестероидное противовоспалительное соединение.

НСПВС классифицируются по их способности ингибировать циклооксигеназу. Циклооксигеназа 1 и циклооксигеназа 2 представляют собой 2 основные изоформы циклооксигеназы, а самые стандартные НСПВС представляют собой смешанные ингибиторы обеих изоформ. Самые стандартные НСПВС относятся к одной из следующих пяти структурных категорий: (1) производные пропионовой кислоты, такие как ибупрофен, напроксен, напросин, диклофенак и кетопрофен; (2) производные уксусной кислоты, такие как толметин и слиндак; (3) производные фенамовой кислоты, такие как мефенамовая кислота и меклофенамовая кислота; (4) производные бифенилкарбоновой кислоты, такие как дифлунизал и флуфенизал; и (5) оксикамы, такие как пироксим, судоксикам и изоксикам.

Был описан другой класс НСПВС, которые избирательно ингибируют циклооксигеназу 2. Ингибиторы Сох-2 были описаны, например в патентах США №№ 5616601; 5604260; 5593994; 5550142;

5536752; 5521213; 5475995; 5639780; 5604253; 5552422; 5510368; 5436265; 5409944 и 5130311, которые все включены в настоящее описание в качестве ссылки. Определенные иллюстративные ингибиторы СОХ-2 включают целекоксиб (SC-58635), рофекоксиб, DUP-697, флозулид (CGP-28238), мелоксикам, 6метокси-2-нафтилуксуную кислоту (6-MNA), МК-966, набуметон (пролекарство для 6-MNA), нимезулид, NS-398, SC-5766, SC-58215, Т-614; или их комбинации.

В некоторых вариантах реализации изобретение предоставляет способы, в которых аспирин /или ацетоминофен применяются в сочетании с антагонистом NGF (таким как антитело против NGF).

Антагонист NGF и/или НСПВС могут вводиться индивидууму любым подходящим путем. Например, их можно вводить вместе или отдельно и/или одновременно, и/или последовательно, перорально, внутривенно, сублингвально, подкожно, внутриартериально, ректально, в спинной мозг, интраторакально, внутрибрюшинно, в желудочки головного мозга, сублингвально, трансдермально или путем ингаляции. Введение может быть системным, т.е. внутривенным или локализованным.

Во втором аспекте настоящее изобретение характеризует композиции, включающие антагонист фактора роста нервов и НСПВС. Антагонист фактора роста нервов и НСПВС могут присутствовать вместе с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями или эксципиентами, или могут присутствовать в отдельных композициях. В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет синергическую композицию антагониста NGF и НСПВС.

В третьем аспекте настоящее изобретение характеризует набор для применения в любом из способов, раскрытых в настоящем описании, причем указанный набор предусматривает антагонист NGF и НСПВС. Набор может, кроме того, включать инструкции для любого из описанных в настоящем описании способов. Инструкции могут включать введение антагониста NGF (такого как антитело против NGF) в сочетании с НСПВС (т.е. одновременное введение и/или введение в различное время). В некоторых вариантах осуществления антагонист NGF и НСПВС упакованы вместе, но они могут быть или могут не быть в одном и том же контейнере. Так, в некоторых вариантах осуществления набор включает антагонист NGF и НСПВС, присутствующие в одном и том же контейнере, и инструкции по применению в любом из описанных в настоящем описании способов. В других вариантах осуществления набор включает антагонист NGF и НСПВС, присутствующие в отдельных контейнерах.

В других вариантах осуществления изобретение предоставляет способ лечения боли у индивидуума, предусматривающий введение индивидууму эффективного количества антитела против фактора роста нервов (NGF) и НСПВС. В других вариантах осуществления НСПВС выбран из группы, состоящей из ибупрофена, напроксена, напросина, диклофенака, кетопрофена, толметина, слиндака, мефенамовой кислоты, меклофенамовой кислоты, дифлунизала, флуфенизала, пироксима, судоксикама, изоксикама, целекоксиба, рофекоксиба, DUP-697, флозулида, мелоксикама, 6-метокси-2-нафтилуксусной кислоты, МКнабуметона, нимезулида, NS-398, SC-5766, SC-58215, Т-614. В некоторых вариантах осуществления НСПВС является ибупрофеном. В некоторых вариантах осуществления антитело против NGF связывает человеческий NGF. В некоторых вариантах осуществления антитело против NGF связывает человеческий NGF с аффинитетом связывания примерно 10 нМ или менее чем примерно 10 нМ. В некоторых вариантах осуществления антитело против NGF представляет собой человеческое антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело против NGF представляет собой гуманизированное антитело. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело представляет собой антитело, включающее вариабельную область тяжелой цепи, показанную в SEQ ID NO:1 и вариабельную область легкой цепи, показанную в SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления боль представляет собой послеоперационную боль.

В некоторых вариантах осуществления изобретение предоставляет фармацевтическую композицию для лечения боли, включающую эффективное количество антитела против NGF и НСПВС и фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления изобретение предоставляет набор для лечения боли, включающий антитело против NGF, НСПВС и инструкции по введению антитела против NGF в сочетании с Фиг. 1 демонстрирует, что кумулятивная оценка боли в баллах снижена у животных, получавших лечение S[+]ибупрофеном в дозе 10 или 30 мг/кг в комбинации с антагонистом NGF (антагонистом против NGF Mab 911; см. Hongo, et al., Hybridoma 19:215-227 (2000)). Животные были разделены на две группы (контрольная и получавшая лечение антителами). Антагонист NGF вводили за 15 часов перед операцией, внутрибрюшинно (время = -15 ч) в дозе 1 мг/кг. Операцию выполняли, как описано во время 0. Боль в покое оценивали через 24 ч после операции («0» на графике). Затем всех животных лечили ибупрофеном (300 мг/мл в 45% жидкости бета-циклодекстрина) в концентрации 10 или 30 мг/кг массы тела.

Не получавших лечение антителом животных также лечили ибупрофеном в дозе 10, 30, 100 и 300 мг/кг.

Ибупрофен доставляли подкожно в заднюю часть шеи. Через 1 ч после введения дозы ибупрофена оценивали боль в покое. Лечение антагонистом против NGF плюс ибупрофеном более эффективно в уменьшении боли, чем лечение или одним ибупрофеном, или одним антителом против антагониста NGF.

Фиг. 2 представляет собой график, показывающий кумулятивную оценку боли в баллах у животных, получавших лечение диклофенаком в дозе 5 мг/кг, в комбинации с антагонистом NGF (антитело Mab 911 против антагониста NGF; см. Hongo, et al., Hybridoma 19:215-227 (2000)). Животные были разделены на две группы (контрольная и получавшая лечение антителами). Антагонист NGF вводили за часов перед операцией, внутрибрюшинно (время = -15 ч) в дозе 1 мг/кг. Операцию выполняли, как описано во время 0. Боль в покое оценивали через 24 ч после операции («0» на графике). Затем всех животных лечили диклофенаком в дозе 5 мг/кг массы тела. Не получавших лечение антителом животных также лечили диклофенаком в дозе 5 мг/кг. Диклофенак вводили подкожно в заднюю часть шеи. Через 1 ч после введения диклофенака оценивали боль в покое.

Заявители обнаружили, что боль можно предотвратить или лечить введением эффективного количества антагониста NGF (такого как антитело против NGF) в сочетании с НСПВС. Способы и композиции настоящего изобретения можно использовать для лечения или профилактики боли, включая любую боль, при которой в целом назначается применение НСПВС. Применением антагониста фактора роста нервов и НСПВС в сочетании, в соответствии с настоящим изобретением, теперь можно лечить боль меньшей дозой НСПВС, снижая посредством этого вероятность побочных эффектов, связанных с лечением НСПВС. В некоторых вариантах осуществления вводится количество антагониста NGF, достаточное для того, чтобы обеспечить возможность снижения обычной дозы НСПВС, требуемой для получения такой же степени эффекта облегчения боли, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 90%, или более.

Лечение боли НСПВС можно также усилить, как описано в настоящем описании, введением НСПВС в сочетании с антагонистом NGF.

В одном аспекте изобретение предоставляет способы лечения или профилактики боли у индивидуума (такого как млекопитающее, и человека, и не человека), предусматривающие введение эффективного количества антагониста NGF в сочетании с эффективным количеством НСПВС. В другом аспекте изобретение предоставляет способы усиления лечения или профилактики NSAD боли у индивидуума, предусматривающие введение эффективного количества антагониста NGF (такого как антитело против NGF) в сочетании с эффективным количеством НСПВС. В другом аспекте изобретение предоставляет способы профилактики, облегчения и/или профилактики развития или прогрессирования боли.

В некоторых вариантах осуществления антитело против NGF способно связывать NGF и эффективно ингибировать связывание NGF с его рецептором TrkA или р75 in vivo, или эффективно ингибировать активацию NGF его рецептора TrkA или р75. В некоторых вариантах осуществления аффинитет связывания антитела против NGF составляет от примерно 0,01 до примерно 1,00 нМ или от примерно 0,05 до примерно 0,25 нМ. В других вариантах осуществления аффинитет связывания составляет примерно 1, примерно 2, примерно 5, примерно 10, примерно 15, примерно 20, примерно 50, примерно 100 пкМ, или более. В одном варианте осуществления аффинитет связывания составляет примерно 2 и 22 пкМ. В некоторых вариантах осуществления антитело связывает по существу тот же эпитоп 6 NGF, что и антитело, выбранное из одного или более из следующих: Mab 911, Mab 912 и Mab 938 (см. Hongo, et al., Hybridoma 19:215-227 (2000)).

Антитело может также представлять собой фрагмент антитела, такой как фрагмент антитела, выбранный из одного или более из следующих фрагментов: Fab, Fab', F(ab')2, Fv, диател, одноцепочечных молекул антитела и мультиспецифических антител, образованных из фрагментов антитела, и одноцепочечной молекулы Fv (scFv). Антитело может также быть химерным, и оно может быть гуманизированным или человеческим. Антитело может также быть биспецифическим.

Иллюстративные НСПВС, которые можно применять в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются, (1) производные пропионовой кислоты, такие как ибупрофен, напроксен, напросин, диклофенак и кетопрофен; (2) производные уксусной кислоты, такие как толметин и слиндак; (3) производные фенамовой кислоты, такие как мефенамовая кислота и меклофенамовая кислота; (4) производные бифенилкарбоновой кислоты, такие как дифлунизал и флуфенизал; и (5) оксикамы, такие как пироксим, судоксикам и изоксикам. Был описан другой класс НСПВС, которые избирательно ингибируют циклооксигеназу 2. Ингибиторы Сох-2 были описаны, например, в патентах США №№ 5616601; 5604260;

5593994; 5550142; 5536752; 5521213; 5475995; 5639780; 5604253; 5552422; 5510368; 5436265; 5409944 и 5130311, которые все включены в настоящее описание в качестве ссылки. Определенные иллюстративные ингибиторы СОХ-2 включают целекоксиб (SC-58635), рофекоксиб, DUP-697, флозулид (CGPмелоксикам, 6-метокси-2-нафтилуксусную кислоту (6-MNA), МК-966, набуметон (пролекарство для 6-MNA), нимезулид, NS-398, SC-5766, SC-58215, Т-614; или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления аспирин и/или ацетоминофен применяются в сочетании с антагонистом NGF (таким как антитело против NGF).

Способы и композиции настоящего изобретения можно применять для лечения боли любой этиологии, включая острую и хроническую боль, любую боль с воспалительным компонентом и боль, при которой обычно назначаются НСПВС. Примеры боли включают послеоперационную боль, боль после хирургических вмешательств (включая зубную боль), мигрень, головную боль и невралгию тройничного нерва, боль, связанную с ожогом, раной или почечным камнем, боль, связанную с травмой (включая травматическое повреждение головы), нейропатическую боль, боль, связанную с мышечно-скелетными расстройствами, такими как ревматоидный артрит, остеоартрит, висцеральную боль, колит, панкреатит, гастрит, анкилозирующий спондилит, серо-негативные (неревматоидные) артропатии, не суставной ревматизм и околосуставные расстройства и боль, связанную с раком (включая «приступообразную боль» и боль, связанную с терминальными стадиями рака), периферическую нейропатию, постгерпетическую невралгию и боль, связанную с серповидноклеточным кризом. Примеры боли с воспалительным компонентом (в дополнение к некоторым из видов боли, описанных выше) включают ревматическую боль, боль, связанную с мукозитом, и дисменоррею. В некоторых вариантах осуществления способы и композиции настоящего изобретения используются для лечения или профилактики послеоперационной боли и/или раковой боли. В других вариантах осуществления боль представляет собой болевое показание, по поводу которого НСПВС в целом не назначаются, такую как нейропатическая боль. В других вариантах осуществления способы и композиции, описанные в настоящем описании, используются для лечения и/или профилактики боли, связанной с ожогом. В других вариантах осуществления способы и композиции, описанные в настоящем описании, используются для лечения и/или профилактики боли, связанной с ревматоидным артритом. В других вариантах осуществления способы и композиции, описанные в настоящем описании, используются для лечения и/или профилактики боли, связанной с остеоартритом.

В другом аспекте изобретение предоставляет композиции и наборы для лечения боли, включающие антагонист NGF (такой как антитело против NGF) и НСПВС, подходящих для применения в любых из способов, описанных в настоящем описании.

При отсутствии других указаний в практике настоящего изобретения должны использоваться обычные методики молекулярной биологии (включая рекомбинантные методики), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые находятся в пределах возможностей специалистов в данной области. Такие методики полностью объяснены в литературе, такой как Molecular cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and С. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).

«Антитело» (взаимозаменяемо используемое во множественной форме) представляет собой молекулу иммуноглобулина, способную специфически связываться с мишенью, такой как углеводород, полинуклеотид, липид, полипептид и т.д., посредством по меньшей мере одного участка распознавания антигена, расположенного в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Используемый в настоящем описании термин охватывает не только интактные поликлональные или моноклональные антитела, но также их фрагменты (такие как Fab, Fab', F(ab')2, Fv, одноцепочечный (ScFv), их мутанты, гибридные белки, включающие антительную часть, гуманизированные антитела, химерные антитела, диатела, линейные антитела, одноцепочеченые антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая включает сайт распознавания антигена требуемой специфичности. Антитело включает антитело любого класса, такое как IgG, IgA или IgM (или его подкласс), и антитело не должно быть из какого-либо конкретного класса. В зависимости от аминокислотной последовательности антитела константного домена его тяжелых цепей, иммуноглобулины могут быть отнесены к различным классам. Существует основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и несколько из них могут быть, кроме того, разделены на подклассы (изотипы), например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называются, соответственно, альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

«Моноклональное антитело» относится к гомогенной популяции антител, в которой моноклональное антитело состоит из аминокислот (естественно встречающихся и неестественно встречающихся), которые участвуют в избирательном связывании антигена. Моноклональные антитела высоко специфичны, причем они направлены против одного антигенного сайта. Термин «моноклональное антитело» охватывает не только интактные моноклональные антитела и моноклональные антитела полной длины, но также их фрагменты (такие как Fab, Fab', F(ab')2, Fv, одноцепочечный (ScFv), их мутанты, гибридные белки, включающие антительную часть, гуманизированные моноклональные антитела, химерные моноклональные антитела и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая включает сайт распознавания антигена требуемой специфичности и способности связываться с антигеном. Нет намерения ограничиваться в отношении источника антитела или способа, которым оно получено (например, гибридомой, фаговой селекцией, рекомбинантной экспрессией, трансгенными животными и т.д.).

«Гуманизированные» антитела относятся к молекуле, имеющей сайт связывания антигена, который по существу лишен иммуноглобулина из нечеловеческих видов, и остальную структуру иммуноглобулина молекулы, основанную на структуре и/или последовательности человеческого иммуноглобулина.

Сайт связывания антигена может включать или полные вариабельные домены, слитые на константные домены, или только области, определяющие комплементарность (CDR), трансплантированные на соответствующие каркасные регионы в вариабельных доменах. Сайты связывания антигена могут быть дикого типа или модифицированы одним или более замещениями аминокислот, например, модифицированы для того, чтобы ближе напоминать человеческий иммуноглобулин. Некоторые формы гуманизированных антител сохраняют все последовательности CDR (например, гуманизированное мышиное антитело, которое содержит все 6 CDR из мышиных антител). Другие формы гуманизированных антител имеют одну или более CDR (1, 2, 3, 4, 5, 6), которые изменены относительно исходного антитела. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) или другие остатки человеческого иммуноглобулина, замещенные соответствующими нечеловеческими остатками. Кроме того, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые не обнаруживаются в антителе реципиента или в антителе донора.

Используемый в настоящем описании термин «фактор роста нервов» и «NGF» относится к фактору роста нервов и его вариантам (включая, например, сплайсинговые варианты и варианты белковой переработки), которые удерживают по меньшей мере часть активности NGF. Используемый в настоящем описании термин "NGF" включает все виды нативной последовательности NGF млекопитающих, включая людей, нечеловекообразных обезьян, собак, кошек, лошадей или коров.

«Рецептор NGF» относится к полипептиду, который связан с NGF или активирован им. Рецепторы NGF включают рецептор TrkA и рецептор р75 любого вида млекопитающих, включая, но не ограничиваясь, людей, собак, кошек, лошадей, приматов или коров.

«Антагонист NGF» относится к любой молекуле, которая блокирует, подавляет или снижает (включая значительно) биологическую активность NGF, включая нисходящие пути, опосредованные передачей сигналов NGF, такие как связывание с рецепторами и/или вызванная клеточная реакция на NGF.

Термин «антагонист» не подразумевает какого-либо специфического механизма биологического действия, и считается, что он явно включает и охватывает все возможные фармакологические, физиологические и биохимические взаимодействия с NGF, и прямые, и косвенные, или взаимодействующие с NGF, его рецептором, или посредством другого механизма, и его последствия, которые могут быть достигнуты различными и химически разнородными композициями. Иллюстративные антагонисты NGF включают, но не ограничиваются, антитело против NGF, антисмысловую молекулу, направленную на NGF (включая антисмысловую молекулу, направленную на нуклеиновую кислоту, кодирующую NGF), соединение, ингибирующее NGF, структурный аналог NGF, доминантно-негативную мутацию рецептора TrkA, которая связывает NGF, и иммуноадгезин TrkA, антитело против р75, антисмысловую молекулу, направленную на любой или оба из рецепторов TrkA и/или р75 (включая, антисмысловую молекулу, направленную на нуклеиновую кислоту, кодирующую TrkA или р75) и ингибитор киназы. Для цели настоящего изобретения следует ясно понимать, что термин «антагонист» охватывает все ранее идентифицированные термины и функциональные состояния и характеристики, посредством которых сам NGF, биологическая активность NGF (включая, но не ограничивая его способность опосредовать любой аспект боли) или последовательности биологической активности по существу аннулируются, уменьшаются или нейтрализуются в любой значительной степени. В некоторых вариантах осуществления антагонист NGF связывает (физически взаимодействует) с NGF (например, антитело), связывается с рецептором NGF (таким как рецептор TrkA или рецептор р75) снижает (тормозит и/или блокирует) нисходящую передачу сигналов рецептора NGF, и/или ингибирует (снижает) синтез, продукцию или высвобождение NGF. В некоторых вариантах осуществления антагонист NGF связывает (физически взаимодействует) с NGF (например, антитело), связывается с рецептором NGF (таким как рецептор TrkA или рецептор р75) и/или снижает (тормозит и/или блокирует) нисходящую передачу сигналов рецептора NGF. В другом варианте осуществления антагонист NGF связывается с NGF и предотвращает димеризацию рецептора TrkA и/или автофосфорилирование TrkA. В других вариантах антагонист NGF ингибирует или снижает синтез NGF. В других вариантах осуществления антагонист NGF ингибирует или снижает синтез и/или продукцию (высвобождение). Примеры типов антагонистов NGF предоставлены в настоящем описании.

Используемый в настоящем описании термин «антитело против NGF» относится к антителу, которое способно связываться с NGF и ингибировать биологическую активность NGF и/или нисходящий путь (пути), опосредованный передачей сигналов NGF.

«Иммуноадгезин TrkA» относится к растворимой химерной молекуле, включающей фрагмент рецептора TrkA, например, внеклеточный домен рецептора TrkA и последовательность иммуноглобулина, которая сохраняет специфичность связывания рецептора TrkA.

«Биологическая активность» NGF в целом относится к способности связывать рецепторы NGF и/или активировать пути передачи сигналов рецепторов NGF. Без ограничения биологическая активность включает любую одну или более из следующих: способность связывать рецепторы NGF (такие как р и/или TrkA); способность содействовать димеризации и/или автофосфорилированию рецепторов TrkA;

способность активировать пути передачи сигналов рецепторов NGF; способность содействовать клеточной дифференцировке, пролиферации, выживанию, росту и другим изменениям клеточной физиологии, включая (в случае нейронов, включая периферические и центральные нейроны) изменение морфологии нейронов, синаптогенез, синаптическую функцию, высвобождение нейромедиаторов и/или нейропептидов и регенерацию после повреждения и способность опосредовать боль.

Термин «эпитоп» используется для обозначения сайтов связывания для (моноклональных или поликлональных) антител на антигенах, таких как белковые антигены.

Используемый в настоящем описании термин «лечение» представляет собой подход для получения благоприятных или желательных клинических результатов. Для целей настоящего изобретения благоприятные или желательные клинические результаты включают, но не ограничиваются, один или более из следующих: ослабление или облегчение любого аспекта боли, включая острую, хроническую, воспалительную, нейропатическую или послеоперационную боль. Для целей настоящего изобретения благоприятные или желательные клинические результаты включают, но не ограничиваются, один или более из следующих: включая уменьшение тяжести, облегчение одного или более симптомов, связанных с болью, включая любой аспект боли (такой как укорочение длительности боли и/или уменьшение болевой чувствительности или болевого ощущения).

«Снижение частоты возникновения» боли значит любое снижение тяжести (которые могут включать снижение необходимости и/или количества (например, воздействия) других средств и/или способов лечения, в целом используемых по поводу этих состояний, длительности и/или частоты (включая, например, задержку или увеличение времени до возникновения боли у индивидуума). Как понятно специалистам в данной области, индивидуумы могут варьироваться с точки зрения их реакции на лечение, и также, например, «способ снижения частоты возникновения боли у индивидуума» отражает введение антагониста NGF, описанного в настоящем описании, в сочетании с НСПВС, как описано в настоящем описании, на основании целесообразного ожидания, что такое введение может, вероятно, вызвать такое уменьшение частоты возникновения у этого конкретного индивидуума.

«Облегчение» боли или одного или более симптомов боли означает уменьшение или смягчение одного или более симптомов боли, по сравнению с отсутствием введения антагониста NGF в сочетании с НСПВС. «Облегчение» также включает укорочение или уменьшение длительности симптома.

«Смягчение» боли или одного или более симптомов боли означает уменьшение степени одного или более нежелательных клинических проявлений боли у индивидуума или популяции индивидуумов, получавших лечение антагонистом NGF в сочетании с НСПВС в соответствии с изобретением.

Используемый в настоящем описании термин «задержка» развития боли означает отсрочку, препятствие, замедление, задержку, стабилизацию и/или отложенное прогрессирование боли. Эта задержка может быть различной длительности, в зависимости от анамнеза заболевания и/или индивидуумов, получающих лечение. Как очевидно для специалиста в данной области, достаточная или значительная задержка может в действительности охватывать профилактику в том, что у индивидуума не развивается боль. Способ, который «задерживает» развитие симптома, представляет собой способ, который снижает вероятность развития симптома в данной временной рамке и/или снижает степень симптомов в данной временной рамке, по сравнению с отсутствием применения способа. Такие сравнения обычно основаны на клинических исследованиях с использованием статистически значимого количества индивидуумов.

-8Развитие» или «прогрессирование» боли означает исходные проявления и/или следующее прогрессирование расстройства. Развитие боли может быть выявлено и оценено с использованием стандартных клинических методик, которые хорошо известны в данной области. Однако развитие также относится к прогрессированию, которое может быть не выявляемым. С целью данного изобретения развитие или прогрессирование относится к биологическому течению симптомов. «Развитие» включает возникновение, рецидив и начало. Используемый в настоящем описании термин «начало» или «возникновение» боли включает исходное начало и/или рецидив.

«Эффективное количество» представляет собой количество, достаточное для получения благоприятных или желательных клинических результатов, включая облегчение или снижение болевого ощущения. Для целей настоящего изобретения, эффективное количество антагониста NGF (такого как антитело против NGF) и НСПВС включает количество, достаточное для лечения, облегчения, снижения интенсивности или профилактики боли (включая восприятие боли и ощущение боли) любого типа, включая острую, хроническую, воспалительную, нейропатическую или послеоперационную боль. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество НСПВС и антагониста NGF, способное модулировать порог чувствительности к внешним стимулам до уровня, сравнимого с уровнем, наблюдающимся у здоровых индивидуумов. В других вариантах осуществления этот уровень может не быть сравнимым с уровнем, наблюдающимся у здоровых индивидуумов, но снижен, по сравнению с индивидуумами, не получавшими комбинированную терапию. Эффективное количество антагониста NGF также охватывает количество антагониста NGF, достаточное для усиления лечения боли НСПВС (терапевтического эффекта), как описано в настоящем описании, или для снижения дозы НСПВС, необходимой для лечения или профилактики боли, как описано в настоящем описании. В соответствии с представлениями в данной области, эффективное количество антагониста NGF в сочетании с НСПВС может варьироваться, наряду с другими причинами, в зависимости от типа боли (и анамнеза пациента, а также других факторов, таких как тип (и/или дозировка) или используемого антагониста NGF и/или НСПВС). Эффективное количество в контексте настоящего изобретения может также представлять собой такое количества антагониста NGF и НСПВС, при котором достигается синергизм. Эффективное количество антагониста в контексте настоящего изобретения в целом означает количество, достаточное для того, чтобы привести к усилению терапевтического эффекта НСПВС, применяемого по подводу боли (которое, в свою очередь, значит, что снижена дозировка и/или наблюдается какой-либо другой благоприятный эффект) и/или привести к благоприятному эффекту, по сравнению с лечением одним НСПВС. «Эффективное количество» антагониста NGF может также привести к синергическому эффекту, по сравнению с введением с одним антагонистом NGF или НСПВС.

«Индивидуум» представляет собой позвоночное, предпочтительно млекопитающее, предпочтительнее человека. Млекопитающие включают, но не ограничиваются, сельскохозяйственных животных, спортивных животных, домашних животных, приматов, лошадей, коров, собак, мышей и крыс.

Термин «НСПВС» относится к нестероидному противовоспалительному соединению. НСПВС делятся на категории в зависимости от их способности ингибировать циклооксигеназу. Циклооксигеназа и циклооксигеназа 2 представляют собой две основных изоформы циклооксигеназы, и большинство стандартных НСПВС представляют собой смешанные ингибиторы этих двух изоформ. Большинство стандартных НСПВС относятся к одной из следующих пяти структурных категорий: (1) производные пропионовой кислоты, такие как ибупрофен, напроксен, напросин, диклофенак и кетопрофен; (2) производные уксусной кислоты, такие как толметин и слиндак; (3) производные фенамовой кислоты, такие как мефенамовая кислота и меклофенамовая кислота; (4) производные бифенилкарбоновой кислоты, такие как дифлунизал и флуфенизал; и (5) оксикамы, такие как пироксим, судоксикам и изоксикам.

Был описан другой класс НСПВС, которые избирательно ингибируют циклооксигеназу 2. Ингибиторы Сох-2 были описаны, например, в патентах США №№ 5616601; 5604260; 5593994; 5550142;

5536752; 5521213; 5475995; 5639780; 5604253; 5552422; 5510368; 5436265; 5409944 и 5130311, которые все включены в настоящее описание в качестве ссылки. Определенные иллюстративные ингибиторы СОХ-2 включают целекоксиб (SC-58635), рофекоксиб, DUP-697, флозулид (CGP-28238), мелоксикам, 6метокси-2-нафтилуксусную кислоту (6-MNA), МK-966, набуметон (пролекарство для 6-MNA), нимезулид, NS-398, SC-5766, SC-58215, Т-614; или их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления аспирин и/или ацетоминофен применяются в сочетании с антагонистом NGF (таким как антитело против NGF). Аспирин представляет собой другой тип не стероидного противовоспалительного соединения.

Используемый в настоящем описании термин «в сочетании» включает одновременное введение и/или введение в различное время. Введение в сочетании также охватывает введение в виде совместной композиции (т.е. антагонист NGF и НСПВС присутствуют (комбинируются) в одной и той же композиции) и/или введение в виде отдельных композиций. Используемый в настоящем описании термин «введение в сочетании» предназначен охватывать любое обстоятельство, при котором НСПВС и антагонист NGF вводятся в эффективном количестве индивидууму, которое может происходить одновременно и/или отдельно. Как далее обсуждается в настоящем описании, понятно, что антагонист NGF и НСПВС могут вводиться с различной частотой и/или интервалами введения. Например, антитело против NGF можно -9вводить 1 раз/нед., тогда как НСПВС можно вводить чаще. Понятно, что антагонист NGF и НСПВС могут вводиться одним и тем же путем введения или различными путями введения.

«Послеоперационная боль» (взаимозаменяемо именуемая «болью после разреза» или «посттравматической болью») относится к боли, возникающей или происходящей от внешней травмы, такой как порез, прокол, разрез, разрыв или рана ткани индивидуума (включая боль, которая возникает в результате хирургических процедур, инвазивных, или не инвазивных). Используемый в настоящем описании термин «послеоперационная боль» не включает боль, которая возникает (появляется или происходит) без внешней физической травмы. В некоторых вариантах осуществления послеоперационная боль является внутренней или внешней (включая периферическую) болью, и рана, порез, травма, разрыв или разрез могут возникнуть случайно (как при травматической ране) или умышленно (как при операционном разрезе). Используемый в настоящем описании термин «боль» включает восприятие боли и ощущение боли, и боль можно оценивать объективно с использованием балльных оценок боли и других способов, хорошо известных в данной области. Используемый в настоящем описании термин «послеоперационная боль»

включает аллодинию (т.е. повышенную реакцию (т.е. восприятие боли) в ответ на обычно не болевой раздражитель) и гиперальгезию (т.е. повышенную реакцию на обычно болевой или неприятный раздражитель), которые, в свою очередь, могут быть термическими или механическими (тактильными) по природе. В некоторых вариантах осуществления боль характеризуется термической чувствительностью, механической чувствительностью и/или болью в покое. В некоторых вариантах осуществления послеоперационная боль включает механически вызванную боль или боль в покое. В других вариантах осуществления послеоперационная боль включает боль в покое.

Лечение боли НСПВС «усиливается», когда аспект лечения НСПВС улучшается (по сравнению с введением НСПВС без введения антагониста NGF). Например, эффективность лечения НСПВС можно увеличить в присутствии антагониста NGF, относительно эффективности НСПВС в отсутствие антагониста NGF. В качестве другого примера, лечение или профилактика боли НСПВС может быть «усилена»

применением антагониста NGF в сочетании с НСПВС, когда это применение обеспечивает возможность лучшего облегчения боли (например, когда применяется доза НСПВС, которая не обеспечивает возможность эффективного лечения или профилактики боли).

В отношении всех способов, описанных в настоящем описании, ссылки на антагонисты NGF и НСПВС также включают композиции, включающие одно или несколько этих средств. Настоящее изобретение можно применять для лечения боли у индивидуумов, включающих всех млекопитающих, и человека, и не человека.

В одном аспекте изобретение предоставляет способы лечения боли у индивидуума, включающие введение эффективного количества антагониста NGF (такого как антитело против NGF) в сочетании с эффективным количеством НСПВС. В некоторых вариантах осуществления вводится количество антагониста NGF, достаточное для того, чтобы обеспечить возможность снижения обычной дозы НСПВС, требуемой для получения такой же степени эффекта облегчения боли по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80% или по меньшей мере примерно на 90%, или более.

В другом аспекте изобретение предоставляет способы усиления лечения боли НСПВС у индивидуума, предусматривающие введение эффективного количества антагониста NGF в сочетании с эффективным количеством НСПВС.

В некоторых вариантах осуществления боль включает одну или несколько из следующих: острую и/или хроническую боль, любую боль с воспалительным компонентом, послеоперационную боль (включая зубную боль), мигрень, головную боль и невралгию тройничного нерва, боль, связанную с ожогом, раной или почечным камнем, боль, связанную с травмой (включая травматическое повреждение головы), нейропатическую боль, боль, связанную с серповидноклеточным кризом, боль, связанную с дисменорреей или кишечной дисфункцией, и боль, связанную с раком (включая «приступообразную боль» и боль, связанную с терминальными стадиями рака). В других вариантах осуществления боль представляет собой боль, которую обычно лечат НСПВС (таким как ибупрофен). В других вариантах осуществления боль связана с ожогом. В других вариантах осуществления боль связана с ревматоидным артритом. В других вариантах осуществления боль связана с остеоартритом.

В другом аспекте изобретение предоставляет способы профилактики, облегчения и/или профилактики развития или прогрессирования боли. Так, в некоторых вариантах осуществления, антагонист NGF, такой как антитело против NGF, и/или НСПВС вводятся перед болезненным событием (таким как операция). Например, антагонист NGF можно ввести за 30 мин, за 1, 5, 10, 15 ч, 24 ч или даже более, например за 1 день, несколько дней или даже 1 неделю, 2 недели, 3 недели или более перед видами активности, которые, вероятно, приведут или связаны с риском вызванной боли, такие как внешняя травма или операция.

Лечение или профилактика боли оценивается с использованием способов, хорошо известных в данной области. Оценку можно выполнять на основании объективного показателя, такого как наблюдение также основана на субъективных показателях, таких как характеристика пациентом боли с использованием различных шкал боли (см., например, Katz et al., Surg Clin North Am. (1999) 79 (2):231-52; Caraceni et al. J Pain Symtom Manage (2002) 23 (3):239-55).

Диагностика и оценка боли при ревматоидном артрите хорошо установлена в данной области.

Оценку можно выполнить на основании показателей, известных в данной области, таких как характеристика пациентом боли с использованием различных шкал боли (см., например, Katz et al., Surg Clin North Am. (1999) 79 (2):231-52; Caraceni et al. J Pain Symtom Manage (2002) 23(3):239-55). Существуют также обычно используемые шкалы измерения патологического состояния, такие как the American College of Rheumatology (ACR) (Felson, et al., Arthritis and Rheumatism (1993) 36(6):729-740), the Health Assessment Questionnaire (HAQ) (Fries, et al., (1982) J. Rhenmatol. 9:789-793), the Paulus Scale (Paulus, et al., Arthritis and Rheumatism (1990) 33: 477-484), and the Arthritis Impact Measure Scale (AIMS) (Meenam, et al., Arthritis and Rheumatology (1982) 25:1048-1053).

Диагностика и оценка боли при остеоартрите хорошо установлена в данной области. Оценку можно выполнить на основании показателей, известных в данной области, таких как характеристика пациентом боли с использованием различных шкал боли (см., например, Katz et al., Surg Clin North Am. (1999) (2):231-52; Caraceni et al. J Pain Symtom Manage (2002) 23(3):239-55). Например, шкалу WOMAC боли при подъеме после операции (включая боль, тугоподвижность и физическую функцию) и 100 мм зрительную аналоговую шкалу (VAS) можно использовать для оценки боли и оценки реакции на лечение.

Понятно, что когда антагонист NGF (такой как антитело против NGF) и НСПВС вводятся в сочетании, или в виде одной, или отдельной композиции (композиций), антагонист фактора роста нервов и НСПВС представлены в соотношении, которое согласуется с проявлением желательного эффекта. В некоторых вариантах осуществления соотношение по массе между антагонистом фактора роста нервов и НСПВС может составлять примерно 1 к 1. В некоторых вариантах осуществления соотношение может составлять от примерно 0,001 до примерно 1 и от примерно 1000 до примерно 1, от примерно 0,01 до примерно 1 и от примерно 100 до примерно 1, или от примерно 0,1 до примерно 1 и от примерно 10 до примерно 1. Предусмотрены другие соотношения.

Следует понимать, что количество антагониста фактора роста нервов и НСПВС, требуемое для применения при лечении или профилактике боли, будет варьироваться не только в зависимости от выбранных конкретных соединений или композиций, но также от пути введения, природы состояния, подвергающегося лечению, и возраста и состояния пациента, и, в конечном счете, будет выбираться по усмотрению лечащего врача.

В способах изобретения используется антагонист NGF, который относится к любой молекуле, которая блокирует, подавляет или снижает (включая значительно) биологическую активность NGF, включая нисходящие пути, опосредованные передачей сигналов NGF, такие как связывание с рецепторами и/или клеточная реакция, вызванная NGF. Термин «антагонист» не подразумевает специфический механизм безотносительного биологического действия, и считается, что он явно включает и охватывает все возможные фармакологические, физиологические и биохимические взаимодействия с NGF и их последствия, которые могут быть достигнуты разнообразными различными и химически различающимися композициями. Иллюстративные антагонисты NGF включают, но не ограничиваются, антитело против NGF, полипептид (включая полипептид, включающий домен, связывающий NGF, полученный из антитела против NGF, например, связывающий домен, включающий области CDR, достаточные для связывания NGF), антисмысловую молекулу, направленную на NGF (включая антисмысловую молекулу, направленную на нуклеиновую кислоту, кодирующую NGF), антисмысловую молекулу, направленную на оба рецептора TrkA и/или р75 (включая антисмысловые молекулы, направленные на молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую TrkA или р75), соединение, ингибирующее NGF, структурный аналог NGF, доминантно-негативную мутацию рецептора TrkA и/или р75, которая связывает NGF, антитело против TrkA, который связывает NGF, иммуноадгезин TrkA, антитело против TrkA, антитело против р75 и ингибитор киназы. Для цели настоящего изобретения следует четко понимать, что термин «антагонист»

охватывает ранее идентифицированные термины, названия и функциональные состояния и характеристики, посредством которых сам NGF, биологическая активность NGF (включая, но не ограничиваясь, способность опосредовать любой аспект боли) или последствия биологической активности по существу аннулируется, уменьшается или нейтрализуется в любой значимой степени. В некоторых вариантах осуществления антагонист NGF (например, антитело против NGF) связывает (физически взаимодействует с) NGF, связывается с рецептором NGF (таким как рецептор TrkA и/или р75) и/или снижает и/или блокирует) нисходящую передачу сигналов рецептора NGF. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления антагонист NGF связывает (физически взаимодействует с) NGF. В других вариантах осуществления антагонист NGF связывается с рецептором NGF (таким как рецептор TrkA и/или р75). В других вариантах осуществления антагонист снижает (тормозит и/или блокирует) нисходящую передачу сигналов рецептора NGF (например, передачу сигналов ингибиторов киназы). В других вариантах осуществления антагонист ингибирует (снижает) синтез и/или высвобождение NGF. В другом варианте осуществления NGF отличен от антитела против NGF. В некоторых вариантах осуществления антагонист NGF связывает NGF (такой как hNGF) и значительно не связывается с родственными нейротропинами, такими как NT-3, NT-4/5 и/или BDNF. В некоторых вариантах осуществления антагонист связывает человеческий NGF и значительно не связывает NGF от других видов позвоночных (в некоторых вариантах осуществления млекопитающих). В некоторых вариантах осуществления антагонист NGF связывает человеческий NGF, а также один или несколько NGF от других видов позвоночных (в некоторых вариантах осуществления млекопитающих). В некоторых вариантах осуществления антагонист NGF связывает NGF, а также по меньшей мере один другой нейротропин. В некоторых вариантах осуществления антагонист NGF связывается с NGF видов млекопитающих, таких как лошадь или собака, но значительно не связывается с NGF от других видов млекопитающих.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист NGF включает антитело против NGF. Антитело против NGF должно проявлять любую одну или несколько из следующих характеристик:

(а) связывание с NGF и ингибирование биологической активности NGF и/или нисходящего пути (путей), опосредованного функцией передачи сигналов NGF; (b) лечение или профилактика любого аспекта боли, в частности, в сочетании с НСПВС; (с) блокада или уменьшение активации рецепторов NGF (включая димеризацию и/или автофосфорилирование рецепторов trkA); (d) увеличение выведения NGF; (е) усиление лечения боли НСПВС.

Антитела против NGF известны в данной области (см., например, заявки РСТ №№ WO 02096458;

WO 01/78698, WO 01/64247, патенты США №№ 5844092, 5877016 и 6153189; Hongo et al., Hybridoma, 19:215-227 (2000); Cell. Molec. Biol. 13:559-568 (1993); номера доступа GenBank U39608, U39609, L или L17077.

В некоторых вариантах осуществления антитело против NGF специфически связывается с NGF. В еще одних вариантах осуществления антитело является гуманизированным (таким как описанное в настоящем описании антитело Е3). В некоторых вариантах осуществления антитело против NGF представляет собой антитело Е3 (как описано в настоящем описании). В других вариантах осуществления антитело против NGF включает один или более CDR антитела Е3 (например, 1, 2, 3, 4, 5 или, в некоторых вариантах осуществления, все 6 CRD из Е3). В других вариантах осуществления антитело против NGF является человеческим. В еще одних вариантах осуществления антитело против NGF включает аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, показанную в табл. 1 (SEQ ID NO:1), и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, показанную в табл. 2 (SEQ ID NO:2). В еще одних вариантах осуществления антитело против NGF включает аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, показанную в табл. 1 (SEQ ID NO:1). В еще одних вариантах осуществления антитело против NGF включает аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, показанную в табл. 2 (SEQ ID NO:2). В еще одних вариантах осуществления антитело включает модифицированную константную область, такую как константная область, которая является иммунологически инертной, например, не запускает лизис, опосредованный комплементом, или не стимулирует антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC). В других вариантах осуществления константная область модифицирована, как описано в Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; заявке РСТ № PCT/GB99/01441; и/или в заявке на патент Великобритании № 9809951.8. В других вариантах осуществления антитело против NGF представляет собой любое антитело, описанное в заявке на патент США под серийным № 10/745775.

В некоторых вариантах осуществления антитело против NGF представляет собой гуманизированное мышиное моноклональное антитело против NGF, называемое антителом «Е3», которое включает константную область тяжелой цепи человеческого IgG2a, содержащую следующие мутации: от А330Р331 до S330S331 (нумерация аминокислот со ссылкой на последовательность IgG2a дикого типа;

см. Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624); каппа константной области человеческой легкой цепи и вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, показанные в табл. 1 и 2.

Следующие полинуклеотиды, кодирующие вариабельную область тяжелой цепи Е3 или легкой цепи Е3 были депонированы в АТСС 8 января 2003 г.:

цепи, показанной в табл. 2; Вектор Eb.pur.911.3Е представляет собой полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, показанной в табл. 2, и Вектор Db.911.3E представляет собой полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, показанной в табл. 1. Эти полинуклеотиды также кодируют константные домены.

Существует по меньшей мере две методики для определения CDR: (1) подход, основанный на перекрестно-видовой изменчивости последовательностей (т.е. Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Insitut.es of Health, Bethesda Md)); и (2) поход, основанный на кристаллографических исследованиях комплексов антиген-антитело (Chothia et al. (1989) Nature 342:877; Allazikani et al. (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). Используемый в настоящем описании термин «CDR»

может относиться к CDR, определенным любым подходом или комбинацией обоих подходов.

В другом варианте осуществления антитело против NGF включает один или несколько CDR антитела Е3 (например, 1, 2, 3, 4, 5 или в некоторых вариантах осуществления все 6 CDR из Е3). Определение областей CDR достаточно известно в данной области. CDR могут представлять собой Kabat, Chothia или комбинацию Kabat и Chothia.

Антитела, которые можно применять в настоящем изобретении, могут охватывать моноклональные антитела, поликлональные антитела, фрагменты антител (например, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc и т.д.), химерные антитела, биспецифические антитела, гетероконъюгатные антитела, одноцепочечные (ScFv), их мутанты, гибридные белки, включающие антительную часть, гуманизированные антитела и любую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая включает сайт распознавания антигена требуемой специфичности, включая варианты гликозилирования антител, варианты аминокислотной последовательности антител и ковалентно модифицированные антитела. Антитела могут быть мышиными, крысиными, человеческими или любого другого происхождения (включая химерные и гуманизированные антитела). Для целей настоящего изобретения антитело взаимодействует с NGF таким образом, который ингибирует NGF и/или нисходящие пути, опосредованные функцией передачи сигналов NGF. В одном варианте осуществления антитело представляет собой человеческое антитело, которое распознает один или несколько эпитопов на человеческом NGF. В другом варианте осуществления антитело представляет собой мышиное или крысиное антитело, которое распознает один или несколько эпитопов на человеческом NGF. В другом варианте осуществления антитело распознает один или несколько эпитопов на NGF, выбранном из группы, состоящей из: грызунов, собак, кошек, лошадей и коров. В другом варианте осуществления антитело включает модифицированную константную область, такую как константная область, которая является иммунологически инертной (т.е. не запускает опосредованный комплементом лизис) или не стимулирует антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC). Активность ADCC можно оценить с использованием способов, раскрытых в патенте США № 5500362. В других вариантах осуществления константная область модифицирована, как описано в Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-1624; публикации РСТ № PCT/GB99/01441 и/или в заявке на патент Великобритании № 9809951.8.

Аффинитет связывания антитела против NGF с NGF (таким как hNGF) может составлять от примерно 0,01 до примерно 1 нМ, от примерно 0,05 до примерно 0,25 нМ, от примерно 0,10 до примерно 0,80 нМ, от примерно 0,15 до примерно 0,75 нМ и от примерно 0,18 до примерно 0,72 нМ. В других вариантах осуществления аффинитет связывания составляет примерно 1, примерно 2, примерно 5, примерно 10, примерно 15, примерно 20, примерно 40 или более чем примерно 40 пкМ. В одном варианте осуществления аффинитет связывания составляет между примерно 2 нкМ и 22 пкМ. В других вариантах осуществления аффинитет связывания составляет менее примерно 100, примерно 50, примерно 10, примерно 1 нМ, примерно 500, примерно 100, примерно 50, примерно 10 пкМ. В некоторых вариантах осуществления аффинитет связывания составляет примерно 10 нМ. В других вариантах осуществления аффинитет связывания составляет менее примерно 10 нМ. В других вариантах осуществления аффинитет связывания составляет примерно 0,1 или примерно 0,07 нМ. В других вариантах осуществления аффинитет связывания составляет менее примерно 0,1 или менее примерно 0,07 нМ. В других вариантах осуществления аффинитет связывания составляет любой из от примерно 100, примерно 50, примерно 10, примерно 1 нМ, примерно 500 примерно 100, примерно 50 пкМ до любого из примерно 2 пкМ, примерно 5, примерно 10, примерно 15, примерно 20 или примерно 40 пкМ. В некоторых вариантах осуществления аффинитет связывания составляет любой из примерно 100, примерно 50, примерно 10, примерно 1 нМ, осуществления аффинитет связывания составляет примерно 2, примерно 5, примерно 10, примерно 15, примерно 20, примерно 40 пкМ или более примерно 40 пкМ.

Одним способом определения аффинитета связывания антител с NGF является измерение аффинитета монофункциональных фрагментов Fab антитела. Для получения монофункциональных фрагментов Fab антитело (например, IgG) можно расщепить папаином или экспрессировать рекомбинантно. Аффинитет фрагмента Fab против NGF антитела можно определить поверхностным резонансом плазмона (устройство для определения поверхностного резонанса плазмона (SPR) BIAcore 3000™, BIAcore, INC, Piscaway NJ). Чипы СМ5 можно активировать гидрохлоридом N-этил-N'-(3диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями поставщика. Человеческий NGF можно развести в 10 мМ ацетате натрия при рН 4,0 и инъецировать поверх активированного чипа в концентрации 0,005 мг/мл. Используя вариабельное время потока по отдельным каналам чипа, можно достичь два диапазона плотности антигена: 100-200 единиц реакции (RU) для детальных кинетических исследований и 500-600 RU для скрининговых анализов. Чип можно блокировать этаноламином. Исследования регенерации показали, что смесь элюционного буфера Pierce (продукт № 21004, Pierce Biotechnology IL) и 4 М NaCl (2:1) эффективно удаляет связанный Fab, одновременно сохраняя активность hNGF на чипе в течение 200 инъекций. Буфер HBS-EP (0,01 М HEPES, рН 7,4, 0,15 NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,005% поверхностно-активное вещество Р20) используют в качестве рабочего буфера для анализов BIAcore. Серийные разведения (0,1-10 определенный KD) образцов очищенного Fab инъецируют в течение 1 мин в концентрации 100 мкл/мин и допускаются величины времени диссоциации до 2 ч. Концентрации белков Fab определяют ELISA и/или электрофорезом SDS-PAGE с использованием Fab известной концентрации (по данным определения аминокислотным анализом) в качестве стандарта. Скорости кинетической ассоциации (kon) и скорости диссоциации (koff) получают одновременно подгонкой данных к модели связывания Langmuir 1:1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6:99-110) с использованием программы оценки BIA. Величины константы равновесной диссоциации (KD) можно рассчитать в виде koff/kon. Этот протокол подходит для использования при определении аффинитета связывания антитела с NGF любого вида, включая человеческий NGF, NGF других позвоночных (в некоторых вариантах осуществления, млекопитающих) (такой как мышиный NGF, крысиный NGF, NGF приматов), а также для использования с другими нейротропинами, такими как родственные нейротропины NT3, NT4/5 и/или BDNF.

В некоторых вариантах осуществления антитело связывает человеческий NGF и значительно не связывает NGF от других видов позвоночных (в некоторых вариантах осуществления, млекопитающих).

В некоторых вариантах осуществления антитело связывает человеческий NGF, а также один или несколько NGF от других видов позвоночных (в некоторых вариантах осуществления, млекопитающих, таких как грызуны). В еще одних вариантах осуществления антитело связывает NGF и не вступает в значительное перекрестное взаимодействие с другими нейротропинами (такими как родственные нейротропины NT3, NT4/5 и/или BDNF). В некоторых вариантах осуществления антитело связывает NGF, а также, по меньшей мере, один другой нейротропин. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с NGF видов млекопитающих, таких как лошадь или собака, но значительно не связывается с NGF от других видов млекопитающих.

Эпитопы могут быть непрерывными или прерывистыми. В одном варианте осуществления антитело связывает по существу тот же эпитоп hNGF, что и антитело, выбранное из группы, состоящей из MAb 911, MAb 912 и MAb 938, как описано в публикации Hongo, et al., Hybridoma 19:215-227 (2000). В другом варианте осуществления антитело связывает по существу тот же эпитоп hNGF, что и MAb 911. В еще одном варианте осуществления антитело связывает по существу тот же эпитоп hNGF, что и MAb 909 (см.

Hongo, et al., выше). Например, эпитоп может включать один или несколько из: К32, К34 и Е35 в пределах вариабельной области 1 (аминокислоты 23-35) hNGF; остатки F79 и Т81 в пределах вариабельной области 4 (аминокислоты 81-88) hNGF; остатки Н84 и К88 в пределах вариабельной области 4; остаток R103 между вариабельной областью 5 (аминокислоты 94-98) hNGF и С-концом (аминокислоты 111-118) hNGF; остаток E11 в пределах превариабельной области 1 (аминокислоты 10-23) hNGF; Y52 между вариабельной областью 2 (аминокислоты 40-49) hNGF и вариабельной областью 3 (аминокислоты 59-66) hNGF; остатки L112 и S113 в пределах С-конца hNGF; остатки R59 и R69 в пределах вариабельной области 3 hNGF; или остатки V18, V20 и G23 в пределах превариабельной области 1 hNGF. Кроме того, эпитоп может включать одну или несколько из вариабельной области 1, вариабельной области 3, вариабельной области 4, вариабельной области 5, N-концевой области и/или С-конца hNGF. В еще одном варианте осуществления антитело значительно снижает доступность для растворителя остатка R103 hNGF.

Понятно, что хотя описанные выше эпитопы относятся к человеческому NGF, средний специалист в данной области может совместить структуры человеческого NGF с NGF других видов и идентифицировать вероятные копии этих эпитопов.

В одном аспекте антитела (например, человеческие, гуманизированне, мышиные, химерные), которые могут ингибировать NGF, можно получить использованием иммуногенов, которые экспрессируют - 14 полную длину или частичную последовательность NGF. В другом аспекте можно использовать иммуноген, включающий клетку, которая избыточно экспрессирует NGF. Другой пример иммуногена, который можно использовать, представляет собой белок NGF, который содержит NGF полной длины или часть белка NGF.

Антитела против NGF можно получить любым способом, известным в данной области. Путь и схема иммунизации животного-хозяина в целом согласуются с принятыми и обычными методиками для стимуляции и продукции антител, как далее описано в настоящем описании. Общие методики для продукции человеческих и мышиных антител известны в данной области и описаны в настоящем описании.

Предусматривается, что можно манипулировать любым млекопитающим индивидуумом, включая людей или полученные у них клетки, продуцирующие антитела, для того, чтобы служить в качестве основы для продукции линии клеток гибридомы млекопитающих, включая человека. Обычно животноехозяин инокулируется внутрибрюшинно, внутримышечно, перорально, подкожно, внутриподошвенно и/или внутрикожно некоторым количеством иммуногена, включая то, как описано в настоящем описании.

Гибридомы можно получить из лимфоцитов и иммортализованных клеток миеломы с использованием общей методики гибридизации соматических клеток Kohler, В. and Milstein, С. (1975) Nature 256:495-497 или в модификации Buck, D.W., et al. In Vitro, 18:377-381 (1982). При гибридизации можно использовать доступные линии миеломы, включая, но не ограничиваясь, X63-Ag8.653 и линии из Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., USA. В целом, методика включает слияние клеток миеломы и лимфоидных клеток с использованием фузогена, такого как полиэтиленгликоль, или электрическими средствами, хорошо известными специалистам в данной области. После слияния клетки отделяют от среды слияния и выращивают в избирательной ростовой среде, такой как среда гипоксантинааминоптерина-тимидина (HAT), для удаления негибридизированных родительских клеток. Для культивирования гибридом, которые секретируют моноклональные антитела, можно использовать любую из описанных в настоящем описании сред с добавкой сыворотки или без нее. В качестве другой альтернативы методике слияния клеток, можно использовать В-клетки, иммортализованные EBV (вирусом Эпштейна-Барра), для продукции моноклональных антител против NGF настоящего изобретения. При желании, гибридомы распространяются и субклонируются, и надосадочные жидкости анализируют для выявления антииммуногенной активности обычными процедурами иммуноанализа (например, радиоиммуноанализа, ферментного иммуноанализа или флюоресцентного иммуноанализа).

Гибридомы, которые можно использовать в качестве источника антител, охватывают все производные, клетки потомства родительских гибридом, которые продуцируют моноклональные антитела, специфичные для NGF, или их части.

Гибридомы, которые продуцируют такие антитела, можно выращивать in vitro или in vivo с использованием известных процедур. При желании, моноклональные антитела можно выделить из культуральной среды или биологических жидкостей обычными процедурами очистки иммуноглобулина, такими как осаждение сульфатом аммония, гель-электрофорез, диализ, хроматография и ультрафильтрация.

Нежелательную активность в случае ее присутствия можно удалить, например, проведением получения над адсорбентами, изготовленными из иммуногена, прикрепленного к твердой фазе, и элюированием или высвобождением желательных антител из иммуногена. Иммунизация животного-хозяина человеческим NGF или фрагментом, содержащим аминокислотную последовательность-мишень, конъюгированную с белком, который является иммуногенным у видов, подлежащих иммунизации, например, гемоцианин в форме замочной скважины или блюдечка, сывороточный альбумин, бычий тиреоглобулин или ингибитор трипсина соевых бобов с использованием бифункционального или дериватизирующего средства, например, сложного малеимидобензоилового эфира сульфосукцинимида (сопряженное связывание через цистеиновые остатки), N-гидроксисукцинимида (через лизиновые остатки), глутаральдегида, янтарного ангидрида, SOCl2 или R1N=C=NR, где R и R1 представляют собой различные алкильные группы, может дать популяцию антител (например, моноклональных антител).

При желании, интересующее антитело против NGF (моноклональное или поликлональное) можно секвенировать, и полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид антитела против NGF, можно затем клонировать в вектор для экспрессии или распространения. Последовательность, кодирующая интересующее антитело, может поддерживать в векторе в клетке-хозяине, и клетку-хозяина можно затем размножить и заморозить для будущего применения. В альтернативе, полинуклеотидную последовательность можно использовать для генетического манипулирования для «гуманизации» антитела или для улучшения аффинитета или других характеристик антитела. Например, константную область можно подвергнуть манипуляциям генной инженерии для того, чтобы она больше напоминала человеческие константные области во избежание иммунной реакции, если антитело используется в клинических испытаниях и способах лечения у людей. Может быть желательно подвергнуть генетическим манипуляциям последовательность антитела для получения большего аффинитета к NGF и больше эффективности при ингибировании NGF. Для специалиста в данной области будет очевидно, что можно произвести одно или несколько изменений полинуклеотида в антителе против NGF и все же сохранить его способность связываться с NGF.

(1) определение нуклеотида и прогнозируемой аминокислотной последовательности легкого и тяжелого вариабельных доменов исходного антитела, (2) проектирование гуманизированного антитела, т.е. решение, какую каркасную область антитела использовать во время процесса гуманизации; (3) действительные методологии/методики гуманизации; и (4) трансфекция и экспрессия гуманизированного антитела (см., например, патенты США №№ 4816567, 5807715, 5866692, 6331415, 5530101, 5693761, 5693762, 5585089 и 6180370.

Был описан ряд молекул «гуманизированного» антитела, включающих связывающий антиген сайт, полученный из нечеловеческого иммуноглобулина, включая химерные антитела, имеющие области V грызунов или модифицированные области V грызунов и их ассоциированные определяющие комплементарность области (CDR), слитые с человеческими константными доменами (см., например, Winter et al.

Nature 349:293-299 (1991), Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. J. Immunol. 138:4534-4538 (1987) и Brown et al. Cancer Res. 47:3577-3583 (1987)). Другие ссылки описывают CDR грызунов, пересаженный в человеческую опорную каркасную область (FR) перед слиянием с константным доменом соответствующего человеческого антитела (см., например, Riechmann et al. Nature 332:323-327 (1988), Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536 (1988) и Jones et al. Nature 321:522-525 (1986)).

Другая ссылка описывает CDR грызунов, поддерживаемые рекомбинантно облицованные каркасные области грызунов (см., например, европейскую патентную публикацию № 519596). Эти «гуманизированные» молекулы предназначены для минимизации нежелательной иммунологической реакции в отношении молекул античеловеческих антител грызунов, которая ограничивает длительность и эффективность терапевтических видов применения этих частей у людей-реципиентов. Например, константную область антитела можно сконструировать методами генной инженерии так, что она будет иммунологически инертной (например, не запускает лизис комплементом (см., например, PCT/GB99/01441; заявка на патент Великобритании № 9809951.8). Другие способы гуманизации антител, которые можно также использовать, раскрыты Daugherty et al., Nucl. Acids. Res. 19:2471-2476 (1991) и в патентах США №№ 6180377, 6054297, 5997867, 5866692, 6210671, 6350861, и в публикации РСТ № 01/27160. Другие способы описаны в заявке на патент США под серийным № 10/745775.

В еще одной альтернативе полностью человеческие антитела можно получить использованием имеющихся в продаже мышей, которые были подвергнуты модификации генной инженерией для экспрессии специфических белков человеческого иммуноглобулина. Трансгенные животные, которые предназначены для продукции более желательных (например, полностью человеческих антител) или более целесообразного иммунного ответа, можно также использовать для генерирования гуманизированных или человеческих антител. Примерами такой технологии являются Xenomouse™ от Abgenix, Inc. (Fremont, CA) и HuMAb-Mouse® и ТС Mouse™ от Medarex, Inc. (Princeton, NJ).

Очевидно, что хотя приведенное выше обсуждение относится к гуманизированным антителам, общие обсужденные принципы применимы для получения антител для использования, например, у собак, кошек, приматов, лошадей и коров. Кроме того, очевидно, что один или несколько описанных в настоящем описании аспектов гуманизации антител могут комбинироваться, например, пересадка CDR, мутация каркаса и мутация CDR.

В альтернативе, антитела можно получить рекомбинантно и экспрессировать с использованием любого способа, известного в данной области. В другой альтернативе, антитела можно изготовить рекомбинантно технологией воспроизведения фага (см., например, патенты США №№ 5565332, 5580717, 5733743, 6265150 и Winteer et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994). Альтернативно, можно использовать технологию воспроизведения фага (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990) для продукции человеческих антител и фрагментов антител in vitro из генных репертуаров вариабельного (V) домена иммуноглобулина от иммунизированных доноров. В соответствии с этой методикой, гены домена V антитела клонируются внутрь рамки или в ген или большого, или маленького белка покрытия нитевидного бактериофага, такого как М13 или fd, и проявляются в виде функциональных фрагментов антитела на поверхности частицы фага. Ввиду того, что нитевидная частица содержит копию однонитевой ДНК генома фага, селекции, основанные на функциональных свойствах антитела, также приводят к отбору гена, кодирующего антитело, проявляющего эти свойства. Таким образом, фаг имитирует некоторые из свойств В-клетки. Воспроизведение фага можно выполнить в различных форматах (обзор см., например, в публикации Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564- (1993). Несколько источников сегментов V гена можно использовать для воспроизведения фага. Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) выделили разнообразный ряд антител против оксазолона из маленькой, случайной комбинаторной библиотеки генов V, полученной из селезенок иммунизированных мышей.

Можно сконструировать репертуар генов V от иммунизированных людей-доноров, и антитела к разнообразному ряду антигенов (включая аутоантигены) можно выделить, по существу следуя методикам, описанным Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) или Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). При естественном иммунном ответе гены антитела накапливают мутации с высокой скоростью (соматическая гипермутация). Некоторые из введенных изменений придадут более высокий аффинитет, и В-клетки, дифференцируются во время введения последующей разрешающей дозы антигена. Этот естественный процесс можно имитировать использованием методики, известной как «перетасовка цепи» (Marks, et al., Bio/Technol. 10:779-783 (1992)). В этом способе аффинитет «первичных» человеческих антител, полученных воспроизведением фага, можно улучшить последовательным замещением генов области V тяжелой и легкой цепи репертуарами естественно встречающихся вариантов (репертуаров) генов домена V, полученных у неиммунизирозанных доноров. Эта методика обеспечивает возможность продукции антител и фрагментов антител с аффинитетами в диапазоне пкМ-нМ. Стратегия изготовления очень больших репертуаров антител фага (также известных, как «источник всех библиотек») была описана Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993). Перетасовку гена можно также использовать для получения человеческих антител из антител грызунов, где человеческое антитело имеет аффинитеты и специфичности, аналогичные исходному антителу грызунов. В соответствии с этим способом, который также именуется «впечатыванием эпитопа», ген домена V тяжелой или легкой цепи антител грызунов, полученных методикой воспроизведения фага, замещается репертуаром генов человеческого домена V, создавая химеры грызуна-человека. Отбор на антигене приводит к выделению человеческих, вариабельных областей, способных восстановить сайт, связывающий функциональный антиген, т.е. эпитоп управляет (впечатывает) выбором партнера. Когда процесс повторяется для замещения остающегося домена V грызунов, получается человеческое антитело (см. патентную заявку РСТ WO 9306213, опубликованную 1 апреля 1993г.). В отличие от традиционной гуманизации антител грызунов, которые не имеют каркас или остатки CDR, происходящие от грызунов. Очевидно, что хотя приведенное выше обсуждение относится к гуманизированным антителам, общие обсужденные принципы применимы к получению по требованию антител для использования, например, у собак, кошек, приматов, лошадей и коров.

Антитела можно изготовить рекомбинантно сначала выделением антител и клеток, продуцирующих антитела, от животных-хозяев, получая генную последовательность, и используя генную последовательность для рекомбинантной экспрессии антитела в клетках-хозяевах (например, клетках СНО). Другой способ, который можно использовать, представляет собой экспрессиюю последовательности антител у растений (например, табака) или трансгенного молока. Были раскрыты способы рекомбинантной экспрессии антител у растений или молока (см., например, Peeters, et al. Vaccine 19:2756 (2001); Lonberg, N.

and D. Huszar Int.Rev.Immunol 13:65 (1995); и Pollock, et al., J. Immunol Methods 231:147 (1999). Способы получения производных антител, например, гуманизированных, одиночноцепочечных и т.д., известны в данной области.



Pages:   || 2 |
Похожие работы:

«Цветные струйные плоттеры JV4 Руководство пользователя MIMAKI ENGINEERING CO., LTD. TKB Gotenyama Building, 5-9-41, Kitashinagawa, Shinagawa-ku, Tokyo 141-0001, Japan Телефон: +81-3-5420-8671 факс: +81-3-5420-8687 URL: http: // www.mimaki. co.jp / E-mail: traiding@mirnaki.co.jp D200571 Цветные струйные плоттеры JV4 Руководство пользователя ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ Компания MIMAKI ENGINEERING CO., LTD. не будет нести никакой ответственности за любой ущерб любого рода (включая упущенные выгоды, косвенный...»

«Главный каталоГ EquipmEnt protEction SolutionS ИзданИе 24 | Октябрь 2012 04 Climate control Главный каталог Содержание.. 0 Системы контроля микроклимата Шкафы...... 1 Корпуса настенные.... 2 19 вентилятор Нагнетательный вентиляторный блок Циркуляционный Принадлежности вентиляторный блок для шкафов и настенных Охлаждающая способность корпусов..... 3 до 2000 Вт Системы контроля микроклимата. Корпуса настольные.. Вентиляторы с фильтром Блочные каркасы/ Простой монтаж на...»

«RUDECO Vocational Training in Rural Development and Ecology Module № 6 Environmental Regulations and Laws for Rural Areas Responsible University Stavropol State Agrarian University 159357-TEMPUS-1-2009-1-DE-TEMPUS-JPHES This project has been funded with support from the European Commission. This publication reflects the views only of the authors, and the Commission cannot be held responsible for any use which may be made of the information contained therein. УДК 502.3 ББК 20.18 Э61 ISBN...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Амурский государственный университет Кафедра Дизайн УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДИСЦИПЛИНЫ ПРОИЗВОДСТВЕННАЯ ПРАКТИКА Основной образовательной программы Специальность 070601.65 Дизайн (специализация Дизайн костюма) Квалификация выпускника: дизайнер Благовещенск 2012 УМКД разработан доцентом кафедры Дизайн Санатовой Светланой Виленовной...»

«УДК 641/642 ББК 36.996 К83 Кротов, С. К83 Настойки, ликеры, водки. Лучшие рецепты / С. Кротов. — М. : РИПОЛ классик, 2008. —- 64 с. — (Вкусно и просто). ISBN 978-5-386-00559-7 Русь во все времена славилась своими алкогольными напитками, которые умного веселят, а при надобности и лечат, а дураков — тех до нитки раздевают по пословице пропойное рыло в конец разорило. Надеемся, что настойки, водки, ликеры, которые вы можете приготовить по рецептам из этой книги, станут украшением праздничного...»

«Ministry of Immigrant Absorption МИНИСТЕРСТВО АБСОРБЦИИ pусский Работа 11-е издание Внимание! С момента выпуска настоящей брошюры все предыдущие ее выпуски считаются недействительными. В конце этой брошюры опубликованы: • список других изданий русской редакции департамента информации и публикаций Министерства абсорбции • бланк обратной связи. Издано: Департамент информации и публикаций Министерство абсорбции ул. Гилель15, Иерусалим 94581 © Все права сохраняются Иерусалим 2013...»

«Annotation Сара Дженсен - городская ведьма Бак Лейк, штата Теннесси. Больше всего она скучает по своему старшему брату и его лучшему другу Риву, которые служат за границей в морской пехоте. Но когда ее брат погибает в бою, Рив возвращается домой, проклятый и обреченный каждое полнолуние обращаться в ненасытного волка. У Сары тоже есть своя тайна – она еще с детства по уши влюблена в этого мужчину. Когда же он приходит к ней домой в ночь Хэллоуина с просьбой о помощи, девушка случайно...»

«ЛІСІВНИЦТВО І АГРОЛІСОМЕЛІОРАЦІЯ Харків: УкрНДІЛГА, 2009. – Вип. 116 УДК 630.187 Е. С. МИГУНОВА * ТИП НАСАЖДЕНИЯ КАК ЛЕСОТИПОЛОГИЧЕСКИЙ ТАКСОН Украинский научно-исследовательский институт лесного хозяйства и агролесомелиорации им. Г. Н. Высоцкого Предлагается дополнить лесотипологическую классификацию таксоном тип насаждения, характеризующим растительную составляющую, фитоценоз типа леса: тип насаждения + тип местообитания тип леса. Обосновывается возможность и целесообразность объединения в...»

«СОДЕРЖАНИЕ НАЗНАЧЕНИЕ ИОНИЗАТОРА НЕВОТОН Два вида серебряной воды ИОНИЗАТОРА УСТРОЙСТВО КАК УСТРОЕН ИОНИЗАТОР НЕВОТОН Конструкция ионизатора НЕВОТОН Панель управления Подготовка к работе Подготовка ёмкости с водой ПРИГОТОВЛЕНИЕ СЕРЕБРЯНОЙ ВОДЫ СЕРЕБРЯНОЙ ВОДЫ Порядок работы ПРИГОТОВЛЕНИЕ Окончание работы Нештатные ситуации Время обработки воды УХОД ЗА ИОНИЗАТОРОМ Перед первым применением Регулярный уход ! Запрещается ЧТО ГОВОРИТ НАУКА И ПРАКТИКА И ПРАКТИКА Полезные свойства...»

«наше время – ПлюС! стр. Сегодня в номере 10 рекламно-информационное издание как бы к лету Жизнь в позитиве похудеть? Адрес приема рекламы и объявлений: ул. Ленина, 28 (гостиница), 2 этаж, офис 9, пн-чт с 11.00 до 18.00 Рекламный отдел: т. 8(913)-800-0471, e-mail: nv.plus.reklama@mail.ru афиша двух Редакция газеты: т. 77-44-07, 8-983-343-2569, городов e-mail: nv.plus@mail.ru № 22 (74) | 31.05.2013 Электронная версия газеты: nvp.ezar.ru стр. • фото недели • Письмена сквозь века Девочкаувас...»

«Тайны еврейских мудрецов ТОМ ТРЕТИЙ Издательский дом CN Столичные новости Киев 2004 Тайны еврейских мудрецов ББК ТАЙНЫ ЕВРЕЙСКИХ МУДРЕЦОВ Сборник издан по заказу Всеукраинского Еврейского Конгресса и Объединенной Еврейской общины Украины на средства Вадима РАБИНОВИЧА Книга подготовлена к печати Издательским домом CN Столичные новости (01023, Украина, Киев 23, ул. Мечникова, 14/1) Составитель — Вадим РАБИНОВИЧ Под общей литературной редакцией Владимира КАЦМАНА © CN Столичные новости, ISBN —2— Я...»

«ФГОС дошкольного образования Приказ Министерства образования и науки Российской Федерации (Минобрнауки России) от 17 октября 2013 г. N 1155 г. Москва Об утверждении федерального государственного образовательного стандарта дошкольного образования Федеральный государственный образовательный стандарт дошкольного образования Приказ Министерства образования и науки Российской Федерации (Минобрнауки России) от 17 октября 2013 г. N 1155 г. Москва Об утверждении федерального государственного...»

«2 Содержание № Название раздела Страница раздела Обозначения и сокращения 1 3 Вводная часть 2 4 Предмет учебной дисциплины 2.1 4 Цель и задачи освоения учебной дисциплины 2.2 4 Место учебной дисциплины в структуре ООП ВПО ИГМУ 2.3 4 Требования к результатам освоения дисциплины 2.4 Разделы дисциплины и компетенции, которые формируются при их 2.5 изучении Основная часть 3 Распределение трудоёмкости дисциплины 3.1 и видов учебной работы по семестрам Разделы дисциплины, виды учебной работы 3.2...»

«Инвестиционный бюллетень Узбекистан Ежедневный обзор 28 Января 2011 г. Международные рынки В этом выпуске ММВБ 27/01 1751.54 0.29% 2 Корпоративные новости РТС 27/01 1911.48 0.87% DJIA 27/01 11989.83 0.04% 2 НГМК в 2011-2020 годах реализует 35 проектов на $1,803 млрд. NASDAQ 27/01 2755.28 0.58% NIKKEI 28/01 10360.68 -1.13% 2 АГМК в 2011-2015 годах инвестирует $798 млн. в развития FTSE 27/01 5965.08 -0.07% производства S&P 500 27/01 1299.54 0.22% KASE 27/01 1803.65 0.48% 3 Отраслевые новости...»

«184/2010-93309(1) АРБИТРАЖНЫЙ СУД РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН Кремль, корп. 1 под. 2, г.Казань, Республика Татарстан, 420014 E- mail: info@tatarstan.arbitr.ru http://www.tatarstan.arbitr.ru тел. (843) 292-96-86, 292-07-57 Именем Российской Федерации РЕШ ЕН ИЕ г. Казань Дело № А65-38132/2009 СА1-42 Резолютивная часть решения объявлена 11 мая 2010. Полный текст решения изготовлен 18 мая 2010 года. Арбитражный суд Республики Татарстан в составе председательствующего судьи Сальмановой Р.Р., судей...»

«Челябинская городская Дума ОТЧЁТ о деятельности Челябинской городской Думы четвёртого созыва за 2012 год Челябинск, 2013 Уважаемые читатели! Перед вами Отчёт о работе Челябинской городской Думы четвёртого созыва за 2012 год. Подведение ежегодных итогов деятельности представительного органа власти это не просто процедура, предусмотренная требованиями законодательства. Это форма повышения результативности работы для городских депутатов, возможность оценить эффективность своей деятельности и...»

«Алгоритмы проверки соответствия космических снимков условиям съёмки Кузнецов А.В., Мясников В.В. АЛГОРИТМЫ ПРОВЕРКИ СООТВЕТСТВИЯ КОСМИЧЕСКИХ СНИМКОВ УСЛОВИЯМ СЪЁМКИ Кузнецов А.В., Мясников В.В. Институт систем обработки изображений РАН, Самарский государственный аэрокосмический университет имени академика С.П. Королёва (национальный исследовательский университет) Аннотация Настоящая работа посвящена решению задачи проверки данных дистанционного зондирования Земли, включающих цифровые оптические...»

«1 Государственное унитарное предприятие Республики Татарстан Головная территориальная проектно-изыскательская, научно-производственная фирма ТАТИНВЕСТГРАЖДАНПРОЕКТ Заказ 5506 Проект Схема территориального планирования Заинского муниципального района Положения ТОМ 1 ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА Генеральный директор Хуснутдинов А.А. Первый заместитель генерального Закиров Д.И. директора, главный инженер Главный архитектор фирмы Асадуллин И.Ш. Начальник АПМ-5 Романова И.Ю. Главный архитектор проекта...»

«Владимир Павлюшин Узоры пути Ульяновск 2012 ББК 00.00 У 00 Сайт http://znakisveta.ru Электронный адрес Владимира Алексеевича Павлюшина pvl24@yandex.ru Павлюшин Владимир У 00 Узоры пути. — Ульяновск. 2012. Сборники стихов Владимира Павлюшина: Серебряная Нить, Кедровый посох, Звездные крылья удачи, Одинокое дерево в Сердце Вселенной — издавались в Горно-Алтайске, Калининграде, Москве и Ульяновске, а также опубликованы в интернете на сайте Знаки Света. Владимир — прекрасный поэт. Пятый по счету...»

«УДК 616.3 ББК 54.13 КТК 352 Н 19 ВВЕДЕНИЕ Заболевания желудочно-кишечного тракта — наверное, самые распространенные болезни. Почти каждый Назина Ю. В. человек хотя бы однажды сталкивался с этой проблеН 19 Лечение болезней желудка и кишечника: зовем на мой. Так, хроническим гастритом страдает более полопомощь природу / Ю. В. Назина, И. А. Могилева, вины взрослого трудоспособного населения развитых В. Н. Шилов — Ростов н/Д.: Феникс, 2005. — стран. Причем с возрастом число людей, страдающих 320 с....»




 
© 2014 www.kniga.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Книги, пособия, учебники, издания, публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.