WWW.KNIGA.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Книги, пособия, учебники, издания, публикации

 

ПРАКТИЧЕСКОЕ

РУКОВОДСТВО

Руководство по диагностическому лабораторному обеспечению

трансплантации солидных органов

За основу данного руководства взят стандарт Национальной службы гистосовместимости

и иммуногенетики для трансплантации солидных органов (The National Histocompatibility

And Immunogenetics Service For Solid Organ Transplantation – NHISSOT)

– 8 издание, Beaumont Hospital, Дублин, Ирландия, 2011 (оригинал документа доступен на веб-сайте: www.beaumont.ie) Москва, 2013 Содержание ВВЕДЕНИЕ 3 1. АНТИГЕНЫ СИСТЕМЫ HLA

2. ОТТОРЖЕНИЕ ТРАНСПЛАНТАТА

3. ТРАНСПОРТИРОВКА ОБРАЗЦОВ В ЛАБОРАТОРИЮ

4. ВИДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

5. HLA-ТИПИРОВАНИЕ ПАЦИЕНТОВ ДЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ СОЛИДНОГО ОРГАНА

5.1 Серологическое HLA-типирование (по реакции комплемент-зависимой цитотоксичности) 5.2 Молекулярное HLA-типирование (по ДНК) 5.3 Современная HLA-номенклатура 6. ИССЛЕДОВАНИЯ НА HLA-АНТИТЕЛА 6.2 Анализ антител и их идентификация 6.3 Специфическая идентификация антител 6.4 Протоколы обследования реципиентов на HLA-антитела и перекрестную совместимость

7. ОБРАБОТКА ДАННЫХ ПО РЕЦИПИЕНТАМ ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ СОЛИДНЫХ ОРГАНОВ

7.2 Пациенты для трансплантации почки/поджелудочной железы 7.3 Кардиоторакальные пациенты 7.4 Пациенты для трансплантации печени

8. РАБОТА С ДАННЫМИ УМЕРШЕГО ДОНОРА И ФОРМИРОВАНИЕ СПИСКА ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ

РЕЦИПИЕНТОВ

9. ОБРАБОТКА ДАННЫХ ПО ЖИВЫМ ДОНОРАМ

10. ОЦЕНКА ПЕРЕКРЕСТНОЙ СОВМЕСТИМОСТИ ДЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ СОЛИДНОГО ОРГАНА

Стандартный тест перекрестной совместимости по комплементзависимой цитототоксичности (crossmatch) Оценка перекрестной совместимости с помощью проточной цитометрии 10.3 Оценка перекрестной совместимости с помощью Luminex 10.4 Интерпретация результатов пробы перекрестной совместимости (cross-match) 10.5 Аутосовместимость 10.6

11. ПОСТТРАНСПЛАНТАЦИОННЫЙ МОНИТОРИНГ

Пациенты после трансплантации почки/поджелудочной железы 11.2 Кардиоторакальные пациенты 11.3 Пациенты после трансплантации печени 11.4 12. БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ

ВВЕДЕНИЕ




Настоящее практическое руководство предназначено для лабораторий трансплантационной диагностики и иммуногенетики, осуществляющих HLA-типирование, скрининг антител к антигенам системы HLA, а также оценки перекрестной совместимости доноров и реципиентов при трансплантации солидных органов.

1. АНТИГЕНЫ СИСТЕМЫ HLA

HLA (Human Leukocyte Antigens) представляет собой систему антигенов на поверхности клеток человека, ответственных за распознавание «свое» и «чужое» в организме. Гены, кодирующие HLA, локализованы на коротком плече 6 хромосомы и подразделяются на отдельные локусы. Наиболее значимыми при иммунном ответе являются локусы HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP.

Антигены HLA-A, HLA-B и HLA-C (класс I) обнаруживаются на всех ядерных клетках организма, включая ткани почек, сердца, легких, печени, а также на поверхности тромбоцитов.

Антигены HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP (класс II) в норме присутствуют на антигенпрезентирующих клетках, таких как дендритные клетки, макрофаги, В-лимфоциты, а также активированные Т-лимфоциты и клетки эндотелия. Экспрессия молекул HLA класса II может быть индуцирована у клеток, которые в норме не экспрессируют эти молекулы (например, во время инфекций и эпизодов воспаления, в том числе при реперфузии органа).

Несоответствия между тканевым типом донора и тканевым типом реципиента – это важные стимулы, ведущие к тому, что иммунная система пациента распознает «чужую ткань» и отторгнет пересаженный орган. Хотя несоответствия по системе HLA провоцируют мощный иммунный ответ, существует ряд других антигенов, способных вызвать клинически значимую иммунную реакцию.

Одним из таких клинически значимых стимулов, не относящихся к системе HLA, является семейство антигенов MICA (MHC class I related chain A), которые экспрессируется на эпителиальных клетках в ответ на стресс. Специфические антитела в сыворотке пациентов, которым выполнили трансплантацию, распознают антиген MICA, а следовательно MICA может быть молекулой-мишенью в процессах отторжения. Эти антигены могут участвовать в отторжении аллотрансплантата, активируя антителозависимые и клеточные иммунные механизмы.

После переливания крови, беременности или неудавшейся трансплантации у пациентов могут вырабатываться антитела к антигенам системы HLA. Кроме того, на сегодняшний день признано, что у некоторых пациентов имеются «естественные» антитела к HLA, а также антитела к HLA, индуцированные инфекцией. Если пациенту пересадить орган, несущий антигены HLA, к которым у него имеются активные циркулирующие антитела, он может потерять орган в связи со сверхострым или острым отторжением. Эти антитела осложняют поиск подходящего органа для реципиента, поэтому одной из задач лабораторной службы является скрининг и идентификация предсуществующих антител.

Лаборатория проводит типирование тканей всех реципиентов и доноров, предоставляя информацию о степени соответствия между органами донора и организмом реципиента. Это позволяет гарантировать, что реципиент не получит орган, к которому у него выработались антитела.





2. ОТТОРЖЕНИЕ ТРАНСПЛАНТАТА

Отторжение трансплантата происходит в том случае, когда иммунная система реципиента атакует пересаженный орган. Это обусловлено тем, что иммунная система может распознать трансплантат в качестве чужеродного и пытается его уничтожить. Иммунный ответ во время отторжения опосредован Т-лимфоцитами и гуморальными иммунными механизмами (продукция антител). Существует четыре категории отторжения: сверхострое, острое гуморальное отторжение, острое клеточное отторжение и хроническая дисфункция трансплантата (или хроническая нефропатия трансплантата в случае трансплантации почки).

Хроническая дисфункция трансплантата может развиваться в результате иммунологических и неиммунологических воздействий на пересаженный орган.

Сверхострое отторжение – быстрый процесс, который развивается немедленно после трансплантации. Оно опосредовано уже сформированными антителами, которые реагируют со многими различными антигенами, экспрессируемыми на пересаженном органе. В результате сверхострого отторжения развивается быстрая деструкция пересаженного органа, при этом орган необходимо немедленно удалить, чтобы предотвратить тяжелый воспалительный ответ.

Острое гуморальное отторжение в типичных случаях развивается у сенсибилизированного пациента, начало процесса происходит обычно через несколько дней и до 4 недель после трансплантации. В некоторых случаях острое гуморальное отторжение может приводить к задержке функции трансплантата. Данный вид отторжения можно наблюдать у несенсибилизированных пациентов в результате продукции de novo специфичных к трансплантату антител уже после пересадки органа. В этом случае процесс обычно начинается позднее (3–6 недель), повышение уровня креатинина (если речь идет о трансплантации почки) происходит не так резко, как у сенсибилизированных пациентов.

Необходима ранняя диагностика, так как активное лечение с заменой плазмы для удаления донор-специфических антител позволяет спасти трансплантат более чем в 80% случаев, хотя долгосрочный исход для трансплантата обычно значительно ухудшается.

Острое клеточное отторжение может происходить практически в любое время, обычно от 1 недели до 6 месяцев после пересадки. После разработки мощных иммуносупрессорных препаратов встречаемость острого отторжения значительно снизилась.

Эта форма отторжения обычно легкообратима под действием больших доз кортикостероидов, хотя иногда устойчивое к стероидам отторжение требует более интенсивной иммуносупрессии.

Хроническая дисфункция аллотрансплантата может развиваться в период от 6 месяцев до многих лет после пересадки. В случае пересадки почки этот процесс характеризуется прогрессирующим ухудшением функции трансплантата, развитием протеинурии и специфическими гистологическими проявлениями. Последние данные показали, что продукция донор-специфических антител после трансплантации сопровождается более ранним началом хронической дисфункции трансплантата. Наблюдаемое отложение комплемента в таких трансплантатах свидетельствует об участии антител в повреждении трансплантата, по крайней мере, у большой части пациентов. К сожалению, в настоящее время нет эффективных методов лечения этой формы повреждения трансплантата, которая является наиболее частой причиной недостаточности трансплантата у пациентов, которым требуется повторная пересадка почки. Ключевую роль в развитии хронической дисфункции аллотрансплантата играет степень биологической совместимости донора и реципиента по HLA антигенам.

3. ТРАНСПОРТИРОВКА ОБРАЗЦОВ В ЛАБОРАТОРИЮ

Для транспортировки образцов в лабораторию рекомендуется соблюдать следующие требования:

- соответствие положению о больничной безопасности, правилам гигиены труда и технике безопасности;

- обеспечение защиты сотрудников курьерской службы и лабораторного персонала;

- обеспечение целостности подлежащего обработке образца.

Не следует отправлять образцы, внешняя поверхность которых загрязнена кровью или другими жидкостями тела, – необходимо провести забор другого образца.

Для генетического обследования реципиентов кровь берут из вены в вакутейнер с антикоагулянтом (например, ЭДТА) в количестве 5 мл. Не следует использовать в качестве антикоагулянта гепарин, так как он существенно подавляет ПЦР. Образец маркируют и сопровождают направлением на исследование, с указанием необходимой информации, например:

Клинического диагноза больного Образец крови для HLA-генотипирования может быть заморожен при –20 °С.

Для иммунологического обследования реципиента используется сыворотка, для получения которой необходимо взять кровь из вены в пробирку без антикоагулянта в количестве 6-8 мл (можно использовать пробирку с активатором свертываемости). После отделения сыворотки от сгустка и форменных элементов ее следует отобрать в чистую пробирку, промаркировать и сопроводить направлением на исследование, с указанием необходимой информации, например:

Клинического диагноза больного Дата последнего обследования на антитела Вид теста (скрининг HLA антител, идентификация, cross-match) Сыворотку можно хранить в холодильнике при 4 C в течение 2-4 дней, для более длительного хранения сыворотку замораживают при –20 С.

При формировании и обновлении «листа ожидания» образцы сыворотки крови предоставляются в лабораторию в плановом режиме (например в начале каждого месяца).

При подборе потенциального донора для проведения перекрестной пробы сross-match сыворотка реципиента исследуется непосредственно перед трансплантацией.

Для генетического обследования доноров необходимо взять кровь из вены в вакутейнер с антикоагулянтом (например, ЭДТА) в количестве 5 мл. Не следует использовать в качестве антикоагулянта гепарин, так как он существенно подавляет ПЦР.

Образец маркируют и сопровождают направлением на исследование, с указанием:

Фамилии, имени, отчества Даты и времени забора образца Образец крови для HLA-генотипирования может быть заморожен при –20 °С.

Для постановки прямой перекрестной пробы (cross-match) с клетками донора При трансплантации солидных органов (почек, поджелудочной железы, печени, сердца) необходимо предоставить в лабораторию образец венозной крови донора, взятой в вакутейнер с антикоагулянтом (ЭДТА, цитрат натрия, гепарин), в количестве 5-15 мл или фрагмент селезенки или лимфоузла. Образец для исследования маркируют с указанием:

Образцы крови НЕ ЗАМОРАЖИВАТЬ, хранить при температуре 4 – 8 C не более часов. При увеличении времени доставки образца в лабораторию (более 4-х часов) в кровь следует добавить физиологический раствор (0,9% NaCl) в соотношении 1:1 и транспортировать в специальных контейнерах с холодовыми элементами при температуре – 10 С.

4. ВИДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Виды исследований, проводимые лабораторией перед трансплантацией и в рамках посттрансплантационного мониторинга:

HLA-типирование доноров и реципиентов для трансплантации солидного органа Скрининг и идентификация HLA-антител:

- анализ на цитотоксические антитела - анализ на антитела с помощью технологии Luminex Оценка перекрестной совместимости для трансплантации солидного органа Посттрансплантационный мониторинг:

- определение донор-специфических антител - определение маркеров отторжения

5. HLA-ТИПИРОВАНИЕ ПАЦИЕНТОВ ДЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ

СОЛИДНОГО ОРГАНА

HLA-типирование – это метод определения антигенов (генов) тканевой совместимости пациента.

Всем потенциальным реципиентам в плановом порядке проводят HLA-типирование с помощью молекулярных методов низкого разрешения или серологического исследования на HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR и HLA-DQ. Однако при небольшом количестве реципиентов в «листе ожидания», типированием по локусам HLA-C и HLA-DQ пренебрегают. Для постановки этих методов используют коммерчески доступные наборы:

- для молекулярно-генетического SSP метода используются специфические праймеры;

- для молекулярно-генетического SSО метода – специфических зонды;

- для серологического метода – панели специфических сывороток.

5.1 Серологическое HLA-типирование (по реакции комплементзависимой цитотоксичности) Для серологического HLA-типирования лимфоциты пациента изолируют из цитратной крови с помощью иммуномагнитных микросфер или других принятых в лаборатории методик. Далее проводят «тканевое типирование» лимфоцитов с помощью коммерчески доступных планшетов для тканевого типирования.

Серологический метод имеет ряд ограничений:

Возможность проводить типирование только на низком разрешении Образцы крови должны быть только свежие и храниться не дольше 4-5 часов Невозможно анализировать образцы после заморозки Метод практически не пригоден для типирования по HLA классa II (DR, DQ) Невозможно проводить документирование и архивацию результатов типирования Проблемы воспроизводимости метода (результат зависит от навыков персонала, жизнеспособности клеток, активности комплемента, от использования моно- или полиспецифичных сывороток) Метод не подлежит автоматизации Сложность транспортировки и хранения серологических панелей (поставляются и хранятся только в замороженном виде при температуре минус 50–70 С) Ограниченная возможность для участия лаборатории в межлабораторном контроле качества, так как нет возможности типировать замороженные контрольные образцы 5.2 Молекулярное HLA-типирование (по ДНК) Разработка метода ПЦР (полимеразная цепная реакция) позволила проводить HLAтипирование с высоким разрешением. На первом этапе осуществляют выделение геномной ДНК пациентов из свежей или замороженной крови, взятой с антикоагулянтом (ЭДТА или цитрат натрия) в количестве от 0,5 до 5 мл в зависимости от протокола исследования, и затем проводят HLA-типирование, доступным лаборатории молекулярным методом:

1. ПЦР-SSP (sequence specific primers). Эти SSP-праймеры содержат аллель- и группоспецифичные HLA-последовательности, разработанные для прикрепления к специфическим участкам исследуемой ДНК. В случае совпадения нуклеотидной последовательностей праймера с ДНК пациента происходит их отжиг. В присутствии фермента Taq-полимеразы запускается амплификация (многократное увеличение количества копий ДНК). Амплифицированные продукты ДНК визуализируют с помощью гельэлектрофореза.

2. ПЦР-SSO (sequence specific oligonucleotides). Метод основан на использовании специфических олигонуклеотидных зондов. В случае использования SSO-технологии амплификации подвергается весь HLA локус. Полученные ампликоны денатурируют до одноцепочечных фрагментов ДНК, которые добавляют к микросферам или микрочипам, содержащим специфические SSO-зонды. Комплементарные последовательности ампликонов гибридизуются с соответствующими зондами. Комплекс ампликон-зонд затем визуализируют с помощью колориметрической реакции или флуоресценции.

5.3 Современная HLA-номенклатура Номенклатура HLA неоднократно претерпевала изменения и дополнения, что связано, во-первых, с переходом от серологического типирования поверхностных клеточных антигенов к молекулярным исследованиям полиморфных ДНК последовательностей (аллелей), во-вторых, открытия новых аллельных вариантов HLA-генов, установления полиморфизмов в экзонных и интронных областях генов HLA, различия в уровнях экспрессии HLA-антигенов повлекли за собой необходимость так или иначе отразить это в современной номенклатуре.

Современная HLA-номенклатура представлена на веб-ресурсе международной ассоциации иммуногенетиков (http://hla.alleles.org/nomenclature). Здесь можно найти информацию о количестве открытых аллелей каждого HLA-локуса, список всех HLA-генов с их молекулярной характеристикой, последние публикации в основных иммуногенетических изданиях (Human Immunology, Tissue Antigen, European Journal of Immunogenetics и др.).

Номенклатура Значение HLA HLA-A Конкретный локус HLA (например, HLA-A) HLA-A*02 Группа аллелей, кодирующая A2 антиген или последовательность гомологичную другому HLAA*02 аллелю HLA-A*02:101 Конкретная специфичность HLA-аллели, соответствующая определенной аминокислотной HLA-A*02:01:02 Показывает, что данная аллель имеет HLA-A*13:01:01:02 Показывает, что аллель имеет нуклеотидную HLA-A*24:09N Означает Нулевой аллель 'Null' allele, который не HLA-A*30:14L Обозначает аллель, кодирующий в значительной HLA- Обозначает аллель, кодирующий в значительной A*24:02:01:02L HLA- Аллель кодирует белок, который экспрессируется B*44:02:01:02S только как секреторная молекула HLA-A*32:11Q Известно, что белок экспрессируется, однако

6. ИССЛЕДОВАНИЯ НА HLA-АНТИТЕЛА

Все пациенты, которым планируется трансплантация солидного органа, проходят анализ на предсуществующие антитела к HLA с помощью различных скрининговых методик. Исключение для этого протокола составляют кардиоторакальные пациенты и пациенты, которые уже включены в список «листа ожидания».

6.2 Анализ антител и их идентификация Первичное обследование реципиентов на HLA-антитела включает в себя два этапа. На первом этапе, при помощи коммерчески доступных наборов в формате ИФА или Luminex выявляется наличие или отсутствие предсуществующих HLA-антител по классам I и II.

В случае положительного результата скрининга по одному или по обоим классам HLA-антител, проводится тест на их идентификацию. По результатам этого теста, для каждого положительного реципиента прописывается карта недопустимых донорских антигенов по локусам HLA-A, B, C (по классу I) и по локуса HLA-DR, DQ (по классу II), а также рассчитывается индекс PRA (%) (панель-реактивных антител в процентах).

Физический смысл индекса PRA (%) означает, какой процент потенциальных доноров будет иметь с данным реципиентом положительную реакцию в прямой перекрестной пробе (cross-match). Это позволяет прогнозировать вероятность и скорость подбора донора для каждого реципиента.

Индекс PRA (%), как правило, рассчитывается автоматически программным обеспечением, прилагаемым к коммерчески доступным наборам реагентов ИФА или Luminex. Расчёт PRA (%) базируется на том, к каким HLA-антигенам выработаны антитела у реципиента, и какова популяционная частота встречаемости каждого антигена.

При создании списка потенциальных реципиентов будет отклонен любой потенциальный реципиент, у которого имеются антитела к антигенам HLA пересаживаемого органа (совпадение с HLA-генотипом донора). Информационная карта профиля HLAантител реципиента минимизирует время холодовой ишемии, а также снижает вероятность разочарования пациента при вызове для трансплантации и последующем отклонении в связи с положительной пробой на перекрестную совместимость (cross-match).

6.3 Специфическая идентификация антител Тестирование на единичные антигены с помощью Luminex Этот метод применяют для мультисенсибилизированных реципиентов, у которых индекс PRA(%) больше или равен 60. В этом случае, важно выявить наиболее реактивные антитела, а также определить наличие возможных антигенов, к которым нет HLA-антител, с целью подбора соответствующих HLA-генотипов донора при трансплантации.

Метод единичных антигенов (Luminex Single Antigen) основан на использовании микросфер, покрытых очищенными рекомбинантными HLA-антигенами для определения антител. В одной суспензии для единичного теста можно комбинировать до 100 различных флуоресцентно-меченных микросфер (то есть до 100 различных HLA-антигенов по каждому классу).

Для устранения разночтений (если необходимо) можно использовать дополнительные методы, например твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) и скрининг методом комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC).

Комментарий:

Комплемент-зависимый скрининг (CDC) с помощью планшетов Терасаки выявляет только комплементфиксирующие антитела. Наличие этих антител приводит к сверхострому отторжению, если антитела направлены против донора. Однако в комплемент-зависимой цитотоксичности могут участвовать различные не-HLA специфичные антитела, приводя к ложноположительным результатам.

Методики ИФА и Luminex более чувствительны и позволяют выявить комплементсвязывающие и не связывающие комплемент HLA-антитела. В настоящее время точно установлено, что донор-специфические антитела, выявляемые этими методами, свидетельствуют о значительном риске острого гуморального отторжения, часто устойчивого к лечению.

6.4 Протоколы обследования реципиентов на HLA-антитела и перекрестную совместимость Протокол обследования на антитела к HLA для пациентов из списка ожидания на трансплантацию почки/поджелудочной железы Пациентам из «листа ожидания» на трансплантацию рекомендуется проводить обследование на антитела к HLA каждые 3 месяца.

Примечание. Пациентам листа ожидания, у которых ранее не было выявлено HLAантител, проводят общее скрининговое тестирование. Пациентам, у которых ранее были выявлены HLA-антитела I или II класса, проводят тест на идентификацию антител, с целью обновления информации в индивидуальной карте профиля антител реципиента.

Всем пациентам после переливания крови необходимо предоставить образец сыворотки пациента через 14 дней после гемотрансфузии или позднее, но в максимально короткие сроки.

Примечание: Плановый забор образцов каждые 3 месяца необходим для скрининга и оценки перекрестной совместимости у пациентов из списка ожидания.

Протокол обследования на антитела к HLA, необходимый для пациентов, не находящихся в списке ожидания на трансплантацию почки/поджелудочной железы У всех пациентов, не находящихся в списке ожидания, проводят забор одного образца ежегодно. Их рекомендовано сохранять неограниченное время на случай, если будет рассматриваться вопрос о трансплантации у этих пациентов.

Всем пациентам после переливания крови необходимо предоставить образец сыворотки через 14 дней после гемотрансфузии или позднее в кратчайшие сроки.

Протокол обследования на антитела к HLA для кардиоторакальных пациентов из списка ожидания на трансплантацию легкого или сердца Пациентам с положительным анализом на антитела к HLA рекомендован ежемесячный забор образца, а для пациентов, у которых не определялись антитела к HLA – забор образцов каждые 3 месяца.

Забор образцов после переливания крови у кардиоторакальных пациентов из списков ожидания Поскольку временные ограничения для кардиоторакальных трансплантатов часто исключают наличие одного дня для забора образца трансплантата, используется следующий план, гарантирующий доступность образца для оценки перекрестной совместимости в приемлемом временном промежутке.

Недели 1-4 после переливания крови образцы отправляются в лабораторию каждую неделю.

Недели 5-16 (4 месяца) после переливания крови образцы поступают для анализа каждые 2 недели.

Далее каждые 3 месяца у пациентов с отрицательным тестом на антитела или ежемесячно для пациентов с положительным тестом на антитела.

Кардиоторакальные пациенты со вспомогательным устройством для левого желудочка/обоих желудочков сердца или на «искусственном легком»

Образцы необходимо исследовать ежемесячно, если не указано иное.

7. ОБРАБОТКА ДАННЫХ ПО РЕЦИПИЕНТАМ ПРИ

ТРАНСПЛАНТАЦИИ СОЛИДНЫХ ОРГАНОВ

7.2 Пациенты для трансплантации почки/поджелудочной железы Пациента включают в список ожидания, если он соответствует следующим критериям:

- наличие всей соответствующей информации, включая сведения о беременности, переливании крови, предшествующих трансплантациях - проведено HLA-типирование - определена группа крови - проведено обследование на антитела к HLA с помощью методов Luminex или ИФА и заполнена карта профиля антител для всех соответствующих архивных и текущих образцов сыворотки 7.3 Кардиоторакальные пациенты Пациенту проводят HLA-типирование, а также анализ на HLA-антитела с помощью метода Luminex Single Antigen (идентификация с рекомбинантными антителами). Дается заключение о потребности пациента в дальнейшей оценке перекрестной совместимости, если он находится в списке ожидания.

В трансплантационную карту пациента вносят все его данные и значимую информацию, включая формы отчета о тканевом типировании, группе крови и результатах идентификации на антитела.

7.4 Пациенты для трансплантации печени Пациентам, ожидающим трансплантацию печени, проводят HLA-типирование по локусу B. После трансплантации у пациента выполняют полное HLA-типирование (по локусам HLA-A, -B, -DR), если донор полностью совпадает по В-локусу. Далее дают заключение о риске развития РТПХ (реакция «трансплантат против хозяина»), который зависит от степени совпадения по локусам.

8. РАБОТА С ДАННЫМИ УМЕРШЕГО ДОНОРА И

ФОРМИРОВАНИЕ СПИСКА ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ

РЕЦИПИЕНТОВ

После получения образцов крови потенциального донора лаборатория:

- проводит HLA-типирование потенциального донора с помощью молекулярных или серологических методов;

- направляет образец в отделение переливания крови для определения группы по системе AB0;

- формирует список потенциальных реципиентов в соответствии с согласованными критериями, включая пациентов, состояние которых требует неотложной пересадки, пациентов детского возраста, пациентов с приемлемой степенью несоответствия, значительно сенсибилизированных пациентов, пациентов с наилучшим соответствием по HLA, потенциально подходящих пациентов с редкими тканевыми типами (низкий уровень совпадения) и пациентов, ожидающих дольше всего.

- проводит обзор всех результатов анализа на антитела для каждого реципиента в списке потенциальных реципиентов.

- после того, как врач лаборатории удостоверился, что все потенциальные реципиенты в списке подходят, список направляют трансплантологу/лечащему врачу.

9. ОБРАБОТКА ДАННЫХ ПО ЖИВЫМ ДОНОРАМ

Число людей, страдающих конечной стадией почечной недостаточности, быстро растет, и трансплантация почки представляет собой наилучший вариант терапии для многих пациентов. Пересадка почки от живого донора – это оптимальная форма трансплантации.

Почка обычно начинает работать немедленно после операции и выживаемость трансплантата при пересадке почки от живого донора обычно выше, чем от мертвого донора. Поскольку у родственников обычно схожий генетический профиль, возрастают шансы реципиента получить хорошо подходящую почку. Это дает особые преимущества детям и пациентам, вырабатывающим антитела к HLA.

Критерии потенциального соответствия донора:

1) Совместимость по группе крови Совместимость групп крови донора и реципиента.

2) Совместимость тканевого типа (HLA-генотипа) Наилучшая совместимость между донором и реципиентом наблюдается при совпадении по всем шести аллелям (HLA-A, -B, -DR).

3) Скрининг на антитела Все потенциальные реципиенты органа от живого донора проходят обследование на HLA-антитела, так что любые неподходящие HLA-антигены потенциальной почки, выявленные у доноров, позволяют выполнить отсев на первом уровне обработки данных живого донора, если эти антитела несут риск для трансплантата.

4) Виртуальная перекрестная совместимость Оценка виртуальной перекрестной совместимости – метод, с помощью которого HLAгенотип потенциального донора по всем протипированным HLA-локусам сравнивают с соответствующим профилем антител к HLA у реципиента. Если у пациента нет каких-либо анти-HLA антител к HLA-генотипу потенциального донора, виртуальная перекрестная совместимость считается отрицательной и данные потенциального донора можно передавать для дальнейшей обработки. Если у пациента есть циркулирующие анти-HLA антитела к HLA-типу потенциального донора, то следующим этапом перед отчетом проводится оценка риска.

Оценку риска проводят для потенциальных живых доноров. Это подразумевает подробный анализ любой несовместимости по антителам между реципиентом и потенциальным донором с присвоением степени риска того, что трансплантат (в случае его пересадки) будет подвержен повреждению в результате воздействия иммунной системы.

Комбинация донор/реципиент, у которой нет несовместимости по антителам, получает степень «стандартный риск», а все случаи несовместимости по антителам потенциальных трансплантатов расценивают относительно этой степени.

6) Вирусологическая оценка С целью гарантировать отсутствие у потенциального донора каких-либо вирусов, способных повредить реципиенту, проводится вирусологический скрининг на ранней стадии процесса обработки данных.

Кровь потенциального донора подвергают скринингу на наличие антител к вирусам гепатита B, C и ВИЧ. Если выявлен какой-либо из этих вирусов, то это является противопоказанием для проведения трансплантации.

10. ОЦЕНКА ПЕРЕКРЕСТНОЙ СОВМЕСТИМОСТИ ДЛЯ

ТРАНСПЛАНТАЦИИ СОЛИДНОГО ОРГАНА

Цель оценки перекрестной совместимости — выявить все антитела реципиента, способные атаковать HLA-антигены потенциального донора. Для этих анализов используют лимфоциты, полученные из периферической крови или лимфоузлов/селезенки донора.

Тесты перекрестной совместимости обычно проводят перед трансплантацией с целью гарантировать отсутствие антительной сенсибилизации реципиента к донору. Образцы сыворотки потенциального реципиента, включая последний образец сыворотки и несколько «архивных» образцов (обычно с повышенным количеством реактивных антител [PRA]) могут быть протестированы против лимфоцитов донора. Поскольку существует множество методов, которые можно использовать, и каждый обладает уникальным клиническим назначением, мы даем описательную интерпретацию этих тестов.

комплементзависимой цитототоксичности (cross-match) Этот стандартный тест перекрестной совместимости основан на комплементопосредованной цитотоксичности. Оценка базовой перекрестной совместимости проводится с помощью препарата смеси лимфоцитов, полученных из периферической крови, селезенки или лимфатических узлов донора. Кроме того, проводится оценка перекрестной совместимости с помощью В- и Т-клеток донора с целью выявить антитела класса I и/или II реципиента к антигенам донора. В этой пробе проводят инкубацию сыворотки пациента с клетками донора, а затем добавляют комплемент. Если в сыворотке пациента содержится антитела, направленные против HLA-антигенов донора, то это вызовет лизис клеток, свидетельствуя о положительном результате пробы на перекрестную совместимость (положительный cross-match). Если антитела к антигенам донора отсутствуют, клетки остаются интактными, и проба на перекрестную совместимость отрицательна (отрицательный cross-match).

10.3 Оценка перекрестной совместимости с помощью проточной Анализ перекрестной совместимости с помощью проточной цитометрии – это более чувствительный метод по сравнению с цитотоксическими тестами перекрестной совместимости. Он позволяет определить специфичные антитела IgG к HLA класса I и/или II донора. Он также выявляет не связывающие комплемент антитела, которые могут остаться незамеченными при цитотоксической пробе перекрестной совместимости, а также антитела в крайне низком титре. При проведении этой пробы сыворотку пациента инкубируют с лимфоцитами донора. Затем клетки окрашивают флуоресцентными красителями, которые выявляют человеческие антитела IgG на Т- и В-клетках. Далее клетки анализируют на проточном цитометре на наличие антител к HLA-антигенам донора.

Оценка перекрестной совместимости с помощью проточной цитометрии плохо стандартизирована между разными лабораториями, поэтому интерпретировать полученные данные надо с осторожностью.

10.4 Оценка перекрестной совместимости с помощью Luminex Анализ перекрестной совместимости с помощью технологии Luminex – наиболее точный и чувствительный метод, позволяющий определять специфичные антитела IgG к HLA класса I и II донора непосредственно до трансплантации, а также проводить мониторинг антидонорских антител с замороженным лизатом донорских клеток в посттрансплантационный период. Также как и при цитометрическом определении, Luminex выявляет комплемент-фиксирующие и не фиксирующие комплемент антитела.

На первом этапе суммарные лимфоциты донора выделяют из образцов периферической крови стандартным методом с использованием градиента плотности (фиколла-верографина или лимфолита).

Полученные клетки лизируют, и затем полученный лизат, содержащий донорские HLA-антигены, инкубируют с микросферами, предварительно конъюгированными с антителами к HLA класса I или II. При добавлении сыворотки реципиента, находящиеся в ней антитела связываются с соответствующими антигенами донора (которые в свою очередь находятся в комплексе с микросферами). Добавление флуоресцентно-меченного конъюгата к анти-IgG позволяет визуализировать результат.

Данный тест способен не только зафиксировать положительную реакцию перекрестной пробы «cross-match» по I или II классу, но и отслеживать титр накопления антидонорских антител в посттрансплантационном периоде, что важно для прогноза риска отторжения трансплантата.

совместимости (cross-match) Трансплантация органа пациенту с циркулирующими комплементсвязывающими антителами к HLA-антигенам донора приведет к сверхострому отторжению и немедленной потере органа. Трансплантация пациенту, у которого имеются специфичные не связывающие комплемент антитела, сопровождается острым гуморальным отторжением и высоким риском потери трансплантата. Оценка перекрестной совместимости перед трансплантацией выявляет любые антитела к антигенам донора и предотвращает сверхострое отторжение, а также в значительной степени снижает вероятность острого гуморального отторжения.

Антигены, выявляемые на различных типах лимфоцитов:

- на Т-клетках – антигены HLA класса I, аутоантигены и различные Т-клеточные маркеры;

- на В-клетках – антигены HLA класса I и антигены HLA класса II, аутоантигены и различные маркеры В-клеток.

Таким образом, антитела к HLA класса I должны быть положительны к Т- и Вклеткам, а антитела к HLA класса II должны быть положительны только к B-клеткам. Вклетки также положительны по антигенам HLA класса I и в действительности экспрессируют антигены класса I более интенсивно, чем Т-клетки. Следовательно, они более чувствительны, чем Т-клетки, при определении антител к HLA класса I с меньшей концентрацией. Это может осложнить интерпретацию положительных проб на перекрестную совместимость с Вклетками.

При определении перекрестной совместимости используют текущие и архивные сыворотки по следующим причинам:

- исторические антитела важны, так как свидетельствуют о сенсибилизации пациента к антигенам донора и, следовательно, о наличии Т- и В-клеток памяти, которые могут привести к быстрому иммунологическому ответу при повторном воздействии на пациента того же антигена;

- текущие антитела важны по той причине, что если они направлены против антигенов HLA донора, присутствующих в трансплантате, они могут вызывать сверхострое отторжение органа или острое гуморальное отторжение.

При положительной пробе перекрестной совместимости иммунологконсультант/главный медицинский научный сотрудник может сказать, что с иммунологической точки зрения целесообразно продолжить подготовку к трансплантации, приняв во внимание анамнез сенсибилизации и профиль скрининга на антитела пациента, и/или может запросить дополнительные подтверждающие тесты/тесты перекрестной совместимости перед использованием трансплантата.

В некоторых случаях, особенно при кардиоторакальной трансплантации, после обсуждения с хирургом имеет смысл провести трансплантацию при пограничном или слабоположительном результате пробы перекрестной совместимости при условии использования методов удаления антител или других форм усиленной иммуносупрессии.

10.6 Аутосовместимость Эта проба оценивает перекрестную совместимость лимфоцитов реципиента с аутологичной (собственной) сывороткой и проводится с целью идентификации любых аутореактивных антител, которые могут развиваться в результате аутоиммунного расстройства, например при СКВ, заболеваниях соединительной ткани, вирусной инфекции и/или воздействии определенных препаратов.

Существует много вариантов проведения теста на аутосовместимость, который позволяет выявить природу антител. Информация о наличии и типе аутоантител может быть крайне полезна при интерпретации положительного теста на перекрестную совместимость и гарантирует, что пациенты не пропустят потенциально подходящие органы в результате ложноположительной пробы на перекрестную совместимость.

11. ПОСТТРАНСПЛАНТАЦИОННЫЙ МОНИТОРИНГ

11.2 Пациенты после трансплантации почки/поджелудочной железы Образцы сыворотки для мониторинга антидонорских антител направляются в лабораторию:

- еженедельно в течение четырех недель после трансплантации у всех пациентов - дважды в неделю у пациентов с высокой степенью сенсибилизации - далее ежемесячно в течение 3 месяцев после трансплантации - затем ежеквартально в течение 1 года - далее ежегодно Выбор метода исследования антидонорских антител после трансплантации:

В случае если до трансплантации лабораторией были получены клетки донора в количестве достаточном для приготовления лимфоцитарного лизата для последующего мониторинга, то рекомендована постановка прямой перекрестной пробы сыворотки реципиента с лизатом донорских лимфоцитов по технологии Luminex при помощи тест системы LIFECODES DSA.

При появлении антидонорских антител тест будет положителен по I или II классу HLA, а интенсивность флуоресценции будет нарастать при увеличении их титра.

При отсутствии архивированных лизатов донорских клеток проводят тест на идентификацию антител I и II класса методом Luminex или ИФА. Обнаруженные антитела сравнивают с данными индивидуальной карты профиля HLA-антител до трансплантации. В случае появления в профиле антител специфичностей донорского HLA-генотипа и нарастании их титра немедленно сообщают об этом врачу-иммунологу.

11.3 Кардиоторакальные пациенты Образец сыворотки берут каждый раз при проведении биопсии (как при биопсии согласно протоколу, так и при биопсии с целью оценить возможное отторжение). Далее желательно получать образец сыворотки при обычном поступлении пациента в клинику (каждые несколько месяцев в течение первого года и ежегодно в будущем).

Исследование на антитела проводится на всех посттрансплантационных сыворотках, полученных через 1 месяц, и максимально близко к сроку 3 месяца или при известных эпизодах отторжения.

Иммунолога-консультанта немедленно уведомляют о появлении любых новых положительных результатов или усилении положительной реакции и направляют кардиоторакальному хирургу отчет о посттрансплантационных антителах.

11.4 Пациенты после трансплантации печени Если лейкоциты из донорской печени реагируют с тканями реципиента, они могут разрушать эти ткани. Этот феномен известен как реакция «трансплантат против хозяина»

(РТПХ) и может нести существенные риски для пациентов после трансплантации печени.

Доноры, гомозиготные по всем локусам HLA, несут больший риск развития реакции РТПХ.

Диагностике пациентов с подозрением на реакцию ТПХ может помочь обнаружение значительного химеризма лимфоцитов донора, хотя это не всегда возможно, особенно при хорошей совместимости донора и реципиента. HLA-типирование с помощью ПЦР-SSP по периферической крови реципиента может выявить антигены HLA донора. В случае подозрения на РТПХ следует немедленно связаться с иммунологом-консультантом.

12.БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ

A Guide to the Services provided by the Department of Histocompatibility and Immunogenetics (The National Histocompatibility And Immunogenetics Service For Solid Organ Transplantation (NHISSOT), 8th Edition – November 2011.

119991 Москва, Ленинские горы, 1-11, МГУ им. Ломоносова

Похожие работы:

«ЗАКОНОДАТЕЛЬСТВО 15 ЗАКОН БРЯНСКОЙ ОБЛАСТИ О ПОРЯДКЕ ПРОВЕДЕНИЯ ПУБЛИЧНЫХ МЕРОПРИЯТИЙ НА ОБЪЕКТАХ ТРАНСПОРТНОЙ ИНФРАСТРУКТУРЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ ТРАНСПОРТА ОБЩЕГО ПОЛЬЗОВАНИЯ, НА ТЕРРИТОРИИ БРЯНСКОЙ ОБЛАСТИ ПРИНЯТ БРЯНСКОЙ ОБЛАСТНОЙ ДУМОЙ 24 ФЕВРАЛЯ 2011 ГОДА С т а т ь я 1. Предмет регулирования и сфера действия настоящего Закона 1. Настоящим Законом в соответствии с частью 31 статьи 8 Федерального закона от 19 июня 2004 года № 54 ФЗ О собраниях, митингах, демонстрациях, шествиях и...»

«ПЕРЕВОЗКА ГРУЗОВ МОРЕМ СПРАВОЧНОЕ ПОСОБИЕ Издание второе, переработанное и дополненное Перевозка грузов морем оглавление ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК ИЛЛЮСТРАЦИЙ СПИСОК ТАБЛИЦ ОБЯЗАННОСТИ ПЕРЕВОЗЧИКА И ГЛАВА 1 ГРУЗООТПРАВИТЕЛЯ ПО ОБЕСПЕЧЕНИЮ СОХРАННОСТИ ГРУЗА 1.1 ДОГОВОР МОРСКОЙ ПЕРЕВОЗКИ И ОБЩИЙ ПОРЯДОК ПРИЕМА И СДАЧИ ГРУЗА 1.2 ГРУЗОВЫЕ ДОКУМЕНТЫ И ОСОБЕННОСТИ ПРИЕМАСДАЧИ ГРУЗА В ЗАГРАНИЧНОМ ПЛАВАНИИ. 19 1.3 ГРУЗОВЫЕ ДОКУМЕНТЫ И ОСОБЕННОСТИ ПРИЕМАСДАЧИ ГРУЗА В КАБОТАЖНОМ ПЛАВАНИИ 1.4 НЕКОТОРЫЕ...»

«СЫКТЫВКАРСКИЙ ЛЕСНОЙ ИНСТИТУТ _ КАФЕДРА МАШИНЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ЛЕСНОГО КОМПЛЕКСА ЛЕСОТРАНСПОРТНЫЕ МАШИНЫ Сборник описаний лабораторных работ для подготовки дипломированных специалистов по направлению 656300 Технология лесозаготовительных и деревообрабатывающих производств специальности 250401 Лесоинженерное дело СЫКТЫВКАР 2007 ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ СЫКТЫВКАРСКИЙ ЛЕСНОЙ ИНСТИТУТ – ФИЛИАЛ ГОУ ВПО САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ЛЕСОТЕХНИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ ИМЕНИ С. М. КИРОВА КАФЕДРА...»

«МИНИСТЕРСТВО ТРАНСПОРТА РОССИИ ДЕПАРТАМЕНТ ВОЗДУШНОГО ТРАНСПОРТА РУКОВОДСТВО ПО ЭКСПЛУАТАЦИИ САМОЛЕТА АН-24 (АН-24РВ) В настоящее Руководство по летной эксплуатации самолета Ан-24 (Ан-24РВ) внесены изменения № 1-33, 35. Все термины и единицы измерения приведены в соответствии с действующими ГОСТами. Ввести в действие Руководитель ДЛС ГС ГА МТ РФ Таршин Ю.П. 03 октября 2000г. Изменение № 6 К РЛЭ самолета АН-24 (издания 1995г.) Изменение № 6 К РЛЭ самолета АН-24 (издания 1995г.) С вводом в...»

«ДОПОЛНЕНИЕ к письму государствам ЕС 2/10-09/49 Препроводительная записка ДОПОЛНЕНИЕ К DOC 8632 ПОЛИТИКА ИКАО ПО ВОПРОСУ НАЛОГООБЛОЖЕНИЯ В ОБЛАСТИ МЕЖДУНАРОДНОГО ВОЗДУШНОГО ТРАНСПОРТА (Издание четвертое – 2009) 1. Прилагаемое Дополнение заменяет все предыдущие дополнения к документу Doc 8632 и включает полученную от Договаривающихся государств информацию об их позиции в отношении резолюции Совета по вопросу налогообложения в области международного воздушного транспорта по состоянию на 29 мая...»

«207 Вестник ТГАСУ № 3, 2012 ПРОЕКТИРОВАНИЕ И СТРОИТЕЛЬСТВО ДОРОГ, МЕТРОПОЛИТЕНОВ, АЭРОДРОМОВ, МОСТОВ И ТРАНСПОРТНЫХ ТОННЕЛЕЙ УДК 691.168-678.049.2 КИСЕЛЁВ ВЛАДИМИР ПЕТРОВИЧ, докт. техн. наук, доцент, wkiselev001@yandex.ru ЕФРЕМОВ АЛЕКСАНДР АЛЕКСЕЕВИЧ, докт. хим. наук, профессор, aefremov@sfu-kras.ru КЕМЕНЕВ НИКОЛАЙ ВИКТОРОВИЧ, аспирант, ida7037@yandex.ru БУГАЕНКО МАКСИМ БОРИСОВИЧ, ст. преподаватель, popowa223@yandex.ru Сибирский федеральный университет, 660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 79...»

«№ 8/20515 06.04.2009 -147ПОСТАНОВЛЕНИЕ МИНИСТЕРСТВА ТРАНСПОРТА И КОММУНИКАЦИЙ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ 21 января 2009 г. № 9 8/20515 Об утверждении Авиационных правил Процедуры сертификации 8/20515 планеров, дельтапланов, парапланов, легких и сверхлегких летательных аппаратов, аэростатических аппаратов и воздушных судов любительской конструкции В соответствии со статьей 28 Воздушного кодекса Республики Беларусь, на основании Положения о Министерстве транспорта и коммуникаций Республики Беларусь,...»

«15/1/13 Препроводительная записка ДОПОЛНЕНИЕ К DOC 8632 ПОЛИТИКА ИКАО ПО ВОПРОСУ НАЛОГООБЛОЖЕНИЯ В ОБЛАСТИ МЕЖДУНАРОДНОГО ВОЗДУШНОГО ТРАНСПОРТА (Издание третье – 2000) 1. Прилагаемое Дополнение заменяет все предыдущие дополнения к документу Doc 8632 и включает полученную от Договаривающихся государств информацию об их позиции в отношении резолюции Совета по вопросу налогообложения в области международного воздушного транспорта по состоянию на 15 января 2013 года. 2. Дополнительная информация,...»

«ИМИТАЦИОННОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ТРАНСПОРТНЫХ ПОТОКОВ НА КОЛЬЦЕВЫХ ПЕРЕСЕЧЕНИЯХ АВТОМОБИЛЬНЫХ ДОРОГ Ефремов А. Ю., Кузнецов К.Ю., Легович Ю.С. Институт проблем управления им. В.А. Трапезникова РАН, г. Москва andre@ipu.ru, kuznecovk@ggk.mos.ru, legov@ipu.ru Ключевые слова: транспортные потоки, модель, перекрестки, уровень облуживания. Быстрый рост количества автомобилей приводит к увеличению интенсивности движения в городах, следствие которого проявляется в обострении транспортных проблем, особенно...»

«WOODSTOCK 121099 г. Москва Карманицкий переулок, д. 2/5, 44 тел/факс: +7 (495) 241 43 58 e-mail: info@homeland-group.ru www.homeland-group.ru ZARECHIE ШОССЕЙНАЯ_90 _ЮЗАО_МОСКВА ЧАСТЬ_2. Архитектурная концепция WOODSTOCK ZARECHIE ШОССЕЙНАЯ_90 _ЮЗАО_МОСКВА 121099 г. Москва Карманицкий переулок, д. 2/5, тел/факс: +7 (495) 241 e-mail: info@homeland-group.ru www.homeland-group.ru WOODSTOCK 121099 г. Москва Карманицкий переулок, д. 2/5, тел/факс: +7 (495) 241 e-mail: info@homeland-group.ru...»

«1 Министерство Защиты Окружающей Среды Израиля Центр Экологических Систем и Технологий (ЭКОСТ) АВТОТРАНСПОРТ И ЭКОЛОГИЯ ГОРОДОВ ИЗРАИЛЯ Пособие для русскоязычных репатриантов При финансовой поддержке Министерства Защиты окружающей среды При поддержке: * Министерства Абсорбции Израиля * Муниципалитета Иерусалима * Управления Абсорбции Муниципалитета Иерусалима * Иерусалимского Общинного Дома Иерусалим, 2012 2 Авторский коллектив: Д-р. Валерий Анфимов- Введение, главы 1-7, 8,10,12-15. M.Sc. Елена...»





Загрузка...



 
© 2014 www.kniga.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Книги, пособия, учебники, издания, публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.